楊文珂,趙玉榮,王 強(qiáng),馬莉娉,蘇占海,董秋霞,馬雪曼*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部,西寧 810001;2.青海紅十字醫(yī)院,西寧 810000)

有研究認(rèn)為,六君二陳解毒湯降低了肺腺癌小鼠肺部轉(zhuǎn)移率[1],但未被廣泛認(rèn)同。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)開(kāi)展相關(guān)研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為探索藥物與疾病之間的關(guān)系提供了一種新的策略,與中醫(yī)整體觀念、辨證論治的基本思想不謀而合[2]。分子對(duì)接技術(shù)是一種研究分子(如小分子配體和生物大分子)之間的相互作用并預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親和力的理論模擬方法[3]?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)研究傳統(tǒng)中藥的潛在藥理機(jī)制是一種可靠的研究方法。因此,本研究構(gòu)建六君二陳解毒湯的網(wǎng)絡(luò)藥理模型,用以系統(tǒng)分析六君二陳解毒湯治療非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)的潛在作用機(jī)制,并運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)

所選數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址)包括TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org)、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.pharmgkb.org/)、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)、Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(http://kmplot.com/analysis/)、RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.1.2 軟件工具

軟件工具包括Venny(2.1)在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)、微生信在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)和Cytoscape Version(3.9.2)、AutoDock(1.5.6)軟件和PYMOL軟件。

1.2 方法

1.2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

1.2.1.1 六君二陳解毒湯藥物活性成分及靶點(diǎn)篩選

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索黨參、白術(shù)、陳皮、甘草、茯苓、半夏、土茯苓和半枝蓮的活性成分并進(jìn)行篩選,設(shè)置篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18,并將篩選獲得的活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。使用Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)得到的靶點(diǎn)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,轉(zhuǎn)換為相應(yīng)靶點(diǎn)名稱,得到藥物活性成分靶點(diǎn)。

1.2.1.2 NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“non-small cell lung cancer”為關(guān)鍵詞,在GeneCards、OMIM、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,收集NSCLC相關(guān)作用靶點(diǎn)。GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中的疾病靶點(diǎn)篩選標(biāo)準(zhǔn)為得分≥10。對(duì)收集到的疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)進(jìn)行匯總,并去除重復(fù)值,獲得與NSCLC相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.2.1.3 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Venny(2.1)在線工具來(lái)確定六君二陳解毒湯和NSCLC的交點(diǎn),并建立韋恩圖。采用Cytoscape Version(3.9.2)軟件對(duì)“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)為藥物名稱、活性成分、基因靶點(diǎn)。

1.2.1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.2.1.3獲得的交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),建立PPI網(wǎng)絡(luò)。物種類型設(shè)置為“Homo sapiens”,最高置信度設(shè)置為“0.900”,隱藏游離節(jié)點(diǎn),其他參數(shù)保持為默認(rèn),獲取PPI網(wǎng)絡(luò)并保存為T(mén)SV文件格式。將獲取的數(shù)據(jù)輸入Cytoscape Version(3.9.2)軟件進(jìn)行可視化處理。

1.2.1.5 聚類分析

本研究通過(guò)MCODE插件對(duì)六君二陳解毒湯-疾病-靶點(diǎn)進(jìn)行聚類分析,運(yùn)用Cytoscape Version(3.9.2)軟件對(duì)聚類分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.2.1.6 GO生物功能和KEGG通路富集分析

本研究利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物功能和KEGG通路富集分析,并使用微生信在線工具對(duì)GO生物功能和KEGG通路富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理,繪制氣泡圖。

1.2.1.7 核心基因靶點(diǎn)表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)性分析

運(yùn)用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行生存分析,按中位數(shù)分組,其他選項(xiàng)均選擇默認(rèn)設(shè)置,觀察得到該靶點(diǎn)生存曲線的風(fēng)險(xiǎn)比(HR)、95%的置信區(qū)間(CI)和對(duì)數(shù)等級(jí)P。

1.2.2 分子對(duì)接技術(shù)

選取六君二陳解毒湯的主要活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu),其PDB ID見(jiàn)表1。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載化合物結(jié)構(gòu),并保存為mol2格式。靶點(diǎn)蛋白去水除配體的操作由PYMOL軟件完成,活性成分及靶點(diǎn)蛋白加氫、加電荷的操作由AutoDock1.5.6軟件完成,再運(yùn)行Auto dockvina軟件進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證,使用PYMOL軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理[4]。

