張心怡,邱雨軒,胡楊,田榮,趙勉,嚴(yán)輝,王嚇長(zhǎng),胡立宏

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥功效物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

中藥辛夷為臨床常用藥材,《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定辛夷為木蘭科植物玉蘭Magnoliadenudata、望春玉蘭Magnoliabiondii或武當(dāng)玉蘭Magnoliasprengeri的干燥花蕾[1]。其味辛性溫,歸屬于肺、胃經(jīng),具有發(fā)散風(fēng)寒,通鼻竅的功效,主產(chǎn)于河南、四川、陜西、湖北等地[2],是兼藥用及觀賞價(jià)值的植物。化學(xué)研究表明,辛夷中有效成分主要包括金合歡醇、松油醇、樟腦等揮發(fā)油物質(zhì)[3],具有抗炎[4]、抗氧化、抗菌等活性[5],還能夠調(diào)節(jié)中樞系統(tǒng),有助于提高記憶、提神醒腦[6]。但近年來(lái)辛夷藥材存在混偽品較多、用藥混亂、質(zhì)量把控不過關(guān)等諸多問題,如采集樣品中?；煊凶嫌裉m、黃山木蘭、二喬玉蘭等近緣種藥材,因它們的花被形狀、大小以及數(shù)量較為相似,加大了鑒別難度[7]。此外,在生產(chǎn)實(shí)踐中玉蘭優(yōu)良無(wú)性系常以嫁接方式進(jìn)行擴(kuò)大繁殖[8],不同來(lái)源的嫁接苗質(zhì)量和成活率明顯不同。因此,需要建立一種快速、簡(jiǎn)便、有效的方法鑒別辛夷藥材,以確定其用藥品種,保障臨床用藥安全。

DNA條形碼技術(shù)是通過一段標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段對(duì)物種進(jìn)行識(shí)別和鑒定的技術(shù),該方法快速準(zhǔn)確、易于操作,是對(duì)傳統(tǒng)中藥鑒定方法的補(bǔ)充[9]。常見的鑒定植物的DNA條形碼有ITS、ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL等序列。目前辛夷的DNA條形碼僅有ITS序列的報(bào)道[10],本課題組前期多次對(duì)ITS序列擴(kuò)增和測(cè)序,但PCR擴(kuò)增成功率極低,故本研究采用ITS、ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL五種DNA條形碼序列對(duì)中藥辛夷及其近緣種進(jìn)行分子鑒定,以期為辛夷藥材的分子鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 植物樣品

本研究于2022年8—10月分別于江蘇南京、江蘇宜興、河南南陽(yáng)、云南昆明等地采集玉蘭植物樣本,由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院嚴(yán)輝教授鑒定。提取采集到的21份玉蘭植物樣本DNA,并從Genbank網(wǎng)站下載玉蘭和武當(dāng)玉蘭條形碼序列,共計(jì)9個(gè)品種30份代表樣本。樣品信息詳見表1。

表1 樣品信息表

1.2 試劑與儀器

DNA提取試劑盒(X0422,北京天根生化科技有限公司)、β-巰基乙醇(M8210,北京索萊寶科技有限公司)、DL2 000 DNA marker試劑(SD0531,TaKaRa公司)、氯仿(20220311,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、瓊脂糖Agarose(IA0629,上海生工生物試劑公司)、Gelred核酸染料(A616694-0500,上海生工生物試劑公司)、50×TAE緩沖液(B548101-0500,上海生工生物試劑公司)。

數(shù)顯恒溫水浴鍋(KQ-500DF,昆山市超聲儀器有限公司)、核酸電泳儀(HE-120,上海天能科技有限公司)、凝膠成像儀(5200multi,上海天能科技有限公司)、高速離心機(jī)(5430R,Eppendorf公司)、NanoDrop One[ND-ONE-W(A30221),Thermo公司]、高壓滅菌鍋[GR60DA,致微(廈門)儀器有限公司]、PCR擴(kuò)增儀(Biometra TOne 96G,Analytik jena公司)、微波爐(M1-211A,廣東美的廚房電器制造有限公司)。

