王 醫(yī),宋 健,孟凱強(qiáng),郝 鏡,沈舒文,林先佳,趙唯含,景 琛

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,陜西 咸陽 712046;2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712000)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)是臨床常見的消化系統(tǒng)疾病,其主要病理特征是胃黏膜固有腺體萎縮,常與腸上皮化生(intestinal metaplasia,IM)和胃上皮內(nèi)瘤變(gastric intraepithelial neoplasia, GIN)合并。已獲廣泛認(rèn)可的胃癌的進(jìn)展模式為:正常胃黏膜→慢性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變→高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變→胃癌[1]。因此,積極治療CAG和GIN是防治胃癌發(fā)生的重要策略。

在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中,國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)沈舒文教授根據(jù)胃癌前病變的證候,創(chuàng)造性地提出“毒瘀交阻胃絡(luò)”為胃癌前病變的核心病機(jī)。自擬方金果胃康膠囊由半枝蓮、朱砂七、太子參、枸橘組成,治療胃癌前病變療效確切、使用安全[2]。本課題組前期對(duì)金果胃康膠囊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)金果胃康膠囊可能通過調(diào)控miR-216b/beclin-1信號(hào)通路,從而促進(jìn)細(xì)胞自噬,起到保護(hù)胃黏膜且治療胃癌前病變的作用[3],但目前只局限于某一通路或者某一靶點(diǎn)研究金果胃康膠囊治療胃癌前病變的機(jī)制,這與通過多靶點(diǎn)、多通路調(diào)節(jié)疾病的中藥復(fù)方機(jī)制不符。符合中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論特點(diǎn)并基于系統(tǒng)藥理學(xué)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),通過整體、系統(tǒng)地觀察藥物,為研究中藥方劑復(fù)雜化學(xué)體系與病證復(fù)雜生物系統(tǒng)的相互作用提供了新的視角和思路[4-6]。因此,本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫,擬開展關(guān)于金果胃康膠囊治療胃癌前病變的基礎(chǔ)性研究,旨在探討金果胃康膠囊在胃炎-癌轉(zhuǎn)化CAG及GIN階段的潛在活性成分及作用機(jī)制,探究金果胃康膠囊在胃癌前病變的分子通路,為其基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1金果胃康膠囊活性化學(xué)成分的收集 金果胃康膠囊由半枝蓮、太子參、朱砂七、枸橘組成,借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、中藥綜合數(shù)據(jù)庫TCMID(http://www.Megabionet.org/tcmid/)、上海有機(jī)所化學(xué)數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索“半枝蓮”“太子參”“黃藥子”“枸橘”得到中藥化學(xué)成分信息。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中,參照文獻(xiàn)[7],將相關(guān)參數(shù)設(shè)置為:口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%及類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18,收集符合條件的活性成分,并將多個(gè)數(shù)據(jù)庫收集的活性成分進(jìn)行合并去除重復(fù)。

1.2金果胃康膠囊活性成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、化源網(wǎng)(https://www.chemsrc.com/)及查閱文獻(xiàn)獲得活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu),將其保存為sdf格式,并導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)中,限定研究對(duì)象為人類(Homo sapiens),進(jìn)行潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè),借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)對(duì)化合物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范。

1.3疾病靶點(diǎn)的獲取 登陸在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)(https://omim.org/)、GenCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),分別以關(guān)鍵詞“chronic atrophic gastritis”“gastric intraepithelial neoplasia”檢索CAG及GIN的相關(guān)蛋白,并分別將各數(shù)據(jù)庫獲取的疾病相關(guān)蛋白合并去重。

1.4金果胃康膠囊成分-疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為明晰金果胃康膠囊藥物相關(guān)靶點(diǎn)與CAG、GIN靶點(diǎn)間的相互作用,利用微生信平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)分別繪制金果胃康膠囊與CAG、GIN相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖,得到交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRlNG 11.5平臺(tái)(https://cn.string-db.org/),蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”進(jìn)行篩選,構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)模型。然后運(yùn)用cytoscape 3.7.1軟件把PPI網(wǎng)絡(luò)可視化,并利用其內(nèi)置Network Analyzer插件,得出各節(jié)點(diǎn)度(Degree)值,計(jì)算其中位數(shù),篩選出大于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值中位數(shù)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析 把金果胃康膠囊治療作用對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?qū)隡etascape平臺(tái)(http://metascape.org/gp/index.html),設(shè)置P<0.01,進(jìn)行GO和KEGG富集分析。根據(jù)P值排序,分別篩選前20項(xiàng)KEGG通路和前20項(xiàng)GO功能,借助微生信平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)可視化分析。

