李思琪,王紅嫚,秘 樂

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科,廣東 珠海 519000)

呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(ventilator-associated pneumonia ,VAP)大多數(shù)是口咽部分泌物所致感染。氣管插管引起的細(xì)菌感染和宿主免疫力之間的相互作用在很大程度上決定了VAP的發(fā)展。VAP的主要癥狀包括發(fā)熱、膿性分泌物、低氧血癥、白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高［1］。近年來,相關(guān)VAP診療指南中并未有明確的診療標(biāo)準(zhǔn),通常采用醫(yī)院獲得性肺炎(hospital-acquired pneumonia ,HAP)相類似的診斷標(biāo)準(zhǔn)及治療方案。區(qū)別于上述肺炎,VAP有開創(chuàng)性損傷,在探尋關(guān)于VAP診斷及治療靶點(diǎn)的生物標(biāo)記物尤為重要。HMGB1在感染和損傷過程中,以炎癥反應(yīng)為媒介,從細(xì)胞中釋放出來［2］或通過RAGE、Toll樣受體介導(dǎo),激活下游信號(hào),誘導(dǎo)細(xì)胞趨化和釋放促炎細(xì)胞因子等多種細(xì)胞反應(yīng)［3］。

1 呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎定義

在臨床上將VAP分為早發(fā)型和晚發(fā)型,早發(fā)型VAP發(fā)生于機(jī)械通氣前4 d內(nèi),晚發(fā)型VAP發(fā)生于機(jī)械通氣后4 d［4］,其嚴(yán)重性、機(jī)械通氣時(shí)間、ICU住院時(shí)長(zhǎng)都有相關(guān)性,并可能增加死亡風(fēng)險(xiǎn)［5］。開放性創(chuàng)傷是機(jī)械通氣的常見問題,侵入的病原體主要為吸入型,細(xì)菌侵入氣管管口后形成細(xì)菌生物膜定植于氣管導(dǎo)管內(nèi),口咽的菌群和定植變化對(duì)感染風(fēng)險(xiǎn)都有較大的影響［6-7］。Metersky等［8］提出良好的護(hù)理?xiàng)l件：例如抬高床頭,每日評(píng)估患者狀態(tài)等來預(yù)防感染風(fēng)險(xiǎn),但在機(jī)械通氣超過2 d的患者人群中,仍有10%的患者會(huì)發(fā)展成VAP［9］。

2 HMGB1的結(jié)構(gòu)及作用

高遷移率族蛋白1(high mobility group protein B1,HMGB1)是一類進(jìn)化的高度保守非組蛋白,因其質(zhì)量小且在聚丙烯凝膠電泳中的高遷移率而得名。HMGB1是天然免疫細(xì)胞分泌的蛋白,由215個(gè)氨基酸殘基組成,它們形成2個(gè)DNA結(jié)構(gòu)域［10］,氨基端含有2個(gè)富含賴氨酸帶正電荷的 A 盒 和 B 盒 及 1 個(gè)酸性氨基酸和高度重復(fù)帶負(fù)電荷的羧基末端,而A盒具有1個(gè)肝素結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)蛋白水解裂位點(diǎn)區(qū)［11］,B盒則是為晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor of the advanced glycosylation end product ,RAGE)結(jié)合位區(qū),羧基末端調(diào)控HMGB1 與 DNA的結(jié)合以及與其他蛋白的相互作用［12］。1994年Matzinger［13］提出了“危險(xiǎn)理論”既機(jī)體免疫炎癥系統(tǒng)不但對(duì)感染做出反應(yīng),也會(huì)對(duì)細(xì)胞的非生理性死亡和損傷做出反應(yīng)。然而免疫炎癥系統(tǒng)的觸發(fā)依賴于對(duì)內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)的感知,這些信號(hào)統(tǒng)稱為損傷相關(guān)分子模式(damage-associated-molecular-pattern, DAMP )或警報(bào)蛋白。Wang等［14］發(fā)現(xiàn)HMGB1是一種具有代表性的 DAMP或警報(bào)蛋白,能引起無菌性炎癥,它們?cè)跈C(jī)體穩(wěn)態(tài)時(shí),有特定的細(xì)胞內(nèi)指令。但當(dāng)機(jī)體受到外部影響作出應(yīng)激反應(yīng)后,HMGB1在接收到相關(guān)信號(hào)蛋白也會(huì)作出相應(yīng)的反應(yīng)釋放相關(guān)炎癥因子,從而導(dǎo)致機(jī)體全身性炎癥感染以及器官損傷甚至死亡。