2 方法

2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

取液氮冷凍保存的玉蘭品種葉片30 mg、根皮50 mg,研碎后用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA,NanoDrop One檢測(cè)DNA濃度和純度。提取的DNA的A260 nm/A280 nm值確保控制在1.8～1.9之間(A表示吸光度)。選用通用引物及標(biāo)準(zhǔn)流程擴(kuò)增各樣品ITS、ITS2、psbA-trnH、matK及rbcL條形碼片段。PCR反應(yīng)體系為50 μL,包括2×Taq PCR Mix 25 μL,正向、反向引物各2 μL,200～400 ng的模板DNA,加ddH2O補(bǔ)足至50 μL,擴(kuò)增條件詳見表2。擴(kuò)增結(jié)束后以1%凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像分析系統(tǒng)分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后,送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表2 DNA條形碼PCR反應(yīng)正反引物序列及擴(kuò)增程序

2.2 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序結(jié)果采用Codon Code Aligner V10.02(CodonCode公司,美國(guó))進(jìn)行正反拼接,參考序列峰圖去掉低質(zhì)量部分,得到完整的基因序列,并于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì),保證樣本鑒定成功率。從GenBank下載相似度高的相應(yīng)種屬序列,將所有候選序列導(dǎo)入MEGA7.0進(jìn)行比對(duì)分析,計(jì)算序列比對(duì)長(zhǎng)度、變異位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)等,并基于Kimura-2-Parameter(K2P)模型計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離并建立鄰接(NJ)聚類進(jìn)化樹,分析堿基之間的差異。聚類分析檢測(cè)采用Bootstrap方法,重復(fù)1 000次(表3)。

表3 從GenBank獲取的辛夷及其近緣種psbA-trnH、matK和rbcL條形碼序列

3 結(jié)果

3.1 PCR擴(kuò)增、測(cè)序結(jié)果分析

為了進(jìn)一步比較各DNA條形碼序列的PCR擴(kuò)增效果及變異程度,對(duì)5種條形碼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測(cè)序,得到相應(yīng)的擴(kuò)增、測(cè)序成功率和序列信息。如表4所示,psbA-trnH,matK擴(kuò)增較為成功,擴(kuò)增成功率均大于98%,擴(kuò)增結(jié)果詳見圖1～2。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),膠圖呈現(xiàn)單一明亮條帶且無(wú)拖尾現(xiàn)象,該結(jié)果提示該序列擴(kuò)增效果良好。rbcL擴(kuò)增成功率較低,為38.1%,且擴(kuò)增條帶不清晰;ITS、ITS2序列PCR擴(kuò)增成功率極低,為0和28.5%,樣品擴(kuò)增后呈現(xiàn)條帶極少。

注:Marker是比對(duì)的目標(biāo)條帶,比對(duì)長(zhǎng)度為500 bp;1～3.廣玉蘭;4～6.望春玉蘭;7～9.山玉蘭;10～12.含笑;13～15.深山含笑;16～18.紫玉蘭;19～21.二喬玉蘭

注:Marker是比對(duì)的目標(biāo)條帶,比對(duì)長(zhǎng)度為750～1 000 bp;1～3.廣玉蘭;4～6.望春玉蘭;7～9.山玉蘭;10～12.含笑;13～15.深山含笑;16～18.紫玉蘭;19～21.二喬玉蘭

表4 中藥辛夷及其近緣種的序列特征

3.2 序列特征分析

研究共獲得psbA-trnH序列40條,matK序列40條,rbcL26條,其中包括Genbank下載的psbA-trnH序列19條,matK序列19條,rbcL序列18條。比對(duì)后的序列長(zhǎng)度均小于1 000 bp,長(zhǎng)度matK>rbcL>psbA-trnH,符合DNA條形碼長(zhǎng)度的要求。其中matK序列長(zhǎng)度最長(zhǎng),為728 bp,變異位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)最多,說明matK變異程度最大,rbcL序列變異位點(diǎn)數(shù)少于matK。psbA-trnH序列變異位點(diǎn)數(shù)最少,可見psbA-trnH序列變異程度最低,此序列變異相對(duì)穩(wěn)定,變異位點(diǎn)數(shù)占總位點(diǎn)數(shù)的12.3%。