1.6金果胃康膠囊成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 獲得交集靶點(diǎn)后,對(duì)化合物進(jìn)行反向篩選,去除靶點(diǎn)中不含交集基因的化合物。將上述金果胃康膠囊的活性成分及其靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果、作用通路為節(jié)點(diǎn),在Excel表格中建立相互對(duì)應(yīng)關(guān)系,然后導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.1軟件,構(gòu)建金果胃康膠囊“化合物-靶標(biāo)-通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理圖,并通過Network Analyzer插件分析有效成分及靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)度(Degree)、中心度(BetweennessCentrality,BB)、緊密度(ClosenessCentrality,CC)等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù),判斷金果胃康膠囊的重要化學(xué)成分核心靶蛋白。

1.7金果胃康膠囊中藥成分與重要靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證 將1.4項(xiàng)下篩選出的靶點(diǎn)中Degree值排名前五的靶點(diǎn)與1.6項(xiàng)下篩選出的靶點(diǎn)中Degree值排名前五的靶點(diǎn)取交集,將所得靶點(diǎn)作為受體,將1.6項(xiàng)下篩選出的主要成分作為配體,進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接使用的蛋白晶體結(jié)構(gòu)從PDB(https://www.rcsb.org)數(shù)據(jù)庫中下載獲得;小分子的3D結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫下載獲得,并在MMFF94力場(chǎng)下進(jìn)行能量最小化。使用PyMol 2.5去除所有受體水分子、鹽離子和小分子。使用PyMol基于晶體配體的位置定義對(duì)接盒子的中心,并使對(duì)接盒子包裹蛋白活性位點(diǎn)。此外,使用Open Babel 3.1.1(http://openbabel.org/wiki/ Main_Page)將所有處理好后的小分子以及受體蛋白轉(zhuǎn)換為AutoDock Vina 1.1.2對(duì)接必需的pdbqt格式。最后采用AutoDock Vina 1.1.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接工作,對(duì)接時(shí),全局搜索的詳盡度設(shè)為32,其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。最后利用PyMol 2.5對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1金果胃康膠囊活性化學(xué)成分的收集及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 從TCMSP數(shù)據(jù)庫中共收集到半枝蓮29個(gè)成分、太子參8個(gè)化學(xué)成分、朱砂七15個(gè)化學(xué)成分。由于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)枸橘的成分研究較少,因此通過確認(rèn)、校正從TCMID數(shù)據(jù)庫及上海有機(jī)所化學(xué)數(shù)據(jù)庫中檢索得到的成分,并且補(bǔ)充文獻(xiàn)報(bào)道2次以上的成分,共得到枸橘18個(gè)化合物[8-13]。由于TCMSP數(shù)據(jù)庫中未收錄枸橘,因此不采用常規(guī)的成分篩選指標(biāo)OB、DL,保留全部成分。結(jié)果見表1。

2.2中藥活性成分靶點(diǎn)與CAG、GIN相關(guān)蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果 從Siwss Target Prediction數(shù)據(jù)庫收集作用靶點(diǎn),以Probability值為篩選條件,收集金果胃康膠囊作用靶點(diǎn)共251個(gè)。從GenCards、OMIM數(shù)據(jù)庫獲得CAG疾病靶標(biāo)787個(gè);獲得GIN疾病靶標(biāo)1 643個(gè)。利用韋恩圖獲得金果胃康膠囊與CAG的交集靶點(diǎn)60個(gè),與GIN交集靶點(diǎn)88個(gè),見圖1。隨著胃炎-癌轉(zhuǎn)化進(jìn)程,對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)數(shù)量增加。

