胡曉英,吳建發(fā),王 鷹,姜伶俐,柳 洲

(上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院 婦產(chǎn)科,上海 201318)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis, EM)是一種慢性炎癥性疾病,定義為子宮內(nèi)膜組織存在于子宮外,導(dǎo)致盆腔疼痛和不孕,已被視為一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題,嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量,并造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。鐵是細(xì)胞生存的必需元素,缺鐵是許多生殖疾病的已知危險(xiǎn)因素。鐵死亡是EM的特征之一,細(xì)胞通過(guò)逆行月經(jīng)擴(kuò)散以存活、植入和建立EM病變,導(dǎo)致鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào),造成局部鐵超負(fù)荷、炎癥反應(yīng)等病理生理學(xué)變化［2］。溫經(jīng)湯是一種傳統(tǒng)中藥,已被證明對(duì)EM有治療作用,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果指出,漢黃芩是溫經(jīng)湯的活性成分之一,可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥、內(nèi)分泌治療EM,且Wog本身得抗炎、抗病毒感染活性極強(qiáng),對(duì)大多數(shù)炎癥類(lèi)疾病都有效果［3］。沉默調(diào)節(jié)蛋白1(silent information regulator 1, SIRT1)是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白,在不同的細(xì)胞和生理功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,如線粒體生物發(fā)生、細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡(包括鐵死亡)等,SIRT1脫乙?；せ詈艘蜃覧2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid2-related factor 2, Nrf2)能夠抑制鐵死亡進(jìn)程［4］。Wog能否通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1/Nrf2信號(hào)通路抑制EM鐵死亡暫不清楚,本研究旨在借助EM動(dòng)物模型探究Wog對(duì)EM的影響和SIRT1/Nrf2軸的調(diào)控作用,嘗試為開(kāi)發(fā)EM的治療藥物提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡健康未孕SD雌性大鼠,體重206～235 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司上海分公司,生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2022-0007。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境為SPF級(jí)動(dòng)物房,12 h/12 h光暗循環(huán),溫度(24±1)℃,濕度(50±10)%。

1.1.2 藥物、主要試劑 Wog(純度≥98%,632-85-9),購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司;SIRT1抑制劑(EX527,HY-15452),購(gòu)自美國(guó)MCE公司;白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β,CB10205-Ra)、IL-6(CB10218-Ra)ELISA試劑盒,購(gòu)自上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司;雌二醇(estradiol, E2,J22765)、孕激素(progestin, P,J22752)ELISA試劑盒,購(gòu)自吉利德生物;一抗SIRT1(ab110304)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4, GPX4,ab125066)、溶質(zhì)載體家族7成員11(recombinant solute carrier family 7, SLC7A11,ab307601)和鐵蛋白輕鏈(ferritin light chain, FTL,ab75973),購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;一抗Nrf2(80593-1-RR),購(gòu)自武漢三鷹。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,連續(xù)3 d灌胃戊酸雌二醇0.1 mg/(kg·d)使大鼠處于同一動(dòng)情周期,采用自體子宮移植法構(gòu)建EM大鼠模型。大鼠禁食24 h,麻醉,開(kāi)腹,結(jié)扎左側(cè)子宮并切除子宮角,縱向切開(kāi)子宮組織,剪為5 mm×5 mm的組織塊,迅速將組織塊固定至右側(cè)腹壁血管豐富部位,縫合切口;術(shù)后3 d每只腹腔注射慶大霉素(0.4×104U/d)預(yù)防感染,自術(shù)后第2 天開(kāi)始灌胃戊酸雌二醇(0.1 mg/kg,2次/周)促進(jìn)子宮內(nèi)膜移植;4周后再次開(kāi)腹,移植物體積增大且形成含淡黃色透明液體的囊狀結(jié)構(gòu),異位病灶充血,新生血管豐富,表示造模成功［5］。

