李夢婷,鄭慧麗,朱梓強,徐盼,郭盛,錢大瑋,朱悅,段金廒

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程中心,江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室,江蘇 南京 210023)

統(tǒng)計顯示,2020年世界65歲及以上老齡人口數(shù)量已占到總?cè)丝诹康?.40%;而據(jù)我國第七次全國人口普查數(shù)據(jù)顯示,60歲和65歲以上人口占總?cè)丝诘谋壤逊謩e達到18.70%和13.50%[1-2]。老齡化社會已經(jīng)到來,因此,衰老的醫(yī)學(xué)生物學(xué)機制以及抗衰老產(chǎn)品開發(fā)也成為了研究熱點。

女性衰老問題一直廣受關(guān)注,然而男性衰老問題鮮有研究。隨著中老年男子部分雄激素缺乏綜合征(Partial androgen deficiency of the aging male,PADAM)這一概念的提出,中老年男性健康所受關(guān)注度逐年上升。PADAM俗稱男性更年期綜合征,是指男性從中年過渡到老年階段時,由于下丘腦-垂體-睪丸軸功能逐步減退導(dǎo)致血清睪酮的水平下降,引起的一系列臨床綜合征,包括內(nèi)分泌紊亂、骨質(zhì)疏松、心悸失眠、肌力下降、情志抑郁、記憶力衰退、性功能降低等。中老年人群中PADAM患病率約為40%,嚴(yán)重影響身體健康與生活質(zhì)量[3-4]。

研究顯示,雄激素水平的下降與雄激素對受體的敏感性降低是發(fā)生PADAM的直接因素,其病理機制與氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的睪丸功能細(xì)胞凋亡高度相關(guān)[5-7]。針對PADAM的治療,國際公認(rèn)的方法是睪酮替代療法(TNT),即補充外源性雄性激素,如十一酸睪酮,以顯著改善相關(guān)癥狀。但此類藥物會增加心血管疾病、前列腺癌、睡眠呼吸暫停、紅細(xì)胞增多等風(fēng)險,致使其在臨床應(yīng)用中受到一定限制[8]。因此,尋找更為安全有效的藥物迫在眉睫。

中醫(yī)學(xué)并無對應(yīng)PADAM的確切診斷病名,臨床多將其歸屬于“虛勞”“陽痿”“臟燥”“郁證”“心悸”“不寐”等病證中,總體認(rèn)為腎精虧虛,腎氣衰竭,精血不足以致陰陽失調(diào)為其基本病機[9]。五子衍宗丸出自明代張時徹《攝生眾妙方》,方中菟絲子、枸杞子、覆盆子、五味子均可入腎,補腎陽,益腎精;車前子清熱利水可防諸藥之溫?zé)嶙棠?。諸藥合用生精強腎,固本攝精,多用于男子不育、腎虛腰痛。而本研究復(fù)方——杞蠣還少方則在五子衍宗丸的基礎(chǔ)上,結(jié)合PADAM的現(xiàn)代研究認(rèn)識化裁衍生所得,全方由枸杞子、牡蠣肉、菟絲子、益智仁、五味子、桑椹、三七、肉蓯蓉、油菜花粉組成,其中各藥味使用劑量以《中華人民共和國藥典》2020版的用法用量為依據(jù),并參考文獻中各藥味具有改善氧化損傷功效的最低有效劑量制定,具有補腎益精,溫腎助陽的功能。本研究通過小鼠腹腔注射D-gal建立亞急性衰老動物模型,評價杞蠣還少方對模型小鼠性激素紊亂與睪丸組織氧化損傷的改善作用,并探索其作用機制,為臨床應(yīng)用與藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物

健康雄性SPF級ICR小鼠,105只,體質(zhì)量20～25 g,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,動物許可證號為:SCXK(滬)2022-0005,動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF環(huán)境中,常規(guī)飼養(yǎng),溫度22～25 ℃,濕度40%～70%。本實驗獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會的批準(zhǔn),倫理號為202203A011。

