李天天,張先鈞,戴重陽,朱夢婷,鄧章昌,蒲小燕

(青海大學醫(yī)學部,西寧 810001)

有研究發(fā)現(xiàn),1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2D3]對肺組織損傷有良好的預防和保護作用[1-4],這提示1,25-(OH)2D3可能對HAPE具有較好的防治作用。本研究通過建立HAPE雄性大鼠模型,應用不同濃度的1,25-(OH)2D3干預大鼠。通過檢測大鼠相關指標和肺組織中炎癥因子及關鍵基因并觀察肺組織病理學變化,探究相關干預對雄性大鼠HAPE的防治效果及可能作用機制,初步明確1,25-(OH)2D3防治HAPE的最佳濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SD雄性大鼠(200 g～300 g)購于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心[許可證號:SCXK(陜)2019-0001]。本研究經青海大學醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準,實驗中所涉處理動物的操作均按照《實驗動物管理條例(GB14923-2010)》要求執(zhí)行。

1.1.2 實驗藥物及試劑

骨化三醇[1,25-(OH)2D3]軟膠囊購自青島正大制藥有限公司;Trizol Reagent、RNA反轉錄試劑盒,IL-1β、IL-6、TNF-α檢測試劑盒,熒光定量PCR試劑盒購自日本Ta Ka Ra公司;PCR引物購自南京金斯瑞生物科技有限公司;SOD、GSH-Px、MDA的ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物有限公司;RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒購自Beyotime公司;PVDF膜購自Sigma-Aldrich公司;β-actin、CYP27B1、VDR抗體和兔克隆抗體購自Ab clonal公司。

1.1.3 實驗儀器

低溫冷凍離心機(V28R)由Dynamica公司提供,多功能酶標儀和MyCycler PCR擴增儀及凝膠成像系統(tǒng)由BIO-Rad公司提供,實時熒光定量儀由Thermo Fisher公司提供,熒光顯微鏡由Nikon公司提供,全自動血氣分析儀由Sysmex公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組、給藥及模型建立

所有大鼠按隨機數(shù)字表法分為7組:對照組、低氧組和5個不同濃度組(低氧+濃度0.063 μg/kg組為A組;低氧+濃度0.126 μg/kg組為B組;低氧+濃度0.189 μg/kg組為C組;低氧+濃度0.252 μg/kg組為D組;低氧+濃度0.315 μg/kg組為E組),每組15只。對照組大鼠飼養(yǎng)于青海大學實驗動物房;將骨化三醇軟膠囊溶解于丙二醇、乙醇和水的混合溶劑中(60,10,30;V,V,V)[5]灌胃,1次/d,連續(xù)5 d;低氧組和5個濃度組大鼠置于青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學研究中心低壓氧艙(模擬海拔6 000 m,低氧脅迫48 h),構建HAPE大鼠模型,隨后降至海拔3 500 m進行生理指標的檢測,并從腹主動脈采血。實驗期間,大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境均達到如下要求:SPF環(huán)境,溫度為18℃～26℃,相對濕度為40%～60%,自由攝食及飲水(飲水瓶的瓶口加鋼珠)。出低壓氧艙時麻醉處死大鼠,于無菌條件下解剖,取標本暫存液氮,放置-80℃冰箱保存待測。

1.2.2 大鼠PAP及血氣指標測定

將大鼠麻醉后,切開大鼠腹部皮膚,經腹主動脈抽取全血1 mL,使用全自動血氣分析儀(Sysmex)測定PaO2、SaO2。切開頸部皮膚,分離右頸外靜脈,結扎遠心端,插入導管,使用Power Lab生理記錄儀觀察PAP波形的變化,并通過壓力傳感器收集PAP。

1.2.3 大鼠肺組織含水量(LWC)測定

麻醉處死大鼠后,取出左肺上葉組織,用生理鹽水沖洗兩遍,用無菌濾紙吸干表面水分后置于電子天平稱濕重[W(g)],用恒溫烘干箱(55℃)烘干(72 h)稱重[D(g)]。LWC百分比按Elliott計算[6],計算得出肺組織含水量公式:LWC(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.4 大鼠肺組織病理學變化觀測

