張雨薇,牛菊紅,劉川川,毛稼琦,張晴晴,劉 紅,陳 英#,馬 蘭*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生系,西寧 810001;2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心,西寧 810001;3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院包蟲病實(shí)驗(yàn)室,西寧 810001)

肺血管重構(gòu)是低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary artery hypertension,HPAH)形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,而導(dǎo)致肺血管重構(gòu)的重要原因之一是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Pulmonary artery smoothmuscle cells,PASMCs)的增殖。本研究擬探討如何以合適的聚乙二醇(polyethylene glycol 6000,PEG 6000)濃度提取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體(human umbilical cord mesenchymal stem cells exosome,hUCMSCs-exo),且觀察其對(duì)低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖的影響,探討低氧環(huán)境下外泌體(exosome,exo)的治療潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

PEG 6000粉劑(北京索萊寶公司,P8250),DMEM 高糖培養(yǎng)基(武漢Procell公司,PM150210),DMEM/F12培養(yǎng)基(武漢Procell公司,PM150312),100×青霉素-鏈霉素混合液(上海生工公司,penicillin-streptomycin mixed solution,PS,E607011-0100),胰蛋白酶溶液(武漢Procell公司,PB180224),胎牛血清(美國(guó)Gibco公司,fetal bovine serum,FBS,12483020),EdU試劑盒(上海碧云天公司,C0071S),BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)ThermoFisher公司,23225),內(nèi)參β-actin抗體(武漢Abclonal公司,AC026),核增殖抗原蛋白PCNA抗體(武漢Abclonal公司,A0264),外泌體純化柱(上海Umibio公司,UR52121)。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)ThermoFisher公司,Thermo HERAcell 150i),三氣培養(yǎng)箱(德國(guó)BINDER公司,BINDER CB53),蛋白電泳儀(美國(guó)Biorad公司,1645050),生物顯微鏡(德國(guó)蔡司Zeiss公司,Ax10 Axio),激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)蔡司Zeiss公司,LSM880),熒光顯微成像設(shè)備(日本Olympus Corporation公司,Olympus IX71),超靈敏多功能成像儀(美國(guó)Cytiva公司,Amersham Imager 600)。

1.2 方法

1.2.1 新生兒臍帶收集方法

從青海大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科收集長(zhǎng)期生活于青海西寧地區(qū)(海拔2 261米)的24～27歲漢族健康孕產(chǎn)婦新生兒臍帶組織5份,采集5～10 cm臍帶,用預(yù)冷的無菌生理鹽水沖洗后,置于預(yù)冷(4℃)含雙抗和1%血清白蛋白的轉(zhuǎn)移緩沖液里。

1.2.2 hUCMSCs的原代分離培養(yǎng)與免疫表型鑒定方法及誘導(dǎo)分化能力鑒定方法

1.2.2.1 hUCMSCs的原代分離培養(yǎng)方法

用無菌PBS沖洗臍帶組織3遍,將剝離臍動(dòng)脈和臍靜脈的組織塊用組織貼壁法均勻地貼在培養(yǎng)皿底部。用hUCMSCs專用完全培養(yǎng)基(DMEM/F12)培養(yǎng),48 h后棄未貼壁的組織塊,以后每3 d換液1次,3 w左右可長(zhǎng)出原代間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.2.2.2 hUCMSCs的免疫表型鑒定方法

取生長(zhǎng)良好的第3代hUCMSCs細(xì)胞,用胰蛋白酶消化后離心(800 r·min-1,5 min)。用PBS洗滌后,向細(xì)胞中分別加入PE-CD29、PE-CD90、PE-CD105、APC-CD44、APC-CD34、APC-CD45抗體避光孵育(4℃,30 min)。孵育結(jié)束用PBS洗滌兩次去除未結(jié)合抗體,并將細(xì)胞懸浮在200 μL PBS中。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hUCMSCs細(xì)胞表面抗原標(biāo)志的表達(dá)量。

1.2.2.3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力鑒定方法

成骨誘導(dǎo)分化:將6孔培養(yǎng)板提前用明膠包被,取第3代生長(zhǎng)良好的hUCMSCs細(xì)胞,用胰蛋白酶消化后接種于6孔(5×104個(gè)/孔)培養(yǎng)板中,24 h后更換為成骨誘導(dǎo)分化液(含10%FBS完全培養(yǎng)基和0.1 μM地塞米松、10 mM β-磷酸甘油及50 μg·mL-1抗壞血酸磷酸鹽)于恒溫培養(yǎng)箱(37°C,5% CO2)培養(yǎng),每3 d更換培養(yǎng)基1次。成骨誘導(dǎo)21 d后,使用4%多聚甲醛固定(室溫,30 min)。用PBS洗滌3次后,用茜素紅染液染色(室溫,30 min)。用PBS洗滌后,于顯微鏡下觀察成骨情況并拍照。