1.2 藥材

枸杞子(批號:2109099)為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實,購自寧夏明德中藥飲片有限公司;菟絲子(批號:250200608)為旋花科植物菟絲子CuscutachinensisLam.的干燥成熟種子,益智仁(批號:45200618)為姜科植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.的干燥成熟種子,桑椹(批號10504001)為?？浦参锷orusalbaL.的干燥果穗,五味子(批號:38211022)為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實,三七(批號11220828)為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根莖,肉蓯蓉(批號:260200601)為列當(dāng)科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖,均購自蘇州市天靈中藥飲片有限公司;牡蠣肉(生產(chǎn)編號:SC122450502CC626)為牡蠣科動物近江牡蠣OstrearivularisGould 的肉,購自北海開宇網(wǎng)絡(luò)科技有限公司;油菜花粉(生產(chǎn)編號:SC12641108201156)為十字花科植物油菜BrassicaCampestisLinn.的花粉,購自長葛市立新蜂業(yè)有限公司。以上經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為合格藥材。

1.3 儀器

ZNHW數(shù)顯電熱套(上海力辰邦西儀器科技有限公司);Buchi R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司);DZ 30-32高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);全自動樣品快速研磨儀(上海凈業(yè)信發(fā)展有限公司);ST60-4微孔板恒溫振蕩器(杭州米歐儀器有限公司);EnSpire多功能酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer公司);ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);Axio Vert.A1熒光倒置顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.4 試劑

D-半乳糖(D-gal,N13GS167640)購自上海源葉生物科技有限公司;維生素E(111Q031)購自北京索萊寶科技有限公司;金匱腎氣丸(21030042)購自北京同仁堂;10%、12.5%PAGE凝膠快速制備試劑盒(03659300)購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(1221200210506)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白酶抑制劑Cocktail(HY-K0010)購自南京普諾恩生物技術(shù)有限公司;小鼠超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(20220609)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒(20220609)、丙二醛(MDA)試劑盒(20220609)均購自南京建成生物公司研究所;小鼠促性腺激素釋放激素(GnRH)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(AF2506-A)、小鼠睪酮(T)ELISA試劑盒(AF2569-A)、小鼠雌二醇(E2)ELISA試劑盒(AF2566-A)、小鼠促卵泡激素(FSH)ELISA試劑盒(AF2555-A)、小鼠黃體生成素(LH)ELISA試劑盒(AF2582-A)購自湖南艾方生物科技有限公司;SuperKineTM增強型抗體稀釋液(ATVE07011)購自南京迅貝生物科技有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光液購自上海天能科技有限公司;NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2) Rabbit antibody(1696-1-AP)、血紅素氧合酶-1(HO-1) Rabbit antibody(10701-1-lg)、Caspase-3 Rabbit antibody(66470-2-lg)、β-actin Mouse antibody(66009-1-lg)購自Proteintech公司;Cleaved-Caspase-3 Rabbit mAb(7237S)、Cleaved-Caspase-9 Rabbit antibody(9664S)、Caspase-9 Mouse mAb(9508S)購自CST公司;B細(xì)胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)(G2915)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)(F2816)抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司;二抗HRP-Linked Anti-Mouse IgG(BA1050)、HRP-Linked Anti-Rabbit IgG(BA1054)購自BOSTER公司;TUNEL試劑盒(7E58I1)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 杞蠣還少方提取物的制備

稱取枸杞子6 g,菟絲子5 g,益智仁1.8 g,五味子1.5 g,桑椹5 g,三七3 g,肉蓯蓉4 g,牡蠣肉3 g,油菜花粉1 g加8倍量純水回流提取1.5 h,3次。合并3次提取液,減壓濃縮至濃縮液濃度為1 g·mL-1(按生藥量折算)。