3 HMGB1與VAP的相關(guān)性

VAP的發(fā)生機(jī)制是多方面的,不僅氣管插管引起的開放性損傷打破了上呼吸道的抗菌機(jī)械防御系統(tǒng)而且高氧環(huán)境的刺激也會(huì)增加機(jī)體對(duì)細(xì)菌的易感性。高氧引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)及細(xì)胞外HMGB1的改變,可影響巨噬細(xì)胞吞噬功能［15］。臨床研究表明,患者在機(jī)械通氣后發(fā)生肺部炎癥及血漿HMGB1升高［16］。DAMP是可通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor PRR)激活先天免疫細(xì)胞,而其中晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGEs)、toll樣受體中TLR2、TLR4和TLR9為HMGB1的常見受體,HMGB1通過與受體結(jié)合后激活免疫細(xì)胞,如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等,從而釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、 白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-γ (TNF-γ)等炎性因子,同時(shí),這些炎性因子又反過來促進(jìn)HMGB1的分泌,從而啟動(dòng)免疫反應(yīng)［17］。國(guó)內(nèi)外研究表明,在健康個(gè)體中,細(xì)胞外HMGB1的釋放是激活特異性免疫細(xì)胞進(jìn)行宿主防御作用,而當(dāng)氣管內(nèi)滴注LPS后,HMGB1呈上升趨勢(shì),其致中性粒細(xì)胞聚集,細(xì)胞因子釋放增加,從而導(dǎo)致肺水腫［18］。HMGB1是膿毒癥相關(guān)性急性肺損傷(acute lung injury, ALI)的晚期介質(zhì),且與ALI預(yù)后相關(guān)［19］,現(xiàn)探尋關(guān)于HMGB1/TLR4、RAGE通路在VAP的作用機(jī)制,以期針對(duì)VAP的診斷與治療發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)。

3.1 HMGB1 的釋放與JAK/STAT信號(hào)通路 蛋白質(zhì)穿梭于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間的位置,取決于核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)和核輸出序列(nuclear export sequences, NES),HMGB1中含有2個(gè)NLS和2個(gè)非經(jīng)典的NES指導(dǎo)其核定位,可作為判斷HMGB1是存在于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)這一生理?xiàng)l件。HMGB1翻譯后修飾可以通過乙酰化、磷酸化、甲基化等多種方式表達(dá)。然而,HMGB1定位序列中最普遍的是乙?；?0］。Janus激酶(JAK)家族由分子(JAK1、JAK2、JAK3、TYK2)組成,其在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中起重要作用。JAK/STAT1通路受到INF、機(jī)械通氣等多種因素影響激活,進(jìn)一步引起HMGB1從胞核到胞漿的移位,HMGB1刺激釋放的細(xì)胞因子再次激活JAK的磷酸化隨之可促進(jìn)STATs的磷酸化,STATs可以轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞核中調(diào)節(jié)信號(hào)的基本信使,可改變應(yīng)激或損傷引起的炎癥反應(yīng)［21-22］。Zhang等［23］實(shí)驗(yàn)中證實(shí),JAK/STAT信號(hào)啟動(dòng)并促進(jìn)HMGB1的分泌,說明JAK/STAT信號(hào)途徑能調(diào)控HMGB1,使其基因表達(dá)發(fā)生變化,并且JAK/STAT信號(hào)通路抑制劑能逆轉(zhuǎn)這一改變。在HK-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中使用siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染技術(shù),可知JAK/STAT信號(hào)通路的失活降低了HMGB1的表達(dá)水平,進(jìn)一步降低了炎癥反應(yīng)。這些研究結(jié)果提示了JAK/STAT信號(hào)通路對(duì)免疫系統(tǒng)可能具有影響,并且這種影響與JAK/STAT信號(hào)通路對(duì)HMGB1表達(dá)的調(diào)控密切相關(guān)。