表1 目標(biāo)蛋白PDB ID

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.1.1 六君二陳解毒湯活性成分的收集和篩選

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到六君二陳解毒湯所有活性成分及相關(guān)靶點(diǎn),篩選后共收集到198個(gè)藥物活性成分,其中白術(shù)7個(gè)、半夏13個(gè)、半枝蓮29個(gè)、陳皮6個(gè)、黨參21個(gè)、茯苓15個(gè)、土茯苓15個(gè)、甘草92個(gè)。去除無(wú)效和重復(fù)成分后得到968個(gè)潛在作用靶點(diǎn),其中白術(shù)19個(gè)、半夏90個(gè)、半枝蓮223個(gè)、陳皮68個(gè)、黨參109個(gè)、茯苓24個(gè)、土茯苓205個(gè)、甘草230個(gè)。采用Cytoscape Version(3.9.2)軟件分析六君二陳解毒湯藥物活性成分,Degree值居于前十位的活性成分見(jiàn)表2。

2.1.2 NSCLC的疾病靶點(diǎn)篩選

在GeneCards、OMIM、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)中以“non-small cell lung cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選,分別獲得766、439、305個(gè)NSCLC相關(guān)靶點(diǎn),在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中,以Score≥10為疾病靶點(diǎn)篩選條件獲得374個(gè)NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)。合并3個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)并剔除重復(fù)靶點(diǎn),共獲得1 093個(gè)與NSCLC相關(guān)的靶點(diǎn),使用Venny(2.1)在線工具繪制韋恩圖(圖1)并分析,得到12個(gè)藥物活性成分與NSCLC疾病的共同靶點(diǎn)。

圖1 韋恩圖

2.1.3 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)中共包括23個(gè)節(jié)點(diǎn)、22條邊。藥物活性成分節(jié)點(diǎn)圖標(biāo)越大表明其活性成分作用越大、節(jié)點(diǎn)越大表明藥物對(duì)該靶點(diǎn)作用越大。

圓形代表藥物成分,菱形代表藥物靶點(diǎn),四邊形代表藥物名稱

2.1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

去除游離靶蛋白后,六君二陳解毒湯治療NSCLC的PPI網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3。該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)共有10個(gè)節(jié)點(diǎn)和24條邊。節(jié)點(diǎn)越大代表靶蛋白度值越大;邊數(shù)連接的越多代表節(jié)點(diǎn)靶蛋白在網(wǎng)絡(luò)中與其他靶蛋白的聯(lián)系越多。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果如表3所示,共有10個(gè)作用靶點(diǎn)(EGFR、CAV1、PTEN、MCL1、CASP8、MET、RASA1、VCAM1、PARK2、IRF1)與治療NSCLC密切相關(guān)。其中,Degree值排名前五位的作用靶點(diǎn)分別為EGFR、PTEN、CAV1、MCL1、CASP8。這些靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地位,與網(wǎng)絡(luò)中的其他靶點(diǎn)密切相關(guān)。

表3 拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果

2.1.5 聚類分析

通過(guò)MCODE插件進(jìn)行聚類分析后得到1個(gè)具有相似功能的子簇,涉及8個(gè)核心靶點(diǎn),具體見(jiàn)圖4、表4。

圖4 聚類分析圖

表4 聚類分析表

2.1.6 富集分析

2.1.6.1 GO生物功能富集分析

為進(jìn)一步明確六君二陳解毒湯的核心生物學(xué)功能,使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)10個(gè)核心靶點(diǎn)的生物過(guò)程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細(xì)胞組成(cell component,CC)等方面進(jìn)行GO分析。在P<0.05的情況下,共得到69個(gè)GO條目,包括39個(gè)BP條目、13個(gè)MF條目和17個(gè)CC條目。BP條目共有39個(gè),主要集中在下調(diào)細(xì)胞凋亡過(guò)程(negative regulation of apoptotic process)等方面;MF條目共有13個(gè),主要涉及蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)等;細(xì)胞組成(CC)相關(guān)條目有17個(gè),主要有細(xì)胞溶質(zhì)(cytoso)、細(xì)胞膜(plasma membrane)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)。GO生物功能富集分析條帶圖見(jiàn)圖5。

圖5 GO生物功能富集分析條帶圖

2.1.6.2 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集的分析結(jié)果顯示了23個(gè)核心靶點(diǎn)的信號(hào)通路條目。六君二陳解毒湯治療NSCLC主要涉及FAK信號(hào)通路(Focal adhesion)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、微小核糖核酸信號(hào)通路(MicroRNAs in cancer)等信號(hào)通路。KEGG功能富集分析氣泡圖見(jiàn)圖6。