2.2 動物模型建立及給藥

SPF級ICR健康小鼠105只,適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后稱質(zhì)量,按體質(zhì)量進行隨機分組,每組15只,共7組,分別是空白組(CON)、模型組(MOD)、維生素E組(VE)、金匱腎氣丸組(JGSQW)、杞蠣還少方低劑量組(QL-L)、杞蠣還少方中劑量組(QL-M)、杞蠣還少方高劑量組(QL-H)。除空白組外,各組每日腹腔注射600 mg·kg-1的D-gal溶液,連續(xù)8周,注射體積為0.01 mL·g-1,空白組每日腹腔注射相同體積的生理鹽水。杞蠣還少方提取液用生理鹽水分別配制成濃度為0.25、0.5、1 g·mL-1的溶液,金匱腎氣丸研磨后加入生理鹽水配制成濃度為0.2 g·mL-1的混懸液。造模第11天起,除空白組和模型組外,其余各組每日同時以相應(yīng)的給藥量(表1)進行灌胃給藥,給藥體積均為0.01 mL·g-1;空白組與模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。8周后異氟烷麻醉后眼眶取血、摘取睪丸組織,左側(cè)睪丸放入4%多聚甲醛中固定,右側(cè)睪丸放入液氮速凍,后保存于-80 ℃冰箱中待測。

表1 動物分組與給藥劑量

2.3 睪丸組織病理形態(tài)觀察

取固定的睪丸組織,依次進行脫水、石蠟包埋、切片、染色、封片等步驟,完成操作后將切片放置于光學(xué)顯微鏡下拍照,觀察其病理學(xué)特征。

2.4 性激素水平測定

小鼠眼眶取血后4 ℃條件下,2 797×g離心10 min,取上清(血清)按照ELISA試劑盒所列步驟,測定小鼠血清中T、E2、LH、FSH、GnRH水平。

2.5 氧化應(yīng)激因子MDA、SOD、GSH測定

小鼠眼眶取血后4 ℃條件下,2 797×g離心10 min,取血清待測。稱取一定量的睪丸組織,加入9倍量生理鹽水,60 Hz,90 s的條件下通過全自動組織研磨儀制備得組織勻漿,然后4 ℃條件下,2 797×g離心10 min,取上清待測。按試劑盒說明書測定血清與睪丸中SOD活力和GSH、MDA含量。

2.6 TUNEL染色觀察睪丸組織凋亡

取睪丸組織石蠟切片進行脫蠟處理,脫蠟結(jié)束后按照TUNEL試劑盒說明書上的步驟依次進行操作,封片后于熒光顯微鏡下觀察、拍照,每張切片隨機選取5個視野,計算陽性細(xì)胞(亮綠色)占總細(xì)胞數(shù)的比值即為凋亡率。

2.7 Western blot檢測Nrf2、HO-1及凋亡蛋白表達

稱取各組動物睪丸組織,記錄質(zhì)量,加入9倍量的RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑Cocktail(100∶1),組織勻漿后置于冰上裂解30 min,低溫離心10 min后取上清。按照BCA試劑盒的操作步驟測定總蛋白含量,濃度拉平后98 ℃加熱15 min,使蛋白變性。用10%、12.5%的PAGE凝膠快速制備試劑盒制備凝膠,120 V電泳2 h,Nrf2的轉(zhuǎn)膜時間為120 min,β-actin、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、Caspase-3、Caspase-9、HO-1、Bcl-2、Bax的轉(zhuǎn)膜時間為60 min,5%脫脂奶粉封閉2 h。結(jié)束后加入一抗(Nrf2 Rabbit antibody、HO-1 Rabbit antibody、Bcl-2 antibody、Bax antibody稀釋比例均為1∶3 000;Cleaved-Caspase-3 Rabbit mAb、Cleaved-Caspase-9 Rabbit antibody、Caspase-3 Rabbit mAb、Caspase-9 Mouse mAb稀釋比例均為1∶2 000;β-actin Mouse antibody稀釋比例為1∶100 000),4 ℃搖床過夜,孵育二抗(HRP-Linked Anti-Mouse IgG、HRP-Linked Anti-Rabbit IgG稀釋比例為1∶10 000),室溫孵育1 h,洗膜后使用凝膠成像儀顯色曝光。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 杞蠣還少方對D-gal致衰老模型小鼠睪丸組織形態(tài)的影響