3.2 巨噬細(xì)胞極化 機(jī)械通氣刺激能激活巨噬細(xì)胞,活化的巨噬細(xì)胞在肺中招募外周中性粒細(xì)胞,并參與炎癥反應(yīng),其中巨噬為主要的驅(qū)動(dòng)力,活化后的巨噬細(xì)胞通常分為兩類,M1型巨噬細(xì)胞及M2型巨噬細(xì)胞。Yin等［24］在探討呼吸機(jī)致大鼠肺部炎癥的機(jī)制時(shí),測(cè)定了肺組織巨噬細(xì)胞的極化值,結(jié)果表明當(dāng)機(jī)械通氣頻率過高時(shí),大鼠肺內(nèi)巨噬細(xì)胞極化為M1型并分泌TNF-α、IL-6等炎癥因子,使炎癥反應(yīng)加劇。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中利用shRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默細(xì)胞中的HMGB1發(fā)現(xiàn),HMGB1的沉默可以防止巨噬細(xì)胞極化［25］。Wang等［26］研究表明,細(xì)胞外HMGB1通過激活巨噬細(xì)胞中的黑色素瘤2 (absent in melanoma 2,AIM2)炎性小體及TLR2、TLR4和RAGE/NF-κB等信號(hào)通路,可引起M1巨噬細(xì)胞的極化。上述實(shí)驗(yàn)表明HMGB1參與巨噬細(xì)胞的調(diào)控。

4 AGE的概述及在VAP中的作用

4.1 RAGE結(jié)構(gòu) RAGE(the receptor for advanced glycation end products,RAGE)是存在于細(xì)胞表面的免疫球蛋白受體,因其可與非酶糖基化和蛋白質(zhì)、脂質(zhì)氧化等產(chǎn)物相結(jié)合,故被稱為晚期糖基化終產(chǎn)物［27］。RAGE蛋白作為PRR中最重要的受體之一,在血管細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞)以及免疫細(xì)胞中均有表達(dá)［28］,它能識(shí)別并介導(dǎo)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而參與了許多生理過程,包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等。已有研究揭示RAGE信號(hào)通路在糖尿?。?9］、阿爾茲海默癥［30］、心血管疾病［31］以及癌癥［32］均有進(jìn)展。RAGE信號(hào)與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移和細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)有一定關(guān)系,可以激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,絲裂原活化的蛋白激酶MAPK(ERK 1/2、p38、SAPK/JNK)、STAT3、Janus激酶,可觸發(fā)NF-κB、EGR-1和SP-1等信號(hào)級(jí)聯(lián),引起系列促炎基因的表達(dá),包括轉(zhuǎn)錄因子下游：血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1 VCAM-1)、IL-6、TNF-α和其他免疫調(diào)節(jié)劑。

4.2 HMGB1的釋放與RAGE/NF-κB 信號(hào)通路 Sitapara等［33-34］將小鼠暴露于高氧環(huán)境同時(shí)給予銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)感染,刺激巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn),細(xì)胞外HMGB1濃度隨時(shí)間增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。HMGB1被巨噬細(xì)胞視為炎癥“警報(bào)”的細(xì)胞因子輸出,巨噬細(xì)胞的吞噬功能因此受到影響,同時(shí)增加了小鼠的死亡率。呼吸機(jī)使用狀態(tài)下可誘導(dǎo)活性氧刺激抑制性IκB蛋白和磷酸化IκB的激酶,即IκB激酶(IKK)復(fù)合體,導(dǎo)致NF-κB的核轉(zhuǎn)位與它們的同源DNA結(jié)合,進(jìn)一步激活關(guān)于宿主免疫、炎癥、細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)等多種基因轉(zhuǎn)錄。