將所有大鼠隨機(jī)分為5組：空白組(CT組)、EM模型組(EM組)、Wog低劑量組(Wog L組)、Wog高劑量組(Wog H組)、Wog+EX527組,每組12只。CT組以外所有大鼠建立EM模型,CT組大鼠僅行單側(cè)子宮切除,不做異位移植。造模成功后第2天做給藥處理,Wog根據(jù)參考文獻(xiàn)［6-7］并做適量調(diào)整,Wog L組、Wog H組大鼠灌胃給藥7、14 mg/(kg.d)Wog+腹腔注射2 mL/kg/d 0.9%氯化鈉溶液;將EX527(10 mg/kg)溶解于1%二甲亞砜、30%聚乙二醇和0.9%氯化鈉溶液中,Wog+EX527組大鼠灌胃給藥14 mg/(kg.d) Wog+腹腔注射2 mL/(kg.d) EX527溶液;CT組和EM組大鼠灌胃+腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。給藥持續(xù)4周,給藥過(guò)程中損失大鼠及時(shí)補(bǔ)充。

1.2.2 異位病灶體積測(cè)定 給藥結(jié)束后,所有大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉完全麻醉,打開(kāi)腹腔,腹主動(dòng)脈取血5 mL靜置30 min,離心后取上層血清,分裝儲(chǔ)存;隨后收集完整的異位內(nèi)膜組織,使用游標(biāo)卡尺迅速測(cè)量其長(zhǎng)、寬、高,樣品分為2份,分別保存在4%多聚甲醛溶液中和-80℃冰箱中。異位病灶體積(mm3)=0.52×長(zhǎng)×寬×高。

1.2.3 血清性激素和促炎細(xì)胞因子含量測(cè)定 取1.2.2中血清樣本,依照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定檢測(cè)E2、P、IL-1β、IL-6的含量。

1.2.4 異位內(nèi)膜組織病理學(xué)觀察 將1.2.2保存在多聚甲醛中的異位內(nèi)膜組織進(jìn)行乙醇脫水、包埋和切片處理,切片去石蠟、干燥,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色,光學(xué)顯微鏡下拍照并分析異位內(nèi)膜組織病理學(xué)變化。

1.2.5 異位內(nèi)膜組織鐵離子聚集情況檢測(cè) 將1.2.4中石蠟切片脫蠟,亞鐵青化鉀溶液和鹽酸溶液等比例混合成普魯士藍(lán)染液染色切片1 h,核固紅染液染色5 min,切片依次放入無(wú)水乙醇Ⅰ5 min-無(wú)水乙醇Ⅱ5 min-無(wú)水乙醇Ⅲ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min透明,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡拍照,鐵呈藍(lán)色,細(xì)胞核呈紅色。

1.2.6 異位內(nèi)膜組織Fe2+濃度檢測(cè) 取1.2.2中冷藏的異位內(nèi)膜組織,勻漿,樣本分為2份,其中1份按照鐵離子比色法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)Fe2+的濃度,另1份儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.2.7 異位內(nèi)膜組織SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表達(dá)檢測(cè) 定量1.2.6中勻漿樣品總蛋白濃度,采用Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。配制SDS-PAGE凝膠,樣品上樣10 μg,電泳設(shè)置為80 V通電30 min后轉(zhuǎn)為120 V通電1 h,轉(zhuǎn)膜儀設(shè)置為200 V,隨后封閉PVDF膜,目的條帶置于抗體稀釋液中過(guò)夜,再經(jīng)過(guò)二抗稀釋液和ECL化學(xué)發(fā)光液孵育,拍照并分析蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠異位病灶體積比較 與CT組比較,EM組大鼠異位病灶體積增大(P<0.05);與EM組比較,Wog L、Wog H組大鼠異位病灶體積呈劑量依賴(lài)性減小(P<0.05);與Wog H組比較,Wog+EX527組大鼠異位病灶體積增大(P<0.05,圖1A)。

A：各組大鼠異位病灶體積比較;B：各組大鼠血清性激素和促炎細(xì)胞因子含量比較;*：與CT組比較,P<0.05;#：與EM組比較,P<0.05;&：與Wog L組比較,P<0.05;@：與Wog H組比較,P<0.05。圖1 異位病灶體積、血清性激素和促炎細(xì)胞因子含量比較