取右下肺尖處肺組織(約5 mm×5 mm×5 mm大小),用預冷的生理鹽水洗凈血液,在4℃的4%多聚甲醛溶液中固定48 h,使組織充分展開。用常規(guī)方法制片。選擇三個視野采集顯微圖像,觀察肺組織的組織病理學變化。

1.2.5 大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平檢測

用ELISA法檢測大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平。取大鼠右上肺組織稱重后放入研磨器中勻漿,低溫離心10 min收集上清液,使用ELISA試劑盒測定肺組織SOD活力及GSH-Px活性和MDA的含量,建立標準曲線孔和檢測孔。使用酶標儀在450 nm波長處測量光密度,使用標準曲線計算SOD活力、GSH-Px活性和MDA濃度。

1.2.6 大鼠肺組織CYP27B1、VDR、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達量檢測

用RT-PCR法檢測關鍵基因CYP27B1、VDR、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達量。使用Trizol試劑提取肺組織總RNA,混勻并離心后取上清液,反轉錄成cDNA。然后采用RT-PCR法檢測肺組織中關鍵基因CYP27B1、VDR、IL-1β、IL-6、TNF -α mRNA的表達情況。按照Real-time Quality PCR試劑盒說明書進行操作,使用實時熒光定量儀分析結果,得出各個樣本的Ct值。引物(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)序列見表1。以β-actin作內參,采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達值。各個基因的表達值測量均重復3次。

表1 PCR引物序列

1.2.7 大鼠肺組織CYP27B1、VDR的蛋白表達水平檢測

1.3 統(tǒng)計學分析方法

2 結果

2.1 各組大鼠肺血流動力學和血氣變化情況

與對照組比,低氧組及A、B、C、E組大鼠PAP升高(P<0.05),D組大鼠PAP差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);低氧組及濃度由低到高組大鼠SaO2、PaO2呈降低趨勢(P<0.05)。與低氧組比,濃度由低到高組大鼠PAP呈降低趨勢(P<0.05),其中D組明顯降低(P<0.05);SaO2、PaO2呈升高趨勢(P<0.05),其中D組明顯升高(P<0.05)。各濃度組間相比有差異。見表2。

表2 各組大鼠PAP、PaO2及SaO2水平變化情況

2.2 各組大鼠肺組織LWC

與對照組比,低氧組及濃度由低到高組大鼠LWC升高(P<0.05),經1,25-(OH)2D3干預后,與低氧組比,濃度由低到高組大鼠LWC呈降低趨勢(P<0.05),其中D組明顯降低(P<0.05),各濃度組間有差異。見表3。

表3 各組大鼠肺組織

2.3 各組大鼠肺組織病理學變化情況

對照組大鼠的肺組織形態(tài)在光鏡下顯示結構正常:肺泡腔結構完整,未見炎性細胞浸潤,無水腫現(xiàn)象(圖1 A);低氧組大鼠肺組織出現(xiàn)缺氧性肺水腫現(xiàn)象,肺組織結構破壞,肺泡間隔增寬,紅細胞和炎性細胞浸潤(圖1B)。A、B組大鼠肺組織有輕度肺泡塌陷水腫現(xiàn)象,部分肺組織結構受損,伴有少量紅細胞與炎性細胞浸潤(圖1C、D);C、D、E組大鼠肺組織水腫減輕,肺泡結構趨于完整,紅細胞和炎性細胞減少,其中D組改善最為顯著(圖1E、F、G)。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色(400×)

2.4 各組大鼠肺組織氧化應激生化指標

與對照組比,低氧組大鼠SOD、GSH-Px降低(P<0.05),A、B、C、E組大鼠SOD降低(P<0.05),D組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),各濃度組大鼠GSH-Px降低(P<0.05),低氧組及各濃度組大鼠MDA升高(P<0.05)。與低氧組比,各濃度組大鼠SOD、GSH-Px升高(P<0.05),A組大鼠MDA差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),B、C、D、E組降低(P<0.05)。各濃度組間有差異。見表4。