結(jié)果如圖1所示。空白組小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)正常,生精上皮完整,基膜內(nèi)可見排列整齊的各級生精細(xì)胞和支持細(xì)胞,睪丸間質(zhì)細(xì)胞成群分布。模型組小鼠睪丸組織中生精小管萎縮,生精上皮變薄,生精細(xì)胞排列疏松紊亂,睪丸間質(zhì)細(xì)胞間隙擴大,數(shù)量減少。杞蠣還少方各劑量組小鼠與模型組小鼠相比,生精上皮變厚,生精細(xì)胞層數(shù)增多,生精小管界膜完整,睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多,作用趨勢與維生素E與金匱腎氣丸組類似,提示杞蠣還少方對衰老模型小鼠睪丸組織損傷具有顯著保護作用。

注:A.空白組;B.模型組;C.杞蠣還少方低劑量組;D.杞蠣還少方中劑量組;E.杞蠣還少方高劑量組;F.維生素E組;G.金匱腎氣丸組

3.2 杞蠣還少方對D-gal致衰老模型小鼠血清性激素水平的影響

ELISA法檢測小鼠血清中性激素的表達水平,結(jié)果顯示,模型組小鼠血清中T、E2、GnRH的含量與空白組小鼠相比顯著下降(P<0.05,P<0.01),LH、FSH顯著升高(P<0.01);中、高劑量杞蠣還少方提取物可顯著上調(diào)模型小鼠血清中的T、E2與GnRH的表達(P<0.05,P<0.01),降低LH、FSH的表達水平(P<0.01)(圖2)。各劑量組間未見顯著性差異,其作用趨勢與維生素E、金匱腎氣丸組類似,提示杞蠣還少方可以顯著改善亞急性衰老小鼠性激素的表達。

注:CON.空白組;MOD.模型組;QL-L.杞蠣還少方低劑量組;QL-M.杞蠣還少方中劑量組;QL-H.杞蠣還少方高劑量組;VE.維生素E組;JGSQW.金匱腎氣丸組;與空白組比較,

3.3 杞蠣還少方對D-gal致衰老模型小鼠血清與睪丸組織氧化應(yīng)激因子的影響

結(jié)果顯示,模型組小鼠血清及睪丸組織中MDA表達與空白組小鼠相比顯著升高(P<0.01),SOD活力與GSH表達顯著下降(P<0.01);杞蠣還少方各劑量組均可提高模型小鼠血清及睪丸組織中的SOD活力及GSH表達(P<0.05,P<0.01),降低MDA表達(P<0.01)(圖3)。其中杞蠣還少方中劑量組作用趨勢優(yōu)于高、低劑量組,優(yōu)于金匱腎氣丸組,提示杞蠣還少方提取物可有效減輕小鼠睪丸組織與全身的氧化損傷。

3.4 杞蠣還少方對D-gal致衰老模型小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果如圖4所示。模型組小鼠睪丸組織與空白組相比凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增多(P<0.01)。杞蠣還少方各劑量組顯著抑制睪丸組織中細(xì)胞凋亡(P<0.01),且其作用趨勢與維生素E、金匱腎氣丸組類似。提示杞蠣還少方可抑制衰老模型小鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡。

注:CON.空白組;MOD.模型組;QL-L.杞蠣還少方低劑量組;QL-M.杞蠣還少方中劑量組;QL-H.杞蠣還少方高劑量組;VE.維生素E組;JGSQW.金匱腎氣丸組;與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01。

3.5 杞蠣還少方對D-gal致衰老模型小鼠睪丸組織凋亡蛋白表達水平的影響

以Western blot法測定各組小鼠睪丸組織凋亡相關(guān)蛋白表達發(fā)現(xiàn),模型組小鼠睪丸組織Bcl-2/Bax蛋白表達水平與空白組小鼠相比顯著降低(P<0.01),Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Cleaved-Caspase-9/Caspase-9表達水平明顯升高(P<0.05,P<0.01)。杞蠣還少方中、高劑量組顯著逆轉(zhuǎn)模型小鼠睪丸組織中Bcl-2/Bax蛋白的表達水平(P<0.05,P<0.01),并降低Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Cleaved-Caspase-9/Caspase-9的表達水平(P<0.01)(圖5)。結(jié)果提示,杞蠣還少方提取物可抑制小鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡,中劑量組具有較強的作用趨勢。

注:CON.空白組;MOD.模型組;QL-L.杞蠣還少方低劑量組;QL-M.杞蠣還少方中劑量組;QL-H.杞蠣還少方高劑量組;VE.維生素E組;JGSQW.金匱腎氣丸組;與空白組比較,

