余 瑤,李沁園,代冬芳,李鳳輝,段方林,馬莉娜,李長興

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部,西寧 810001)

研究發(fā)現(xiàn),藏藥二十五味鬼臼丸對雌性去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝平衡有影響,但無定量數(shù)據(jù)且影響機制不明。本課題擬通過大鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù)建立雌性去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型,研究藏藥二十五味鬼臼丸對去卵巢大鼠雌激素水平、骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)、骨生物力學(xué)的影響,探索其治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)的可能機制,以期拓寬藏藥二十五味鬼臼丸的臨床應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

48只SPF級3月齡SD雌性大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供,動物合格證號:SCXK(陜)2018-001。飼養(yǎng)于明暗交替、室溫為(22±1)℃ 的環(huán)境中,自由攝食(水)。本研究經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號QHDX2021000541)。

1.1.2 藥物與試劑

戊酸雌二醇片(BJL,拜耳醫(yī)藥保健有限公司,國藥準(zhǔn)字為J20171038);藏藥二十五味鬼臼丸(GJW,青海柴達木高科技藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字為Z63020209)。雌二醇(E2)、抗酒石酸酸性磷酸酶5 b(TRAP5b)、骨鈣素(OC)酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司,批號分別為MB-2116B、MB-1947A、MB-6757B),促黃體生成素(LH)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號為E-EL-R0026c),無機鈣ELISA試劑盒(上海臻科生物科技有限公司,批號為ZK-6898),TRAP/ALP雙重染色試劑盒(日本W(wǎng)ako公司,批號為294-67001)。

1.1.3 儀器

Centrifuge 5418R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);Ci-S型熒光顯微鏡(日本Nikon公司);Instron E10000萬能材料力學(xué)儀(美國Instron公司),多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 雌性去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型制備、分組及給藥

切除大鼠雙側(cè)卵巢建立雌性去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型。術(shù)前12 h禁食不禁水,稱定體質(zhì)量后,于腹腔注射麻醉,備皮,消毒,沿腹中線做2 cm～3 cm的切口打開下腹部,暴露腹腔后找到子宮,沿子宮向上探尋可見卵巢,摘除卵巢構(gòu)建雌性去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型[1]。術(shù)后注射(肌肉)青霉素,連續(xù)3 d,預(yù)防術(shù)后感染。術(shù)后第5 d對模型大鼠進行陰道涂片,每天1次,連續(xù)5 d,若不出現(xiàn)動情期反應(yīng)則表示造模成功。此外,另有部分大鼠術(shù)中只摘取卵巢附近的少許脂肪組織,不摘除卵巢,并在5 d后進行陰道涂片。

術(shù)后大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,隨機選取12只摘取脂肪組織的大鼠作為假手術(shù)組(Sham組),將去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠隨機分為模型組(OVX組,n=12)、雌二醇組(E2組,n=12)、藏藥二十五味鬼臼丸組(GJW組,n=12)。術(shù)后2 w開始灌胃給藥,E2組予戊酸雌二醇(0.1 mg·kg-1),GJW組予藏藥二十五味鬼臼丸(800 mg·kg-1),OVX、Sham組予同體積的生理鹽水,連續(xù)灌胃12 w,每日1次。

1.2.2 大鼠體質(zhì)量監(jiān)測

灌胃期間,每周稱取大鼠體質(zhì)量并記錄。

1.2.3 樣本制備

末次給藥后,大鼠禁食12 h,深度麻醉后,于腹主動脈取血離心(4℃、3 000 r/min、15 min),血清保存于-80℃冰箱。分離出大鼠的雙側(cè)股骨,去除左側(cè)骨組織周圍的肌肉和韌帶置凍存管,保存于-80℃冰箱,去除右側(cè)骨組織周圍的肌肉和韌帶放入4%多聚甲醛固定。

1.2.4 骨代謝相關(guān)生化、血清學(xué)指標(biāo)檢測

末次給藥后,于大鼠腹主動脈取血離心(4℃、3 000 r/min、15 min),血清保存于-80℃冰箱。采用ELISA法檢測血清OC、TRAP5b、Ca和E2、LH含量。

1.2.5 骨生物力學(xué)檢測

將大鼠左側(cè)股骨放在萬能材料力學(xué)試驗機檢測,測試時將樣本放置在兩個支撐橫桿處,載荷加載棒位于骨組織中央,每組樣品以勻速加載,直至樣品骨組織斷裂。檢測過程中實時記錄骨組織的相關(guān)指標(biāo)并繪制載荷-變形曲線,測得最大載荷、位移。

1.2.6 TRAP染色

將右側(cè)股骨分離固定在4%多聚甲醛中48 h,然后在pH為7.2的10%乙二胺四乙酸(EDTA)中脫鈣,持續(xù)10 w。然后將每個骨標(biāo)本冠狀面切割成4 μm厚的切片,在梯級乙醇溶液(80%、90%、95%、100%)中脫水,并包埋于石蠟中,將組織固定在普通玻片上,對切片(4 μm)進行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,用TRAP/ALP染色試劑盒標(biāo)記破骨細(xì)胞。染色后從每個層面隨機選擇股骨遠(yuǎn)端干骺端視野拍照。