表4 各組大鼠肺組織中SOD、GSH-Px、MDA含量變化情況

2.5 1,25-(OH)2D3對HAPE大鼠肺組織中的CYP27B1、VDR蛋白表達量的影響情況

與對照組比,低氧組CYP27B1蛋白表達水平升高(P<0.05)。與低氧組比,各濃度組CYP27B1蛋白表達水平呈降低趨勢(P<0.05),其中C組明顯降低(P<0.05)。與對照組比,低氧組VDR蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),各濃度組VDR蛋白表達水平升高(P<0.05),其中C組升高明顯(P<0.05)。與低氧組比,各濃度組VDR蛋白表達水平升高(P<0.05),其中C組升高明顯(P<0.05)。見圖2、表5。

A:對照組,B:低氧組,C:A組,D:B組,E:C組,F:D組,G:E組

表5 各組大鼠肺組織中CYP27B1、VDR蛋白表達含量

2.6 1,25-(OH)2D3對HAPE大鼠肺組織中的CYP27B1、VDR及IL-1β、IL-6、TNF -α mRNA表達的影響情況

與對照組比,低氧組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達升高(P<0.05),CYP27B1、VDR mRNA表達升高(P<0.05),A、C、E組CYP27B1 mRNA表達升高(P<0.05),B、D組CYP27B1 mRNA的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),各濃度組大鼠VDR mRNA表達升高(P<0.05)。與低氧組比,各濃度組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、CYP27B1 mRNA表達降低(P<0.05),VDR mRNA表達升高(P<0.05)。各濃度組間有差異。見表6、7。

表6 各組大鼠肺組織CYP27B1、VDR mRNA相對表達量

表7 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF -α mRNA相對表達量

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),1,25-(OH)2D3可明顯減輕低壓低氧所致的肺組織損傷。本研究結果顯示,1,25-(OH)2D3能夠顯著提高雄性大鼠肺組織中的SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量,提示1,25-(OH)2D3可能通過其抗氧化應激作用發(fā)揮對低氧脅迫所致大鼠肺損傷的保護作用。IL-1β、IL-6、TNF-α作為主要的促炎因子,在誘導炎性細胞浸潤和組織損傷中發(fā)揮重要作用,其活性的高低可以反映機體的炎癥損傷情況[7-9]。本研究發(fā)現(xiàn),1,25-(OH)2D3可使雄性大鼠肺組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平顯著降低,炎癥反應被抑制。綜上所述,1,25-(OH)2D3對雄性大鼠HAPE具有較好的防治效果。

1,25-(OH)2D3的免疫調節(jié)作用依賴于25-(OH)D3的激活并與特定組織中的VDR 結合[10]。CYP27B1是調控1,25-(OH)2D3生成的關鍵基因,負責將25-(OH)D3轉化為1,25-(OH)2D3[11]。研究證實,1,25-(OH)2D3和VDR通過負反饋機制調節(jié)CYP27B1水平[12-13]。本研究探究了各組大鼠肺組織CYP27B1和VDR的變化,結果顯示,低氧組大鼠肺組織CYP27B1 mRNA和蛋白水平顯著升高,VDR mRNA和蛋白水平顯著降低,1,25-(OH)2D3可下調CYP27B1、上調VDR,從而減輕炎癥和氧化應激反應致大鼠HAPE得以緩解。提示1,25-(OH)2D3通過調控CYP27B1、VDR的表達,發(fā)揮對HAPE的防治作用。

綜上所述,1,25-(OH)2D3可降低低氧環(huán)境下雄性大鼠肺組織LWC,減輕肺組織損傷,通過下調CYP27B1、上調VDR抑制促炎細胞因子的產生,降低氧化應激水平,有效預防大鼠HAPE的發(fā)生;初步確定了預防大鼠HAPE的最佳濃度為0.252 μg/kg。