表1 金果胃康膠囊主要成分

續(xù)表

2.3金果胃康膠囊成分-疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò) 將金果胃康膠囊與CAG、GIN的交集靶點(diǎn)分別導(dǎo)入STRING 11.5數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,去除游離靶點(diǎn),利用cytoscape 3.7.1軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化,如圖2、圖3所示,圖中節(jié)點(diǎn)面積越大、顏色越深表明其對(duì)疾病的影響越大。CAG PPI網(wǎng)絡(luò)包括59個(gè)靶蛋白節(jié)點(diǎn),共有529條邊,邊代表蛋白與蛋白之間的相互作用。由網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)數(shù)據(jù)可知化合物的中位度數(shù)為15,篩選出度值≥15的關(guān)鍵靶點(diǎn),推測(cè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、胱天蛋白酶3(CASP3)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)可能是金果胃康膠囊治療CAG的重要靶點(diǎn)。GIN PPI網(wǎng)絡(luò)包含87個(gè)靶蛋白節(jié)點(diǎn),共有921條邊,由網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可知化合物的中位度數(shù)為17,篩選出度值≥17的關(guān)鍵靶點(diǎn),推測(cè)雌激素受體1(ESR1)、TNF、AKT1、CASP3、EGFR可能是金果胃康膠囊治療GIN的重要靶點(diǎn)。金果胃康膠囊治療CAG、GIN的共有靶點(diǎn)47個(gè),如EGFR、AKTI、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、TNF、CASP3。

圖1 金果胃康膠囊-CAG、GIN韋恩圖

2.4靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析 運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路分析,根據(jù)KEGG功能注釋,按P值大小篩選前出20條注釋,借助微生信平臺(tái)繪制氣泡圖;根據(jù)GO功能分析,篩選前20條注釋,繪制條形圖,如圖4所示。KEGG通路富集分析顯示,CAG及GIN共有通路137條,例如癌癥通路(Pathways in cancer)、蛋白多糖腫瘤通路(Proteoglycans in cancer)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、內(nèi)分泌抵抗(Endocrine resistance)、人巨細(xì)胞感染(Human cytomegalovirus infection)、微小核糖核酸腫瘤通路(MicroRNAs in cancer)等。CAG及GIN共同參與的生物學(xué)過程為蛋白磷酸化(protein phosphorylation)、激酶活性的調(diào)節(jié)(regulation of kinase activity)、細(xì)胞遷移正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cell migration)等。隨著疾病的進(jìn)展,金果胃康膠囊在胃炎-癌轉(zhuǎn)化過程中,涉及的生物學(xué)過程明顯增加,且金果胃康膠囊參與治療疾病的通路增加。

圖2 金果胃康膠囊-CAG靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 金果胃康膠囊-GIN靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5金果胃康膠囊成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖 借助Cytoscape 3.7.1構(gòu)建金果胃康膠囊成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖,如圖5所示,通過Network Analyzer插件對(duì)圖5進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?獲得核心成分及核心作用靶點(diǎn)。金果胃康膠囊治療CAG、GIN的共同活性成分多達(dá)40種,其中山奈酚(Kaempferol)、槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)等為主要成分,見表2。金果胃康膠囊對(duì)CAG、GIN的共同作用靶點(diǎn)有26個(gè),其中EGFR、AKT1等為主要靶點(diǎn),見表3。圖5表明,半枝蓮、朱砂七包含作用于CAG及GIN階段的癌癥通路及蛋白多糖腫瘤通路中的單體和化合物多,表明兩味中藥,尤其是半枝蓮的增減可能對(duì)金果胃康膠囊的有效性影響較大,可為之后的臨床用藥提供參考。如表4所示,在CAG及GIN階段,金果胃康膠囊的核心通路均為癌癥通路、蛋白多糖腫瘤通路及人巨細(xì)胞病毒感染等,與根據(jù)P值篩選的KEGG所得CAG及GIN相關(guān)通路結(jié)果相似,隨著疾病的進(jìn)展,Degree值增加,表明金果胃康膠囊對(duì)疾病的影響增加。