成脂誘導(dǎo)分化:將6孔培養(yǎng)板提前用明膠包被,取第3代生長(zhǎng)良好的hUCMSCs細(xì)胞,用胰蛋白酶消化后接種于6孔(5×104個(gè)/孔)培養(yǎng)板中,24 h后更換為成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化液(含10%FBS完全培養(yǎng)基和2 mM左旋谷氨酰胺、1 μM地塞米松、0.5 mM異丁基甲基黃嘌呤、0.5 mM吲哚美辛、10 μM胰島素)于恒溫培養(yǎng)箱(37℃,5% CO2)培養(yǎng),每3 d更換培養(yǎng)基1次。共誘導(dǎo)21 d。使用4%多聚甲醛固定(室溫,30 min),用油紅O染色液染色(30 min)。用PBS洗滌后,于顯微鏡下觀察成脂情況并拍照。

1.2.3 配制PEG溶液并提取hUCMSCs-exo的方法

1.2.4 hUCMSCs-exo鑒定方法

透射電鏡鑒定hUCMSCs-exo形態(tài):取20 μL重懸后的hUCMSCs-exo滴加于載樣銅網(wǎng)上,用2.5%戊二醛固定(1 min),靜置(室溫,5 min)后用濾紙從側(cè)面吸干液體,滴加4%醋酸雙氧鈾溶液(約20 μL)于銅網(wǎng)上敷染(室溫,5 min)。用濾紙吸干敷染液并烤干(白熾燈)后,于透射電子顯微鏡下觀察hUCMSCs-exo形態(tài)并拍照。

hUCMSCs-exo表面marker檢測(cè):通過Western Blot法標(biāo)記相應(yīng)蛋白,用電泳分離蛋白,并用5%的脫脂奶粉封閉(1 h),按照抗體說明書所示劑量加入稀釋倍數(shù)不同的CD63/Alix/TSG101一抗過夜(4℃),再用1×TBST洗3次(5 min/次),加入稀釋過的羊抗兔IgG二抗孵育(1 h)后用1×TBST洗3次(5 min/次)。用ECL發(fā)光試劑盒顯影、化學(xué)發(fā)光成像儀顯像。

1.2.5 BCA蛋白測(cè)定及hUCMSCs-exo提取方法

將hUCMSCs無血清培養(yǎng)上清液(共40 mL)混合均勻,分別取4份(10 mL/份)在hUCMSCs培養(yǎng)上清液中依次加入終濃度為10%、8%、6%、4%的PEG 6000溶液,按照BCA試劑盒說明書所示方法測(cè)定從不同濃度PEG 6000溶液中提取的hUCMSCs-exo濃度。

配置考馬斯亮藍(lán)染色液,測(cè)定從不同濃度PEG 6000溶液中提取的hUCMSCs-exo蛋白濃度。按照如下方法配制考馬斯亮藍(lán)染色液,R250配方(100 mL):考馬斯亮藍(lán)(R250) 0.25 g、甲醇45 mL、冰醋酸10 mL、ddH2O 45 mL;考馬斯亮藍(lán)脫色液配方(500 mL):甲醇125 mL、冰醋酸40 mL、ddH2O定容至500 mL。取用上述方法提取的hUCMSCs-exo 35 μg進(jìn)行凝膠電泳。待電泳結(jié)束后,切取含有Marker蛋白以及少許樣品的凝膠進(jìn)行染色,取凝膠放入適量考馬斯亮藍(lán)染色液中,確保染色液充分覆蓋凝膠,用微波爐加熱(1 min)后取出置于側(cè)擺搖床緩慢搖動(dòng)染色(室溫,1～2 h)。之后再用配置好的脫色液進(jìn)行脫色,直至藍(lán)色背景基本被洗脫,并且蛋白條帶染色效果達(dá)到預(yù)期。

1.2.6 hUCMSCs-exo內(nèi)化方法

將上述提取的hUCMSCs-exo用0.5 mL PBS重懸,以0.2 μm的濾頭過濾除菌后,加入0.5 mL PKH26(4μM)混合孵育(室溫,3 min)后用外泌體純化柱離心去除多余染料。然后將課題組之前凍存的第2代大鼠PASMCs復(fù)蘇并傳至第3代后與hUCMSCs-exo共培養(yǎng)24 h,24 h后用DAPI染細(xì)胞核,5 min后棄染料,并用PBS洗滌3次,最后用激光共聚焦顯微鏡觀察攝取情況。