2.2 各組大鼠血清性激素和促炎細(xì)胞因子含量比較 與CT組比較,EM組E2、P、IL-1β、IL-6含量升高(P<0.05);與EM組比較,Wog L、Wog H組E2、P、IL-1β、IL-6含量呈劑量依賴(lài)性降低(P<0.05);與Wog H組比較,Wog+EX527組E2、P、IL-1β、IL-6含量升高(P<0.05,圖1B)。

2.3 各組大鼠異位內(nèi)膜組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示,CT組子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)完整,腺體排列整齊;EM組腺體較少,可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與EM組比較,Wog L、Wog H組腺體增多,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,病理?yè)p傷減輕;與Wog H組比較,Wog+EX527組組織損傷嚴(yán)重,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加(圖2)。

A：CT組;B：EM組;C：Wog L組;D：Wog H組;E：Wog+EX527組;×200。圖2 各組大鼠異位內(nèi)膜組織HE染色結(jié)果

2.4 各組大鼠異位內(nèi)膜組織鐵離子聚集情況 CT組子宮內(nèi)膜組織未見(jiàn)明顯藍(lán)色染色顆粒;EM組可見(jiàn)大量明顯藍(lán)色染色顆粒,鐵沉積量高;與EM組比較,Wog L、Wog H組藍(lán)色染色顆粒明顯減少,鐵沉積量顯著降低;與Wog H組比較,Wog+EX527組藍(lán)色染色顆粒增多(圖3)。

2.5 各組大鼠異位內(nèi)膜組織Fe2+濃度比較 與CT組比較,EM組Fe2+濃度顯著升高(P<0.05);與EM組比較,Wog L、Wog H組Fe2+濃度呈劑量依賴(lài)性降低(P<0.05);與Wog H組比較,Wog+EX527組Fe2+濃度顯著升高(P<0.05,圖4A)。

A：各組大鼠異位內(nèi)膜組織Fe2+濃度比較;B：Western blot檢測(cè)異位內(nèi)膜組織蛋白的表達(dá);C：各組SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表達(dá)水平比較;a：CT組;b：EM組;c：Wog L組;d：Wog H組;e：Wog+EX527組;*：與CT組比較,P<0.05;#：與EM組比較,P<0.05;&：與Wog L組比較,P<0.05;@：與Wog H組比較,P<0.05。圖4 各組大鼠異位內(nèi)膜組織Fe2+濃度及蛋白表達(dá)水平比較

2.6 各組大鼠異位內(nèi)膜組織SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表達(dá)水平比較 與CT組比較,EM組SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);與EM組比較,Wog L、Wog H組SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴(lài)性升高(P<0.05);與Wog H組比較,Wog+EX527組SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05,圖4B、C)。

3 討論

約50%的不孕癥婦女發(fā)生EM,表現(xiàn)為卵泡發(fā)育不良和卵母細(xì)胞質(zhì)量下降,鐵死亡是造成卵母細(xì)胞成熟障礙的主要原因［8］。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞鐵死亡還可能觸發(fā)細(xì)胞因子分泌,并通過(guò)副分泌作用促進(jìn)鄰近病變血管的生成,從而推動(dòng)EM的發(fā)展［9］,探尋改善EM鐵死亡的靶向制劑刻不容緩。Wog是黃酮類(lèi)化合物的成員之一,來(lái)源于唇形科植物黃芩、滇黃芩、半枝蓮等根莖,具有抗癌、抗炎、抗焦慮、神經(jīng)保護(hù)、治療細(xì)菌和病毒感染等多種活性［10］。EM是一種慢性炎癥性疾病,本研究主要探究Wog對(duì)EM鐵死亡的影響及可能的作用機(jī)制。