圖6 KEGG功能富集分析氣泡圖

2.1.7 潛在治療靶點(diǎn)相關(guān)靶點(diǎn)對(duì)NSCLC患者預(yù)后的分析

NSCLC患者生存分析曲線由Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)生成,患者按中位數(shù)分組,其他參數(shù)均選擇默認(rèn)參數(shù)。圖7顯示,EGFR、CAV1、PTEN、MCL1、MET、RASA1、VCAM1表達(dá)與NSCLC患者總生存期(Overall survival,OS)相關(guān)(P<0.05)。其中,MCL1靶點(diǎn)低表達(dá)患者生存期明顯高于高表達(dá)患者(P<0.05);EGFR、CAV1、PTEN、MET、RASA1、VCAM1靶點(diǎn)高表達(dá)患者生存期明顯高于低表達(dá)患者(P<0.05);CASP8、PARK2、IRF1靶點(diǎn)表達(dá)與患者OS無(wú)關(guān)(P>0.05)。

x軸代表時(shí)間,y軸代表生存可能性

2.2 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

將六君二陳解毒湯的5個(gè)主要成分(槲皮素、柚皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黃芩苷)與核心靶點(diǎn)(EGFR、PTEN、CAV1、MCL1、CASP8、MET、RASA1、PARK2)逐一進(jìn)行分子對(duì)接,六君二陳解毒湯活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能熱圖見(jiàn)圖8。結(jié)合能越小,說(shuō)明成分和靶點(diǎn)之間的結(jié)合越穩(wěn)定,β-谷甾醇與MCL1、MET、EGFR對(duì)接示意圖見(jiàn)圖9。通過(guò)上述所得,槲皮素、柚皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黃芩苷與核心靶點(diǎn)EGFR、CAV1、MCL1、MET、RASA1均有較為穩(wěn)定的結(jié)合。其中,β-谷甾醇與核心靶點(diǎn)MCL1、MET、EGFR結(jié)合者的能量較低,分別為-4.33、-4.2、-3.94 kJ/mol。

圖8 六君二陳解毒湯活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能熱圖

圖9 β-谷甾醇與MCL1、MET、EGFR對(duì)接示意圖

3 討論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)了六君二陳解毒湯治療NSCLC的主要有效藥物活性成分和核心靶點(diǎn),并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)得出主要有效藥物活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力,驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)出的結(jié)果,進(jìn)一步探究六君二陳解毒湯治療NSCLC的作用機(jī)制。

本研究通過(guò)對(duì)六君二陳解毒湯的藥物活性成分篩選分析發(fā)現(xiàn),槲皮素、柚皮素、β-谷甾醇等可能是六君二陳解毒湯治療NSCLC的主要活性成分。有研究表明,槲皮素可以調(diào)節(jié)SIRT1/AMPK信號(hào)通路誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞系自噬和凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。柚皮素能夠減少基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)表達(dá),抑制磷酸激酶B(AKT)的活性,降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力,減緩肺癌增殖進(jìn)程[6]。β-谷甾醇可以阻滯肺癌A549細(xì)胞周期,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。此外,β-谷甾醇通過(guò)下調(diào)硫氧還蛋白(Trx)/硫氧還蛋白還原酶(TrxR1)信號(hào)通路引起NSCLC細(xì)胞中的ROS依賴性細(xì)胞凋亡[8]。上述研究表明,六君二陳解毒湯通過(guò)多種藥物活性成分發(fā)揮治療NSCLC作用。