1.2.7 PASMCs增殖和PASMCs增殖標(biāo)志物蛋白表達(dá)檢測(cè)方法

1.2.7.1 PASMCs增殖檢測(cè)(EdU法)

大鼠PASMCs用0.125%的胰蛋白酶消化后將大鼠PASMCs分為3組,分別為常氧對(duì)照組(C-con),O2體積分?jǐn)?shù)為21%;低氧對(duì)照組(H-con),O2體積分?jǐn)?shù)為1%;外泌體組(exo),O2體積分?jǐn)?shù)為1%,接種于3個(gè)24孔(1×104個(gè)/孔)細(xì)胞培養(yǎng)板。隨后,每孔加入終濃度為10 μmol·l-1的EdU,分別放置三氣培養(yǎng)箱和CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h,后續(xù)按照EdU說明書所示方法操作。共做6個(gè)復(fù)孔,在熒光顯微鏡下選擇6個(gè)復(fù)孔視野中央拍照,計(jì)算各組陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比值,比較各組陽性細(xì)胞率。

1.2.7.2 PASMCs增殖標(biāo)志物蛋白表達(dá)檢測(cè)(Western Blot法)

將大鼠PASMCs分為3組,分別為C-con、H-con、exo。收集各組細(xì)胞,加入適量RIPA裂解液于冰上裂解15 min,離心(4℃,12 000 r·min-1,10 min)后取上清液。用BCA蛋白定量法檢測(cè)樣品總蛋白濃度,放入金屬浴恒溫(99℃)器煮10 min后取蛋白樣品,按照20 μg/孔在10% SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后用180 mA恒流將凝膠上的蛋白及蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉(室溫1 h),再用TBST(pH為7.5)漂洗膜3次(5 min/次),加入β-actin、PCNA一抗抗體孵育(4℃,過夜)。用TBST緩沖液洗膜3次(10 min/次),加入用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗孵育(室溫,1 h)。用TBST緩沖液洗膜3次(10 min/次),用ECL超敏發(fā)光液在化學(xué)發(fā)光成像儀下檢測(cè)特異性免疫反應(yīng)蛋白條帶后,用Image J軟件分析條帶灰度值,計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7.3 PASMCs增殖檢測(cè)(cck-8法)

使用cck-8試劑盒檢測(cè)hUCMSCs-exo對(duì)PASMCs增殖的抑制率。將PASMCs用0.125%胰蛋白酶消化后,按照 5×103個(gè)/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,放入培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)培養(yǎng)(過夜)。待細(xì)胞貼壁后,加入無血清DMEM培養(yǎng)基作饑餓處理(24 h)。然后分別加入0、10、20、40、80、160、320 μg·mL-1的含hUCMSCs-exo的培養(yǎng)基后置三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(48 h)。隨后,每孔加入10 μL cck-8試劑孵育(37℃,1 h),用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)各組吸光度值,與空白對(duì)照組比較。

本研究經(jīng)青海大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020-03)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 hUCMSCs鑒定

2.1.1 hUCMSCs免疫表型鑒定(流式細(xì)胞術(shù))

流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果顯示,hUCMSCs高表達(dá)CD29(98.5%)、CD44(98.93%)、CD90(95.52%)、CD105(98%),幾乎不表達(dá)CD34(0.64%)、CD45(0.08%),如圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定圖

2.1.2 hUCMSCs成脂成骨分化能力(誘導(dǎo)液誘導(dǎo)其分化能力)鑒定

為觀察hUCMSCs的多向分化能力,加入誘導(dǎo)液觀察hUCMSCs成脂成骨能力。茜素紅染色和油紅O染色結(jié)果顯示,誘導(dǎo)21 d后經(jīng)油紅O染色的脂肪滴外觀如圖2A箭頭所指;21 d后,經(jīng)茜素紅染色的鈣結(jié)節(jié)外觀如圖2B箭頭所指。

A:脂肪滴(×40) B:鈣結(jié)節(jié)(×40)

2.2 hUCMSCs-exo的形態(tài)學(xué)觀察(透射電鏡觀察)

hUCMSCs-exo形態(tài)見圖3,圖中杯口狀小泡為hUCMSCs-exo顆粒,囊泡內(nèi)含有致密的云狀物質(zhì),為hUCMSCs-exo內(nèi)含物。

×30 000 ×6 000

2.3 從不同濃度PEG 6000溶液中提取的hUCMSCs-exo含量比較

將40 mL hUCMSCs無血清培養(yǎng)上清液混合均勻,分別取10 mL hUCMSCs培養(yǎng)上清液依次加入終濃度為10%、8%、6%、4%的PEG 6000溶液做電泳,將凝膠做考馬斯亮藍(lán)染色,如圖4,明顯看出從濃度為8%、10%的PEG 6000提取的exo蛋白條帶相較于6%、4%的exo蛋白條帶更加清晰。

圖4 電泳條帶圖

測(cè)定從不同濃度PEG 6000溶液中提取的hUCMSCs-exo濃度結(jié)果顯示,當(dāng)PEG 6000溶液濃度為10%時(shí),所提取的hUCMSCs-exo濃度最高,為4.86 μg·mL-1,見表1。