HMGB1可通過RAGE調(diào)節(jié)來刺激NF-κB轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)一步促進(jìn)多種細(xì)胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α)的釋放。Kircheis等［35］在LPS誘導(dǎo)的ALI模型實(shí)驗(yàn)中,模型組RAGE相對(duì)空白組濃度顯著增加,NF-κB途徑的關(guān)鍵蛋白(IKK、IκB和P65)的磷酸化得到高效表達(dá),而在使用蛋白酶抑制劑 VL-01組,使IκBa-α的蛋白酶體降解,同時(shí)抑制小鼠IL-1、IL-6、TNF-α、CXCL1等細(xì)胞因子在炎癥高峰時(shí)的表達(dá)。Zhou等［36］研究揭示了 LPS 誘導(dǎo)ALI 體外模型中HMGB1-RAGE信號(hào)通路的激活,HMGB1的蛋白表達(dá)量較空白組升高了3.12倍,同時(shí)RAGE和下游p-p65/NF-κB在LPS刺激細(xì)胞中的表達(dá)也呈上升趨勢(shì)。另外,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明加入抗HMGB1單抗可以降低HMGB1受體(TLR-4、TLR-9和RAGE)以及NF-κB的基因表達(dá)水平,并且抑制炎癥介質(zhì)(IL-1b、TNF-α和IL-6)的釋放。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過抑制HMGB1/RAGE/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活,可以有效地抑制炎癥趨化因子的表達(dá)。因此,該通路可作為探究HMGB1在呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎中診療指標(biāo)的新思路［37］。

5 TOLL的概述及在VAP中的作用

5.1 TOLL受體結(jié)構(gòu) TLR在胞質(zhì)膜上(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6)或胞質(zhì)內(nèi)囊泡(TLR3、TLR7、TLR8和TLR9)都表達(dá)出最重要的受體。其中,TLR4是一種跨膜蛋白,是典型的PRR并在不同的肺細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá),其特征是包含有與 MD-2 分子相關(guān)的亮氨酸重復(fù)序列 (LRR) 的胞外結(jié)構(gòu)域,以及含有保守區(qū)域的Toll/IL-1 受體(TIR)結(jié)構(gòu)域［38］。TOLL樣受體是病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPS)的結(jié)合受體,再經(jīng)過一系列蛋白質(zhì)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活轉(zhuǎn)錄因子,從而引發(fā)先天性免疫反應(yīng)和炎癥擴(kuò)散［39］。TLR4受體可由LPS激活啟動(dòng)MyD88和TRIF依賴性信號(hào)通路,并刺激宿主的非特異性免疫應(yīng)答等,相互作用誘發(fā)的局部細(xì)胞因子風(fēng)暴,從而觸發(fā)炎癥反應(yīng),可能會(huì)引起ALI或更嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),并伴隨全身受累和危及生命。已有文獻(xiàn)報(bào)道,在使用機(jī)械通氣后,大鼠肺組織中TLR4蛋白的表達(dá)量升高,肺毛細(xì)血管擴(kuò)張,肺部炎癥細(xì)胞增多以及出現(xiàn)肺水腫等病理表現(xiàn)［40］。因此,TOLL受體作為VAP診斷或者治療的理想靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。