3.6 杞蠣還少方對D-gal致衰老模型小鼠睪丸組織Nrf2與HO-1表達水平的影響

采用Western blot檢測小鼠睪丸組織的Nrf2與HO-1蛋白表達水平,結(jié)果如圖6所示。模型組小鼠睪丸組織Nrf2和HO-1蛋白表達水平與空白組小鼠相比顯著降低(P<0.05,P<0.01);低、中劑量杞蠣還少方可顯著提升小鼠睪丸組織的Nrf2與HO-1蛋白表達水平(P<0.05,P<0.01),中劑量組具有較強作用趨勢。提示杞蠣還少方可通過調(diào)控Nrf2/HO-1通路保護睪丸細(xì)胞免受氧化損傷。

注:CON.空白組;MOD.模型組;QL-L.杞蠣還少方低劑量組;QL-M.杞蠣還少方中劑量組;QL-H.杞蠣還少方高劑量組;VE.維生素E組;JGSQW.金匱腎氣丸組;與空白組比較,

4 討論

PADAM是男性向老年期過渡過程中所出現(xiàn)的一系列癥候群,主要包括性功能障礙、情志不暢、骨質(zhì)疏松、潮熱陣汗等[10]。目前關(guān)于PADAM的臨床治療大多采用睪酮補充療法。然而睪酮的合成與分泌受機體下丘腦-垂體-睪丸軸的調(diào)控,外源性補充睪酮可能會導(dǎo)致睪丸軸的平衡被打破,且此類藥物具有增加心血管疾病發(fā)生率、導(dǎo)致前列腺增生甚至癌變等副作用,限制了臨床使用[8]。

研究認(rèn)為雄激素水平低下與雄激素受體的敏感性下降是誘發(fā)PADAM癥狀的基礎(chǔ)因素[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn),PADAM患者明顯存在睪丸功能衰退的現(xiàn)象,睪丸作為雄激素合成與分泌的場所,由于衰老導(dǎo)致血管硬化、管壁增厚、供血不足等因素使得睪丸組織產(chǎn)生退行性變化,嚴(yán)重影響睪酮的產(chǎn)生,造成機體代謝紊亂、激素失衡等一系列生理病理變化[11]。此外,臨床還發(fā)現(xiàn)PADAM患者血清抗氧化酶SOD及非酶類抗氧化物GSH等合成減少,而過氧化物明顯升高[12]。過量的ROS抑制Nrf2/HO-1通路引發(fā)睪丸氧化損傷[13-15]。過量的ROS亦會抑制抗凋亡因子Bcl-2表達,并刺激促凋亡因子Bax以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達,誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞凋亡[16-17]。由此可知,衰老導(dǎo)致的機體氧自由基堆積引起的睪丸細(xì)胞凋亡是PADAM的重要病理機制。本實驗采用D-gal造成小鼠機體高氧化態(tài),發(fā)現(xiàn)模型小鼠睪丸組織出現(xiàn)了生精細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少等退行性變化及血清中T水平明顯下降,LH、FSH水平顯著升高等與PADAM相似的病理特征。在分子水平上亦觀察到睪丸細(xì)胞出現(xiàn)過度氧化應(yīng)激的現(xiàn)象,包括睪丸組織中脂質(zhì)過氧化物MDA含量的顯著升高,抗氧化酶SOD活力與抗氧化物GSH水平的降低,Nrf2/HO-1通路作為機體內(nèi)最重要的抗氧化系統(tǒng)之一,其蛋白表達水平亦呈下調(diào)趨勢,同時伴隨抗凋亡因子Bcl-2水平降低與促凋亡因子Bax、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Cleaved-Caspase-9/Caspase-9蛋白表達的升高。本研究發(fā)現(xiàn),杞蠣還少方對上述各病理環(huán)節(jié)均有顯著改善作用,能夠通過提高亞急性衰老小鼠睪丸組織的抗氧化能力調(diào)控性激素的表達水平,延緩PADAM的發(fā)生與發(fā)展。