本研究通過(guò)PPI分析發(fā)現(xiàn),EGFR、PTEN、CAV1等靶點(diǎn)可能是治療NSCLC的核心靶點(diǎn)。EGFR是刺激DNA合成和影響細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲的主要驅(qū)動(dòng)因素[9]。其主要通過(guò)EGFR-Ras/Raf/MEK/ERK和EGFR-PI3K/AKT通路增加腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。此外,EGFR還能夠定位于細(xì)胞核以促進(jìn)細(xì)胞增殖,同時(shí)還能刺激多種促進(jìn)癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的基質(zhì)金屬蛋白酶發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用[10]。PTEN可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境,抑制細(xì)胞外基質(zhì)重塑,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11-12]。此外,PTEN還能夠負(fù)向調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/Akt通路,調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和遷移[13-14]。在高分化的NSCLC腫瘤中,高達(dá)70%的PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)與PI3K/AKT通路激活有關(guān)[15-16]。CAV1參與多種腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程,包括細(xì)胞遷移侵襲、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、血管生成等[17]。CAV1的表達(dá)量與肺癌細(xì)胞的增殖呈正相關(guān),CAV1表達(dá)下調(diào)可以阻滯細(xì)胞周期來(lái)抑制肺癌細(xì)胞的增殖[18]。研究表明,MCL1在癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)會(huì)破壞抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間的平衡,從而阻止癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,導(dǎo)致惡性增殖[19]。此外,MCL1的PEST結(jié)構(gòu)域與PH結(jié)構(gòu)域上的AKT相互作用以激活A(yù)KT,共同促進(jìn)肺癌進(jìn)展[20]。上述研究表明,六君二陳解毒湯作用于多靶點(diǎn)發(fā)揮治療NSCLC作用。

本研究對(duì)六君二陳解毒湯治療NSCLC進(jìn)行GO生物功能和KEGG通路富集分析,結(jié)果顯示NSCLC的發(fā)生發(fā)展主要與細(xì)胞凋亡,RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄,FAK、PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)控有關(guān)。六君二陳解毒湯可能通過(guò)下調(diào)細(xì)胞凋亡過(guò)程,上調(diào)RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄,調(diào)控細(xì)胞FAK、PI3K-Akt信號(hào)通路發(fā)揮治療NSCLC的作用。有研究表明,在一些惡性腫瘤中,FAK被激活而過(guò)度表達(dá)[21]。靶向FAK激酶結(jié)構(gòu)域的小分子抑制劑(如PF-573,228)現(xiàn)已被開(kāi)發(fā)為對(duì)NSCLC等癌癥的靶向治療方法[22-23]。PI3K/Akt信號(hào)通路與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。激活PI3K/Akt信號(hào)通路可抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤血管生成及腫瘤組織的侵襲和轉(zhuǎn)移[24]。上述研究表明,六君二陳解毒湯治療NSCLC是通過(guò)多條通路發(fā)揮治療作用的。

本研究采用Kaplan-Meier-Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析了六君二陳解毒湯作用于NSCLC核心靶點(diǎn)的生存曲線。結(jié)果表明,六君二陳解毒湯可能是通過(guò)降低EGFR、CAV1、PTEN、MET、RASA1、VCAM1基因表達(dá),增加MCL1基因表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。有研究表明,40%至80%的NSCLC預(yù)后不良患者與EGFR過(guò)度表達(dá)有關(guān)[25]。EGFR突變主要是外顯子19的缺失,外顯子21、密碼子858的亮氨酸替代精氨酸的點(diǎn)造成[26]。MCL1的過(guò)表達(dá)與腫瘤預(yù)后不良和耐藥性增強(qiáng)密切相關(guān)。MCL1 mRNA或蛋白的表達(dá)與多種癌癥類型的腫瘤進(jìn)展和患者不良結(jié)局有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),MCL1的擴(kuò)增可影響中國(guó)南方人群中NSCLC患者的OS[27]。在人NSCLC細(xì)胞的一個(gè)亞群中發(fā)現(xiàn)MCL1的過(guò)表達(dá)[28]。高水平的MCL1可以保護(hù)肺癌細(xì)胞,避免各種促凋亡行為刺激誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡[29]。上述研究表明,六君二陳解毒湯可以通過(guò)多靶點(diǎn)改善NSCLC患者的預(yù)后。

本研究基于分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證六君二陳解毒湯的主要藥物活性成分槲皮素、柚皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黃芩苷與核心靶點(diǎn)EGFR、MCL1、MET、RASA1、PARK2之間的相互作用。當(dāng)結(jié)合能小于0時(shí),表明配體與受體可以自行結(jié)合。結(jié)合能越低,氫鍵數(shù)量越多,結(jié)合就越穩(wěn)定,疾病靶點(diǎn)與藥物活性成分作用的可能性就越大。對(duì)接結(jié)果表明,β-谷甾醇能夠作用于MCL1而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤生長(zhǎng)。驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)六君二陳解毒湯藥物活性成分作用于NSCLC靶點(diǎn)的可行性。

本研究結(jié)果顯示,六君二陳解毒湯以多成分-多靶點(diǎn)-多通路的方式在NSCLC中發(fā)揮治療作用。