3.3 DNA條形碼Barcoding gap分析

利用MEGA7.0軟件計(jì)算psbA-trnH、matK、rbcL序列的種內(nèi)種間距離,并基于K2P遺傳距離模型計(jì)算樣品間的種間、種內(nèi)遺傳距離。理想的DNA條形碼應(yīng)符合種內(nèi)遺傳距離明顯小于種間遺傳距離,兩者之間存在明顯的界限,即“Barcoding gap”[11]。本文選擇的psbA-trnH、matK、rbcL片段皆是進(jìn)化速率較快的葉綠體間隔區(qū)[12],結(jié)果顯示,psbA-trnH序列的種間平均距離為0.152,種內(nèi)平均遺傳距離為0.012;matK序列的種間平均距離為0.449,種內(nèi)平均距離為0.021;rbcL的種間平均距離為0.538,rbcL種內(nèi)平均距離為0.025(表4)。其中,psbA-trnH序列的種內(nèi)種間距離重疊較少,Barcoding gap較matK更明顯;rbcL序列種內(nèi)種間遺傳距離重疊多,Barcoding gap不明顯,同時(shí)其序列擴(kuò)增及測(cè)序成功率低,鑒定效果并不理想(圖3)。因此,選擇psbA-trnH和matK作為鑒別辛夷及其近緣種的候選序列,開展進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

圖3 psbA-trnH、matK、rbcL的遺傳距離分布

3.4 辛夷及其近緣種序列psbA-trnH及matK二級(jí)結(jié)構(gòu)

將psbA-trnH及matK堿基序列導(dǎo)入RNA fold預(yù)測(cè)辛夷及其近緣種的二級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖4～5所示,各品種的psbA-trnH序列二級(jí)結(jié)構(gòu)為1個(gè)主環(huán)、左右兩側(cè)各分布3個(gè)螺旋區(qū),每個(gè)螺旋區(qū)上莖環(huán)的數(shù)量(即主環(huán)左、右側(cè)螺旋區(qū)莖環(huán)數(shù)分別計(jì)數(shù))、大小和開合角度均有差異。莖環(huán)數(shù)量如表5所示,莖環(huán)數(shù)紫玉蘭最多,左側(cè)為13,右側(cè)為12;山玉蘭最少,左側(cè)為9,右側(cè)為11。莖環(huán)從大到小排列為廣玉蘭>武當(dāng)玉蘭>含笑>紫玉蘭>二喬玉蘭>玉蘭>望春玉蘭>山玉蘭>深山含笑。螺旋區(qū)開合角度深山含笑最大,含笑最小。matK序列二級(jí)結(jié)構(gòu)均由2個(gè)主環(huán)、左側(cè)主環(huán)4個(gè)螺旋區(qū),右側(cè)主環(huán)5個(gè)螺旋區(qū)組成。莖環(huán)數(shù)最多的是二喬玉蘭,左側(cè)為17,右側(cè)為25;廣玉蘭最少,左側(cè)為15,右側(cè)為19。莖環(huán)從大到小排列為玉蘭>含笑>深山含笑>二喬玉蘭>望春玉蘭>武當(dāng)玉蘭>紫玉蘭>廣玉蘭>山玉蘭。紫玉蘭螺旋區(qū)開合角度略大,其余類似。結(jié)合psbA-trnH及matK兩種序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn),不同物種螺旋區(qū)分支的莖環(huán)數(shù)量、大小、螺旋區(qū)的開合角度均有差別,故psbA-trnH和matK兩種序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的建立可用于區(qū)分辛夷藥材及其近緣種。