1.2.7 電鏡掃描

將制備好的樣品放置在樣品臺后做真空處理,打開鎢絲燈,分別在 30、500、3 000的放大倍數(shù)下觀察股骨的骨小梁數(shù)目和排列情況,以及骨小梁表面的膠原纖維排列及走向情況。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)變化和血清激素水平變化(表1)

表1 大鼠骨代謝相關(guān)生化和血清激素水平

2.2 大鼠骨生物力學(xué)水平變化(表2)

表2 大鼠骨生物力學(xué)水平

2.3 大鼠股骨破骨細(xì)胞的變化(圖1,表3)

圖1 大鼠股骨破骨細(xì)胞染色圖(TRAP,200×)

表3 大鼠破骨細(xì)胞染色面積

破骨細(xì)胞前體TRAP染色呈陽性,Sham組的TRAP呈弱陽性,OVX組的TRAP呈強陽性,E2組與GJW組的呈弱陽性。在股骨骺線附近測量TRAP陽性占比面積,與Sham組比較,OVX組大鼠股骨陽性面積顯著增大(P<0.05);與OVX組比較,E2組大鼠股骨陽性面積顯著減小(P<0.05),GJW組大鼠股骨陽性面積顯著減小(P<0.05)。

2.4 大鼠股骨超微結(jié)構(gòu)變化(圖 2)

在低倍鏡下觀察大鼠的骨小梁數(shù)目及排列情況,在高倍鏡下觀察骨小梁表面以及骨膠原纖維的排列情況。低倍鏡下,與Sham組相比,OVX組骨小梁的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松,骨小梁變細(xì)且有裂痕,部分直接斷裂,骨吸收孔大小形狀不均衡;E2組骨小梁排列緊密,間距小,骨小梁粗細(xì)均勻、根根相連,立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整,骨吸收孔較小;GJW組骨立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)部分恢復(fù),骨小梁排列相對緊密,有部分裂痕,基本沒有斷裂面,吸收孔較小。在高倍鏡下,與Sham相比,OVX組骨小梁表面多凹凸不平,出現(xiàn)蟲蝕樣改變,骨膠原纖維排列雜亂;E2組骨小梁表面較為平整,骨膠原纖維走向規(guī)則;GJW組骨小梁表面有蟲蝕樣改變但相對較少,骨膠原纖維走向趨于整齊。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥與肝氣衰竭、腎氣不足密切相關(guān),《黃帝內(nèi)經(jīng)》指出若腎氣虧虛、臟腑虛弱會致全身血運不暢,無法滋養(yǎng)全身筋骨,導(dǎo)致骨病發(fā)生。絕經(jīng)期婦女肝腎易虛且雌激素水平逐漸下降,因此預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥需要護肝腎、同時補充雌激素。激素替代療法(HRT)極大地改善了這些狀況,然而長期使用HRT使乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和中風(fēng)等疾病的風(fēng)險增加[2]。補充副作用小的植物雌激素更易被人們所接受[3,4]。近年來,藏藥防治骨質(zhì)疏松的研究日益增多,郜靚[5]用復(fù)方牦牛骨粉對用維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥進行治療,發(fā)現(xiàn)其可增加Ca2+濃度和骨形成,使大鼠骨密度增加,骨量丟失明顯改善。雌性去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠用藏藥護骨十五丸治療時可增加骨小梁面積與骨皮質(zhì)指數(shù)比,增加骨鈣含量,提高股骨最大變形能力[6]。旺久[7]等人在骨質(zhì)疏松性骨折(OPF)動物模型中給予藏藥合劑珊瑚接骨丸能夠改善OPF大鼠骨折處骨組織形態(tài)學(xué),提高其骨密度及愈合后的骨生物力學(xué)特性。