注:A:CAG GO BP分析;B:CAG KEGG分析;C:GIN GO BP分析;D:GIN KEGG分析

表2 金果胃康膠囊主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表3 金果胃康膠囊主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表4 金果胃康膠囊主要活性成分通路網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

2.6分子對(duì)接驗(yàn)證 對(duì)接模擬技術(shù)是探究小分子與目標(biāo)靶點(diǎn)相互作用的便捷有效手段。通過篩選,在CAG階段,將EGFR、AKT1分別與Kaempferol、 Quercetin、檸檬苦素(Limonin)、 Luteolin對(duì)接;在GIN階段,將EGFR與Kaempferol、Quercetin、Luteolin、5-羥基-7,8-二甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)色原酮[5-hydroxy-7,8-dimethoxy-2-(4-methoxyphenyl)chromone]對(duì)接。如圖6所示。通過

注:A:CAG通路網(wǎng)絡(luò)圖;B:GIN通路網(wǎng)絡(luò)圖

PDB平臺(tái)獲取對(duì)接靶點(diǎn)的PDB ID:EGFR(PDBID:6VH4)、AKT1(PDBID:6S9W)。部分靶標(biāo)蛋白對(duì)接分?jǐn)?shù)平均值見表5。使用AutoDock Vina 1.1.2軟件對(duì)化合物與各個(gè)目標(biāo)蛋白進(jìn)行對(duì)接研究。如表所示,結(jié)合親和力為負(fù)數(shù)表示存在結(jié)合的可能,通常數(shù)值小于-6 kcal/mol被認(rèn)為結(jié)合可能性較大。如表5所示,可知所有分子與靶蛋白的結(jié)合親和力都低于-6 kcal/mol,意味著它們之間結(jié)合效果較好。AKT1-Luteolin、AKT1-Limonin、AKT1-Quercetin以及EGFR-Limonin結(jié)合能在-9.5 kcal/mol以下。分子對(duì)接結(jié)果表明,山奈酚、槲皮素、檸檬苦素、木犀草素可能是金果胃康膠囊治療CAG過程中發(fā)揮療效的關(guān)鍵成分;山奈酚、槲皮素、木犀草素、5-羥基-7,8-二甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)色原酮可能是金果胃康膠囊治療GIN的關(guān)鍵成分。分子對(duì)接結(jié)果可以為今后進(jìn)一步開展復(fù)方研究提供數(shù)據(jù)支撐。

3 討 論

表5 部分靶標(biāo)蛋白對(duì)接分?jǐn)?shù)平均值

胃癌的發(fā)病率和病死率居世界惡性腫瘤的第2位[14],對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。胃癌前病變演變至胃癌需要相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間,因此,如果能對(duì)胃癌前病變進(jìn)行有效的干預(yù),胃癌的發(fā)生率與病死率將會(huì)大大降低。目前,臨床尚無治療胃癌前病變的特異性藥物,而中醫(yī)藥以其個(gè)體化治療對(duì)胃癌前病變效果顯著[15]。胃癌前病變屬中醫(yī)胃痞、胃脘痛等病證范疇。沈舒文教授認(rèn)為“毒瘀交阻,氣陰兩虛”為本病的常見證候之一,自擬復(fù)方金果胃康膠囊具有散熱解毒、化瘀益氣的功效。方中君藥枸橘長(zhǎng)于理氣散結(jié),其性辛苦,善治胃脹胃痛,有研究表明枸橘中所含的枸橘苷對(duì)胃癌細(xì)胞有抑制作用[16]。半枝蓮作為臣藥具有清熱解毒、活血化瘀的功效,主要針對(duì)胃絡(luò)瘀血。臣藥朱砂七,又名黃藥子,性苦寒,具有清熱解毒、散瘀止痛的功效,可增強(qiáng)本方治胃痛的效果。