圖4 辛夷及其近緣種psbA-trnH序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖5 辛夷及其近緣種matK序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

表5 psbA-trnH和matK序列螺旋區(qū)莖環(huán)數(shù)量

3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為了能夠更直觀清晰地反映出鑒定結(jié)果,我們利用MEGA7軟件對(duì)psbA-trnH和matK兩種條形碼序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖6所示,利用psbA-trnH和matK條形碼獨(dú)立建樹,發(fā)現(xiàn)能將辛夷與其近緣種聚為不同分支。結(jié)果表明,psbA-trnH建立的系統(tǒng)發(fā)育樹能夠在9個(gè)物種中準(zhǔn)確區(qū)分6個(gè)品種,辛夷藥材的3個(gè)品種各自均能聚為一支,呈明顯的單系性,且近緣種各自聚為不同分支,與辛夷藥材明顯區(qū)分開,但未能鑒別含笑、山玉蘭、二喬玉蘭這3個(gè)近緣種。matK建立的系統(tǒng)發(fā)育樹能準(zhǔn)確區(qū)分5個(gè)品種,均為辛夷近緣種,各自聚為一支,與其他品種區(qū)分開,但玉蘭和武當(dāng)玉蘭混為一支,未能區(qū)分開?？梢?psbA-trnH和matK兩種單獨(dú)的DNA片段并不能將9種植物全部鑒定出來(lái),只能鑒別出部分植物。于是,我們將psbA-trnH和matK兩種序列聯(lián)合建樹分析。如圖6所示,基于psbA-trnH+matK基因組序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹能夠準(zhǔn)確區(qū)分鑒定9種植物,辛夷藥材與近緣種各自聚為不同分支,有明顯區(qū)分。故利用psbA-trnH+matK在鑒定準(zhǔn)確性、覆蓋物種數(shù)更為優(yōu)異,鑒別辛夷及其近緣種效果更好。

圖6 基于psbA-trnH、matK、psbA-trnH+matK序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.6 基于psbA-trnH+matK組合條形碼鑒定玉蘭嫁接品種

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,課題組選用psbA-trnH+matK組合條形碼聯(lián)合分析,對(duì)玉蘭嫁接品種的砧木根皮部位進(jìn)行分子鑒定,驗(yàn)證DNA條形碼技術(shù)對(duì)于嫁接品種的鑒定可行性。如表6所示,通過psbA-trnH+matK組合條形碼鑒定,顯示采集批次中廣玉蘭、紫玉蘭及二喬玉蘭的砧木根段為望春玉蘭嫁接。此方法提高了玉蘭植物品種的鑒定效率,也為嫁接品種的鑒定提供了新思路。

表6 psbA-trnH+matK序列聯(lián)合鑒定玉蘭嫁接品種

4 討論

中藥辛夷以望春玉蘭、玉蘭、武當(dāng)玉蘭的花蕾入藥,然而國(guó)內(nèi)玉蘭品種繁多,花蕾形狀相似,難以從外觀上準(zhǔn)確鑒定,進(jìn)而影響辛夷藥材的鑒別。因此,本實(shí)驗(yàn)選用5種條形碼(ITS、ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL)進(jìn)行鑒定辛夷及其近緣種最佳DNA條形碼的篩選研究。結(jié)果顯示,psbA-trnH和matK條形碼序列PCR擴(kuò)增、測(cè)序成功率均大于98%,而rbcL擴(kuò)增及測(cè)序成功率較低,ITS、ITS2并不理想,故不宜用來(lái)作為辛夷的種間鑒定?？紤]可能由于植物細(xì)胞內(nèi)不同核糖體的進(jìn)化水平存在差異,擴(kuò)增產(chǎn)物可能被細(xì)菌、真菌等微生物的核糖體污染等[13],進(jìn)而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。而葉綠體在結(jié)構(gòu)、序列上相對(duì)保守[14],進(jìn)化水平較為一致且擴(kuò)增產(chǎn)物不受微生物影響。