5.2 HMGB1的釋放與 TLR4-NF-κB 信號(hào)通路 在HMGB1結(jié)合TLR4的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子釋放的過程中,TRIF依賴的通路發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Mohamed等［41］在芳樟醇通過HMGB1/TLR4/NF-κB通路對(duì)順鉑腎毒性的改善作用實(shí)驗(yàn)中證明,芳樟醇可降低TLR4、MYD88和TRIF mRNA和蛋白的表達(dá),從而減少TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-κB、HMBG1相關(guān)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。在大部分骨髓細(xì)胞中,CD14大量的表達(dá)促進(jìn)了LPS對(duì)TLR4的活化,以及對(duì)受體信號(hào)傳導(dǎo)與降解的調(diào)控。TLR4分別觸發(fā)MYD88依賴通路和TRIF依賴通路,這2條信號(hào)通路中銜接蛋白參與促炎因子誘導(dǎo),且所產(chǎn)生的細(xì)胞因子有部分重疊,MyD88和TRIF所依賴的信號(hào)通路是被持續(xù)觸發(fā)的,并且與LPS激活的TLR4由胞質(zhì)到胞核的再分配相關(guān)聯(lián)［42］。Vaneker等［43］在小鼠機(jī)械通氣試驗(yàn)中證明,TRIF通路是TLR4的下游通路,可以使NF-κB激活,而在TRIF激活引起核因子NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核并轉(zhuǎn)錄促炎基因,誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而發(fā)生炎癥反應(yīng)及對(duì)肺功能的損害。當(dāng)TRIF缺乏時(shí)激活NF-κB表達(dá)量發(fā)生下調(diào),可使機(jī)械通氣后的炎癥反應(yīng)減弱。因此,抑制TLR4/TRIF -NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的HMGB1表達(dá)量減少,從而降低相關(guān)炎癥因子釋放以及減輕炎癥反應(yīng)在治療呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎上具有潛在的價(jià)值。

5.3 HMGB1的釋放與TLR4-MYD88信號(hào)通路 TLR4激活的信號(hào)通路作用于TIR結(jié)構(gòu)域招募的配體：MyD88、TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白(TIRAP),而TIRAP為TLR4激活MyD88的橋梁,參與NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活,并進(jìn)而調(diào)控促炎基因的表達(dá)［44］。Zhang等［45］在使用右美托咪定的過程中,可以通過HMGB1-TLR4/MyD88-NF-кB信號(hào)通路來緩解心肌缺血/再灌注損傷,實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)受損細(xì)胞釋放危險(xiǎn)信號(hào)HMGB1時(shí),受體TLR4結(jié)合,啟動(dòng)下游的MyD88-NF-кB信號(hào)級(jí)通路。Meng等［46］研究表明,TLR4基因敲除或給予TLR4拮抗劑時(shí),NF-кB的表達(dá)以及相應(yīng)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,提示TLR4-MyD88-NF-кB可能在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中具有潛在作用。Yu等［47］在狼瘡性腎炎的實(shí)驗(yàn)中給小鼠腹腔注入HMGB1抗體抑制劑8周后,TLR4、MyD88和p-IκBα蛋白的表達(dá)下調(diào),所誘導(dǎo)的NF-κB/p65核轉(zhuǎn)位降低,可減輕血管上皮的高通透性,證實(shí)細(xì)胞外HMGB1在狼瘡性腎炎的發(fā)病過程中,主要通過活化TLR4/MyD88/NF-κB/p65通路,從而引起腎小管上皮細(xì)胞的損傷。在受到機(jī)械通氣損傷時(shí),組織釋放出較多HMGB1激活了TLR4并通過依賴MyD88的途徑促進(jìn)NF-κB的活性,觸發(fā)IL-1、IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá),造成組織進(jìn)一步的損傷［48］,說明抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路以及下游的HMGB1亦可能是成為呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎有價(jià)值的臨床治療思路。

6 展望

VAP 是一個(gè)具有較高發(fā)病率的全球公共衛(wèi)生問題,HMGB1通過與TLR4/RAGE在VAP中發(fā)揮炎癥作用,激活下游炎癥通路,并引發(fā)促炎因子的釋放,進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng),加重了VAP的肺部損傷。然而,HMGB1對(duì)呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎影響信號(hào)通路的機(jī)制仍需更深入探討。此外,盡管HMGB1-TLR4/RAGE相關(guān)拮抗劑在多種炎癥模型中取得了進(jìn)展,但VAP在 臨床研究中尚未見到明顯成效。本文通過對(duì)近年來國(guó)內(nèi)外HMGB1以及相關(guān)信號(hào)通路和蛋白受體的相互作用關(guān)系在VAP診斷治療中的作用機(jī)制進(jìn)行整理歸納,可能為未來VAP治療與診斷提供新思路。