《素問·上古天真論》云“丈夫…五八腎氣衰,發(fā)墮齒槁。六八陽氣衰竭于上,面焦,發(fā)鬢斑白。七八肝氣衰,筋不能動。八八天癸竭,精少,腎臟衰,形體皆極,則齒發(fā)去”[18],形象而又高度概括指出腎精枯竭是導(dǎo)致男性衰老的根本原因?！胺蚓?身之本也”,腎精作為機體生命活動的本源,其盛衰關(guān)系到人體的生長發(fā)育、功能代謝以及衰老和多種疾病[19]。因此中醫(yī)認(rèn)為,腎精虧虛、腎氣虛衰以致機體氣血虧虛,陰陽失調(diào)是PADAM的病因病機,并相應(yīng)形成了滋腎填精,益氣活血的基本治法[20]。杞蠣還少方在中醫(yī)著名補腎方劑五子衍宗丸基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)抗衰老研究成果化裁形成。方中枸杞子益精填髓、補肝腎陰;牡蠣肉滋陰養(yǎng)血,補虛生津,共為君藥。肉蓯蓉補益精血,潤腸通便;菟絲子補益肝腎,溫補腎陽;桑椹滋陰補血,生津潤燥,為臣藥組合。佐以益智仁溫腎暖脾,固精縮尿;三七活血散瘀,補虛強壯。使以五味子上益心氣,下滋腎陰,可寧心安神,又可以其酸澀之性防腎精與氣血耗竭。牡蠣肉咸味又可引諸藥入腎經(jīng)。諸藥合用,腎精得充,陰陽得化,五臟得潤,六腑得通,共奏益精填髓,補氣養(yǎng)血之效。同時加入具有改善前列腺增生效用的油菜花粉,加之牡蠣肉兼有軟堅消腫之效,有望對癥改善前列腺增生肥大等現(xiàn)象[21]。由于本研究重點評價的是杞蠣還少方的抗氧化作用,所以選擇了具有顯著抗氧化效用且延緩衰老的維生素E作為陽性對照藥。研究發(fā)現(xiàn),杞蠣還少方的抗氧化效應(yīng)與維生素E相似,提示杞蠣還少方具有顯著的抗氧化效應(yīng)。更為重要的是,杞蠣還少方的組成藥味具有改善機體功能的多種效用,且枸杞子、桑椹、益智仁為藥食同源中藥材,菟絲子、肉蓯蓉、三七、五味子屬于可用于保健食品中藥材,牡蠣肉與油菜花粉可作為普通食品長期食用。因此杞蠣還少方的安全性高,更適合PADAM患者長期調(diào)理改善的需要。

已有報道顯示,杞蠣還少方中藥味具有顯著睪丸功能保護作用。枸杞子作為本方的君藥,其多糖、甜菜堿、酰胺類成分具有明顯的抗氧化、抗衰老功效[22-25],枸杞多糖作為枸杞子的主要功效物質(zhì),具有減少小鼠睪丸細(xì)胞的凋亡,提高雄激素水平的作用,是枸杞子發(fā)揮保健功效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[26]。牡蠣肉的主要成分牡蠣寡肽能夠增強細(xì)胞的抗氧化能力,促進間質(zhì)細(xì)胞睪酮的合成分泌,可有效防治PADAM[27-28]。菟絲子的主要功效成分菟絲子黃酮能夠促進睪丸細(xì)胞的增殖[29-30],肉蓯蓉的苯乙醇總苷可增強腎陽虛大鼠性能力[31]。三七總皂苷可抑制自然衰老大鼠的睪丸炎癥與睪丸生殖細(xì)胞凋亡[32]。五味子甲素與油菜花粉總黃酮也具有抗氧化、抗衰老的作用[33-34]。因此杞蠣還少方抑制睪丸組織氧化損傷,改善機體性激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的紊亂應(yīng)是方中多種效用成分綜合作用的結(jié)果。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)杞蠣還少方能夠調(diào)節(jié)亞急性衰老小鼠血清性激素水平,改善睪丸組織病理損傷,該作用可能與其降低睪丸組織氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究為該方防治PADAM的臨床應(yīng)用提供了現(xiàn)代科學(xué)依據(jù),也為相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)奠定了效用評價基礎(chǔ)。