隨后根據(jù)K2P遺傳距離、種內(nèi)種間變異分析,辛夷及近緣種的種內(nèi)遺傳較為穩(wěn)定,種間變異程度較大,且psbA-trnH、matK和rbcL三條序列種間種內(nèi)距離均有一定的重疊,psbA-trnH種內(nèi)種間距離重疊較少,Barcoding gap較matK明顯。隨著生物信息學(xué)的不斷發(fā)展,遺傳物質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究不斷增多,因其比一級(jí)結(jié)構(gòu)在生物進(jìn)化過程中序列更具有保守性,可作為系統(tǒng)發(fā)育分析的參考,逐漸成為研究熱點(diǎn)[15-16]。尤其適用對(duì)原植物及其近似種之間二級(jí)結(jié)構(gòu)形態(tài)上的差異進(jìn)行種間鑒別,為科學(xué)分類提供參考[17]。結(jié)合二級(jí)結(jié)構(gòu)的形態(tài)差異,選擇psbA-trnH和matK作為鑒別辛夷及其近緣種的候選序列,實(shí)現(xiàn)了物種間的有效區(qū)分。

陳士林及其團(tuán)隊(duì)在藥用植物及中藥材研究中提出了以ITS為主,rbcL為輔的組合條形碼鑒定物種的DNA條形碼分子鑒定體系[18]。張明英等[19]提出通過多序列聯(lián)合分析能夠在一定程度上提高物種鑒定成功率,鑒別效果顯著。本實(shí)驗(yàn)中,NJ聚類樹顯示,基于psbA-trnH序列建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹能夠準(zhǔn)確區(qū)分6個(gè)品種,包括辛夷藥材的3個(gè)品種,而matK變異位點(diǎn)最多,變異程度大,進(jìn)化樹能夠準(zhǔn)確區(qū)分5個(gè)品種,但不能區(qū)分玉蘭和武當(dāng)玉蘭。在進(jìn)一步探究組合條形碼的鑒定潛能時(shí),發(fā)現(xiàn)psbA-trnH+matK基因組序列聯(lián)合分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹能夠準(zhǔn)確鑒定9個(gè)品種,與單一條形碼比較,無(wú)論物種鑒定成功率亦或是系統(tǒng)發(fā)育分析聚類中都有更為突出的指征。

最后,作為我國(guó)常見的綠化觀賞樹種,在生產(chǎn)實(shí)踐中玉蘭優(yōu)良無(wú)性系常以嫁接方式進(jìn)行擴(kuò)大繁殖。研究表明,不同屬的木蘭科植物間具有廣泛的嫁接親和力[8,20],嫁接的砧木通常分為同屬砧木和異屬砧木2類。同屬砧木如紫玉蘭[21]、望春玉蘭[22-23]等,植株生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)、抗病蟲害能力強(qiáng)于普通植株[24],且嫁接成活率較高。異屬砧木通常指山玉蘭[25]、黃蘭含笑[26]等,不同的砧穗組合使得異屬砧木的嫁接成活率存在較大差異,而近年來(lái)隨著市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大,玉蘭苗木開始出現(xiàn)供應(yīng)短缺的問題。因此快速鑒別玉蘭砧木品種,保證較高的嫁接成活率、育苗速度和質(zhì)量,具有解決生產(chǎn)問題的實(shí)際意義。利用psbA-trnH+matK基因組序列首次對(duì)玉蘭嫁接品種的根皮進(jìn)行分子鑒定,顯示采集批次中廣玉蘭、紫玉蘭和二喬玉蘭的砧木根段為望春玉蘭嫁接。

綜上所述,推薦使用psbA-trnH+matK組合條形碼作為鑒定辛夷及其近緣種的首選序列。該組合條形碼能提供更多遺傳信息以準(zhǔn)確鑒定辛夷藥材,為辛夷藥材的品種鑒定和分類提供分子生物學(xué)依據(jù)。