金果胃康膠囊治療CAG的有效成分與治療GIN的有效成分多有重合,隨著疾病的進(jìn)展,治療GIN的有效成分增多,且增多部分的有效成分主要來自半枝蓮。提示在臨床應(yīng)用上,在GIN階段的患者半枝蓮用量可適當(dāng)增加。金果胃康膠囊治療CAG及GIN的有效成分主要是山柰酚、槲皮素、木犀草素,屬黃酮類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃酮類化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理活性,該化合物將在藥品開發(fā)領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)隨著山奈酚干預(yù)濃度的升高,胃癌細(xì)胞中P53基因表達(dá)水平顯著提高,PARP1表達(dá)水平逐漸降低,胃癌細(xì)胞凋亡數(shù)目逐漸增加,從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖[19]。同時(shí),通過抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)通路、PI3K-AKT通路,山柰酚可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[20],但對(duì)正常的胃細(xì)胞無顯著影響。同屬黃酮類化合物的槲皮素,能使胃上皮GES-1細(xì)胞免受氧化損傷,從而發(fā)揮胃保護(hù)作用[21]。任虹等[22]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過作用于表皮生長(zhǎng)因子受體抑制腫瘤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的分泌,從而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲。耿威等[23]研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可通過激活Cav-1蛋白的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。有研究發(fā)現(xiàn)木犀草素主要是通過PI3K/AKT等信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞的形成及促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡[24]。陸雪瑩等[25]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可以調(diào)節(jié)免疫功能,同時(shí)下調(diào)生長(zhǎng)因子A(VEGR-A)和MMP-9的表達(dá)對(duì)胃癌移植瘤起抑制作用。在CAG及GIN階段,山柰酚及槲皮素對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)最多,二者主要來源于朱砂七及半枝蓮,分子對(duì)接結(jié)果表明山柰酚、槲皮素與主要靶點(diǎn)EGFR、AKT1結(jié)合性強(qiáng),所以預(yù)測(cè)二者為本方治療CAG、GIN的主要作用成分。

通過1.4項(xiàng)及1.6項(xiàng)的篩選,發(fā)現(xiàn)金果胃康膠囊治療CAG的靶點(diǎn)是EGFR、AKT1、TNF、MMP-9;治療GIN的靶點(diǎn)是EGFR、AKT1、TNF。隨著疾病的進(jìn)展,金果胃康膠囊治療GIN的靶點(diǎn)明顯增加,表明金果胃康膠囊可能對(duì)GIN的治療效果更好。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)對(duì)胃黏膜具有保護(hù)作用,研究發(fā)現(xiàn)胃長(zhǎng)期炎癥狀態(tài)可使其受體EGFR過表達(dá),一旦EGFR與EGF結(jié)合,細(xì)胞異常分裂導(dǎo)致腸化、異型增生、胃癌,所以目前認(rèn)為CAG的發(fā)展與EGFR的過表達(dá)相關(guān)[26-27]。EGFR屬受體絡(luò)氨酸激酶(receptors tyrosine kinase, RTKs)家族,在胃腺癌中可呈現(xiàn)出不同程度的表達(dá),亦有實(shí)驗(yàn)顯示RTKs抑制劑可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[28-29]。作為PI3K和AKT蛋白的下游抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL,其異常表達(dá)可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,而這一過程是通過二聚化后的EGFR刺激Ras蛋白導(dǎo)致磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)[30-31]。EGFR與AKT1可通過EGFR/PI3K/Akt信號(hào)通路聯(lián)結(jié),共同發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。TNF是一種多功能細(xì)胞因子,其功能的多態(tài)性可明顯增加胃癌或者慢性萎縮性胃炎的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[32]。已有研究表明胃惡性腫瘤患者血清TNF濃度較正常人群高,在胃癌組織中TNF-αmRNA的轉(zhuǎn)錄會(huì)明顯增加[33]。有研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞外基質(zhì)降解和腫瘤細(xì)胞基膜的突破是腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的主要原因,而MMP-9是細(xì)胞外基質(zhì)降解中最關(guān)鍵的蛋白水解酶,所以MMP-9與腫瘤形成密切相關(guān)。

注：基于對(duì)接獲得的小分子-蛋白結(jié)合模式,圖中青色stick為小分子,藍(lán)色cartoon為蛋白,綠色虛線表示pipi-共軛作用,藍(lán)色線表示氫鍵作用,灰色虛線表示疏水作用。a:AKT1-Kaempferol;b:AKT1-Limonin;c:AKTI-Luteolin;d:AKT1-Quercetin;e:EGFR-5-hydroxy-7,8-dimethoxy-2-(4-methoxy-phenyl)chromone;f:EGFR-Kaempferol;g:EGFR-Limonin;h:EGFR-Luteolin;i:EGFR-Quercetin