本研究采用自體子宮移植法構(gòu)建EM大鼠模型,模型大鼠異位病灶體積增大,異位內(nèi)膜組織腺體較少,可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),呈典型的EM病理狀態(tài),說(shuō)明模型構(gòu)建成功。血清E2、P是反映性激素水平的2個(gè)重要指標(biāo),臨床數(shù)據(jù)顯示,EM患者血清E2、P水平較健康人群顯著升高［11］。IL-1β、IL-6是引起慢性炎癥所必需的細(xì)胞因子,影響子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖、粘附、遷移和侵襲,在EM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用［12］。本研究也發(fā)現(xiàn),EM大鼠血清E2、P、IL-1β、IL-6含量升高,說(shuō)明性激素紊亂和炎癥因子的過(guò)表達(dá)可能是促進(jìn)EM進(jìn)展的2個(gè)因素。EM大鼠經(jīng)過(guò)Wog治療顯著抑制病灶體積的增大,改善異位內(nèi)膜組織病理?yè)p傷,降低血清E2、P、IL-1β、IL-6的含量,說(shuō)明Wog對(duì)EM具有治療效果。

鐵死亡是一種新型細(xì)胞程序性死亡形式,不同于細(xì)胞凋亡、壞死性凋亡、自噬等傳統(tǒng)細(xì)胞死亡形式,其特征在于脂質(zhì)過(guò)氧化物的鐵依賴(lài)性積累至致死量,引起器官損傷和退行性病理［13］。鐵是包括人類(lèi)在內(nèi)的大多數(shù)生物體生存的必需元素,鐵攝入過(guò)多、高鐵狀態(tài)、鐵死亡與包括EM在內(nèi)的生殖疾病有關(guān)［14］。SIRT1可以調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體功能、自噬、凋亡等多種生理過(guò)程［15］。Nrf2是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,抵消氧化和親電應(yīng)激基因的表達(dá)［16］。SIRT1脫乙酰化激活Nrf2能夠抑制鐵死亡進(jìn)程。GPX4是能夠直接還原復(fù)雜磷脂氫過(guò)氧化物的酶,也是Nrf2的下游靶基因,靶向抑制GPX4被認(rèn)為是觸發(fā)鐵死亡的關(guān)鍵策略［17］。SLC7A11和FTL是調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵蛋白,抑制SLC7A11和FTL活性、下調(diào)GPX4可以誘導(dǎo)鐵死亡［18］。鐵死亡細(xì)胞及其溢出內(nèi)容物還與疾病中的免疫反應(yīng)失調(diào)有關(guān)［19］。本研究發(fā)現(xiàn),EM大鼠異位內(nèi)膜組織大量鐵沉積,Fe2+濃度顯著升高,SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表達(dá)水平降低,說(shuō)明EM觸發(fā)了鐵死亡,機(jī)體處于高鐵狀態(tài),SIRT1/Nrf2信號(hào)通路被抑制,這可能也與前述促炎細(xì)胞因子過(guò)表達(dá)有關(guān);Wog不僅能緩解鐵沉積和Fe2+濃度升高,還能增加SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表達(dá)水平;SIRT1抑制劑EX527和Wog聯(lián)合使用干預(yù)EM大鼠的治療效果和對(duì)SIRT1/Nrf2軸的影響不明顯,未改善鐵死亡現(xiàn)象,提示W(wǎng)og可能通過(guò)激活SIRT1/Nrf2信號(hào)通路抑制EM大鼠鐵死亡。

綜上所述,Wog可能通過(guò)激活SIRT1/Nrf2信號(hào)通路抑制EM大鼠鐵死亡。除此以外,Wog抑制腫瘤細(xì)胞ZR-75-30和HeLa的增殖以及治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也與調(diào)控鐵死亡有關(guān)［20-21］。SIRT1/Nrf2途徑對(duì)機(jī)體代謝的調(diào)控也是多方面的,本研究?jī)H分析了SIRT1/Nrf2通路在調(diào)節(jié)EM鐵死亡的作用,之后可以做進(jìn)一步研究,豐富Wog作為臨床用藥的理論依據(jù)。