表1 不同濃度PEG 6000溶液所含hUCMSCs-exo濃度

2.4 hUCMSCs-exo表面標(biāo)記物鑒定

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,從PEG 6000溶液中提取的hUCMSCs-exo中的CD63、Alix、TSG101如圖5所示。圖5說明所提取的樣品中存在hUCMSCs-exo。

圖5 Western Blot電泳條帶圖

2.5 hUCMSCs-exo內(nèi)化

激光共聚焦顯微鏡下顯示,由PKH26標(biāo)記的hUCMSCs-exo被PASMCs攝取,hUCMSCs-exo聚集在PASMCs內(nèi),如圖6所示。

圖6 激光共聚焦顯微圖

2.6 hUCMSCs-exo抑制

EdU檢測(cè)結(jié)果顯示,與C-con組比,H-con組的PASMCs在48 h內(nèi)增殖的數(shù)量明顯增多,exo組可顯著降低低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖(P<0.05),見表2、圖7。Western Blot法結(jié)果顯示,與C-con組比,H-con組細(xì)胞的PCNA表達(dá)升高;與H-con組比,經(jīng)hUCMSCs-exo干預(yù)后的PCNA表達(dá)水平降低(P<0.05),見表3、圖8。與對(duì)照組比,10、20、40μg·mL-1組的細(xì)胞吸光度值沒有明顯差異,而80、160、320μg·mL-1組的細(xì)胞吸光度值明顯降低(P<0.05),見表4。

表2 各組細(xì)胞增殖情況

表3 各組細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)蛋白表達(dá)情況

表4 hUCMSCs-exo對(duì)PASMCs活力的影響

圖7 各組細(xì)胞增殖圖

圖8 各組細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)蛋白表達(dá)圖

3 討論

缺氧環(huán)境可以導(dǎo)致PASMCs增生肥大、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積,致肺血管重塑,使肺動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變,進(jìn)而引發(fā)HPAH。有研究表明,抑制PASMCs增殖可以抑制血管重構(gòu),從而緩解HPAH疾病的發(fā)展[1-2],因此,尋找能夠抑制PASMCs增殖的方法成為學(xué)科研究重點(diǎn)。

hUCMSCs是典型的成體干細(xì)胞之一,與其他來源的干細(xì)胞相比,具有免疫原性低、易獲取且易于體外擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)[3]。移植后的干細(xì)胞可通過旁分泌起作用,其所分泌的hUCMSCs-exo對(duì)機(jī)體具有重要保護(hù)作用。hUCMSCs-exo是一種攜帶大量功能性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物物質(zhì)和mRNA、miRNA、DNA等生物分子,可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的分子,可調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生命活動(dòng)[4]。hUCMSCs-exo通過受體配體結(jié)合,以及與受體細(xì)胞胞膜直接結(jié)合或相互融合的方式,調(diào)節(jié)受體細(xì)胞,起到傳遞生物信息的作用[5-6]。

從hUCMSCs上清液中分離出高純度且生物活性良好的exo是相關(guān)研究的首要環(huán)節(jié)。目前,提取exo的方法很多,包括超速離心法、凝膠排阻層析法、免疫親和層析法、試劑盒提取法[7]。上述方法均存在不足:超速離心法耗時(shí)且對(duì)設(shè)備要求高;凝膠排阻層析法提取到的exo純度較低;免疫親和層析法提取到的exo量較低;試劑盒提取法價(jià)格昂貴。由于exo的大小和密度與病毒類似,分離病毒或病毒載體常用PEG 6000[8-9],且已有研究使用PEG沉淀法成功提取exo[10]。因此,本研究選用相關(guān)方法提取并純化exo。

本研究通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)觀察了hUCMSCs-exo對(duì)低氧誘導(dǎo)的PASMCs的增殖抑制作用。EdU、cck-8、WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示,經(jīng)hUCMSCs-exo處理后大鼠的PASMCs增殖被抑制。提示hUCMSCs-exo具有抑制低氧誘導(dǎo)大鼠PASMCs增殖的能力。有學(xué)者通過建立野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓小鼠模型證明[11],胞外囊泡發(fā)揮治療作用主要是通過exo實(shí)現(xiàn)的,靜脈注射含exo的培養(yǎng)上清液可以阻止低氧誘導(dǎo)的PAH的血管重建,但是注射無exo的hUCMSCs培養(yǎng)上清液無此作用[12]。

綜上所述,本研究用PEG 6000沉淀法提取到的hUCMSCs-exo可抑制低氧誘導(dǎo)的大鼠PASMCs增殖,此結(jié)論為后續(xù)的相關(guān)機(jī)制研究提供了思路、奠定了基礎(chǔ)。