眾所周知,雌激素的流失是女性骨質(zhì)流失的關(guān)鍵驅(qū)動因素,在某種程度上是男性骨質(zhì)流失的關(guān)鍵驅(qū)動因素。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生過程中,女性體內(nèi)的激素E2會下降,LH會反饋性上升[8,9]。激素水平的改變導(dǎo)致股骨骨密度的降低和股骨干骺端骨微結(jié)構(gòu)的破壞[10],在本實驗中,檢測大鼠體內(nèi)的雌激素水平和骨重塑標(biāo)志物后發(fā)現(xiàn),TRAP5b、OC、Ca發(fā)生不同程度的改變,體內(nèi)雌激素水平降低時,OC、Ca水平降低,TRAP5b水平升高,而給予GJW后,以上指標(biāo)會得到一定程度的改善。破骨細(xì)胞是一種大型多核細(xì)胞,具有造血功能,負(fù)責(zé)吸收骨基質(zhì),并由成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)[11],雌激素可以促進間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的骨生成分化和成骨細(xì)胞成熟,從而促進骨形成;除此之外,雌激素會抑制破骨細(xì)胞的形成,并誘發(fā)破骨細(xì)胞凋亡,這限制了骨的吸收,當(dāng)女性體內(nèi)的雌激素不足時,這些骨同化和抗骨碎屑作用會降低,導(dǎo)致持續(xù)的骨骼破壞[12]。本實驗對股骨的干骺端進行TRAP染色時,雌性去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的破骨細(xì)胞數(shù)明顯上升,經(jīng)GJW治療后破骨細(xì)胞數(shù)目趨近正常水平,使骨吸收和骨形成處于動態(tài)平衡,有效改善了雌性去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的癥狀。骨生物力學(xué)研究解釋多尺度骨結(jié)構(gòu)如何抵抗裂紋起始韌性和裂紋生長韌性時認(rèn)為,骨骼復(fù)雜的多尺度結(jié)構(gòu)是其機械行為的基礎(chǔ),骨骼結(jié)構(gòu)通過骨化過程產(chǎn)生,并通過骨代謝過程進行維持[13]?；谏锪W(xué)我們發(fā)現(xiàn),GJW能顯著增加雌性去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨抗壓縮、抗拉伸能力。骨頭在最小長度的尺度上通過變形來抵抗裂縫的啟動,當(dāng)骨骼在負(fù)荷下變形時,微裂紋的積累可以延伸到骨基質(zhì)的有機部分,改變骨礦化膠原纖維的走向,膠原纖維根據(jù)特定的應(yīng)變模式對齊,并具有不同的機械功能,使得骨骼能夠通過強大的抗骨折機制來承受復(fù)雜的生理負(fù)荷[14,15]。ANNA SHIPOV等發(fā)現(xiàn)[16],OVX大鼠的骨空隙在片狀區(qū)域和雜亂無章區(qū)域都明顯變小,OVX大鼠的這些形態(tài)變化可能會損害細(xì)胞間的通信,影響骨細(xì)胞-導(dǎo)管系統(tǒng)的功能,從而降低骨細(xì)胞在機械傳感和損傷修復(fù)中的有效性。本實驗采用電鏡觀察骨質(zhì)的細(xì)微表面發(fā)現(xiàn),OVX大鼠的骨小梁結(jié)構(gòu)及骨膠原纖維的改變與其研究結(jié)果一致,絕經(jīng)后雌激素缺乏對小梁骨和皮質(zhì)骨都有顯著影響,在骨質(zhì)疏松癥中起著至關(guān)重要的作用。GJW明顯逆轉(zhuǎn)雌激素缺乏帶來的骨質(zhì)破壞,改善骨代謝失衡導(dǎo)致的骨組織骨微結(jié)構(gòu)改變,可能與此有關(guān)。

綜上所述,藏藥二十五味鬼臼丸可通過調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物,抑制破骨細(xì)胞形成,調(diào)節(jié)骨代謝平衡,顯著改善雌性去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度和骨超微結(jié)構(gòu)。但本研究還存在一些局限性:(1)僅從血清代謝水平分析了藏藥二十五味鬼臼丸對雌性去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝指標(biāo)和性激素水平的影響。Labrie等人[17,18]發(fā)現(xiàn),老年男性的血清雌二醇水平高于絕經(jīng)后女性,雄激素和雌二醇循環(huán)水平的改變已被證明與低骨量和骨強度受損有關(guān)。男性ER-a的突變導(dǎo)致其產(chǎn)生雌激素抗性,從而引起骨質(zhì)疏松,骨小梁和皮質(zhì)骨密度降低,骨轉(zhuǎn)移標(biāo)志物增加,骨骺難以融合附體[19]。因此,藏藥二十五味鬼臼丸是否對雄性去睪丸大鼠的骨代謝指標(biāo)和性激素水平有相似的影響還需進一步驗證。(2)本研究中,與骨代謝相關(guān)信號通路中的代謝蛋白及基因尚待進一步檢測分析。骨代謝的動態(tài)平衡在維持正常骨組織功能方面發(fā)揮著重要作用。當(dāng)平衡被打破時,會出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥等骨代謝疾病。骨代謝過程受許多信號通路調(diào)節(jié),包括Wnt、Notch、Hedgehog通路和OPG/RANKL/RANK通路等,每個信號通路之間相互影響,參與骨骼發(fā)育和新陳代謝,與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化和增殖密切相關(guān)[20]?；诟鱾€信號通路在骨代謝中的作用,越來越多的研究人員關(guān)注骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制,并通過抑制或激活該信號通路來開發(fā)治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。然而,信號通路的復(fù)雜性致其作用機制不清。抑制信號通路的拮抗劑在臨床上的使用是有限的,因此,深入探索骨代謝與藥物共同作用途徑在骨代謝中的機制及其與其他信號途徑的關(guān)系,將為預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥提供新方法。