通過GO功能富集分析可知,金果胃康膠囊主要是通過酶活性的調(diào)節(jié)、蛋白磷酸化、細(xì)胞遷移正向調(diào)節(jié)等生物過程,生物調(diào)節(jié)、新陳代謝、繁殖過程等生物學(xué)模式來治療CAG及GIN。且金果胃康膠囊治療CAG及GIN階段的生物過程、信號(hào)通路也極為相似,推斷金果胃康膠囊治療CAG及GIN 階段的作用機(jī)制相似。在CAG及GIN階段,KEGG信號(hào)通路分析主要富集通路為癌癥通路、蛋白多糖腫瘤通路、內(nèi)分泌抵抗、PI3K-Akt信號(hào)通路、人巨細(xì)胞感染等。其中以癌癥通路及蛋白多糖腫瘤通路與相關(guān)靶點(diǎn)的關(guān)系最為密切,由此可推測(cè)金果胃康膠囊可能主要通過以上2條通路發(fā)揮治療作用。此外,PI3K-Akt信號(hào)通路為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑,活化后可以抑制多種刺激,從而誘發(fā)胃癌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展、血管生成和轉(zhuǎn)移[34]。徐江江等[35]通過實(shí)驗(yàn)得出,異常激活PI3K/AKt信號(hào)通路可能導(dǎo)致其在胃癌干細(xì)胞中的高表達(dá),進(jìn)而引起胃癌的發(fā)生。有研究表明,P13K-Akt信號(hào)通路與CAG的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系,其作用機(jī)制為:上調(diào)NF-κB、TNF-α、JNK等促炎因子表達(dá)水平,加重炎癥反應(yīng),進(jìn)一步損傷胃黏膜[36],致使胃炎—癌轉(zhuǎn)化。而金果胃康膠囊發(fā)揮作用的內(nèi)分泌抵抗途徑,則是由作為人體最大內(nèi)分泌器官的消化系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。胃腸激素調(diào)控胃腸道功能是通過內(nèi)分泌途徑及腔分泌等途徑實(shí)現(xiàn)的[37]。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明,胃泌素能顯著促進(jìn)胃腸道黏膜細(xì)胞和某些惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[38-39]。已有研究證明,人巨細(xì)胞病毒DNA在胃癌組織中的陽性率明顯高于癌旁健康組織[40-41],后續(xù)關(guān)于金果胃康膠囊治療胃癌前病變的研究可重點(diǎn)圍繞人巨細(xì)胞病毒感染展開。

綜上,CAG與GIN均屬胃癌前病變,GIN是CAG進(jìn)一步發(fā)展,且CAG往往伴有GIN。隨著疾病的進(jìn)展,金果胃康膠囊治療GIN的靶點(diǎn)及有效成分顯著多于CAG階段,提示金果胃康膠囊治療GIN優(yōu)于CAG,增多部分的有效成分主要來自于半枝蓮及朱砂七,提示在臨床應(yīng)用上,隨著疾病的進(jìn)展,可適量增加半枝蓮及朱砂七的用量。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果,提示在CAG與GIN階段,金果胃康膠囊發(fā)揮治療作用的主要成分、作用靶點(diǎn)及作用通路較為相似,說明金果胃康膠囊作用于CAG、GIN的作用機(jī)制相似。金果胃康膠囊治療CAG、GIN的可能機(jī)制是:①通過下調(diào)AKT1、CASP3水平,下調(diào)促炎因子MMP-9的水平,抑制TNF炎性因子的表達(dá),抑制EGFR的過表達(dá),從而減少炎癥對(duì)胃黏膜的刺激和抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖;②抑制癌癥通路、蛋白多糖腫瘤通路,并且抑制PI3K-Akt信號(hào)通路過度激活來抑制下游抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá),抑制惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度所發(fā)現(xiàn)的金果胃康膠囊相關(guān)通路及靶點(diǎn)可為該方今后的探討提供理論支撐,但需要后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。