馬文欣,劉 暢,虎 娜,海小明,劉自鈺,夏 鉑

(寧夏醫(yī)科大學(xué),寧夏 銀川 750000)

脊髓損傷是一種破壞性中樞神經(jīng)損傷,可導(dǎo)致主要的運動、感覺和自主神經(jīng)功能障礙[1]。脊髓損傷可分為原發(fā)性和繼發(fā)性,脊髓因外力而挫傷、撕裂或因血管損傷而出現(xiàn)神經(jīng)損傷通常稱為原發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷發(fā)生后,大量神經(jīng)細胞死亡,血-脊髓屏障被破壞,隨后發(fā)生一系列損傷反應(yīng),如血管痙攣出血、活性氧形成、脂質(zhì)過氧化、炎癥反應(yīng)、凋亡等,導(dǎo)致二次級聯(lián)反應(yīng),進一步加重損傷[2-3]。目前治療脊髓損傷的方法主要有手術(shù)治療、藥物治療、高壓氧治療和物理治療,但治療效果和預(yù)后均不佳。中醫(yī)內(nèi)治法用于脊髓損傷的治療研究顯示可促進神經(jīng)功能恢復(fù),改善患者肢體運動功能[4]。中醫(yī)外治法烙灸療法是一種治療脊髓損傷的新型療法,該療法通過刺激脊髓周圍的神經(jīng),加強其與大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的聯(lián)系,激活脊髓組織的愈合和保護機制,從而促進脊髓損傷大鼠后肢運動和感覺功能的恢復(fù)[5-6],但其作用機制仍有待明確。研究發(fā)現(xiàn),作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的信號通路之一,Wnt信號通路不僅參與了神經(jīng)元突觸的形成、血管再生和維持血腦屏障的完整性等多種生理功能[7],還可能在一些成年組織(包括脊髓)的穩(wěn)態(tài)和疾病進展中起著至關(guān)重要的作用[8]。當(dāng)Wnt信號通路激活時,通過促進脊髓損傷后的前后軸突活化再生,從而緩解神經(jīng)損傷[9]。因此本研究通過觀察烙灸療法對脊髓損傷大鼠Wnt信號通路的影響,以期為臨床上烙灸療法治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級成年雄性SD大鼠60只,體重230～280 g,由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(寧)2020-0001。大鼠在安靜環(huán)境下飼養(yǎng),給予充足飼料和飲用水,室溫20～22 ℃,相對濕度約45%,保持動物房內(nèi)晝夜節(jié)律。實驗過程符合寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會標準(IACUC-NYLAC-2021-004)。

1.2主要試劑與儀器 巢蛋白(Nestin)抗體(DF7754,Affinity),神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(#80788,Cell Signaling Technology),黏附連接蛋白(β-catenin)抗體(#8480),糖原合成激酶-3(GSK-3β)抗體(#12456,Cell Signaling Technology);端錨聚合酶抑制劑 (IWR-1,HY-12238,MCE,美國);脊髓打擊器(型號:68097,深圳市瑞沃德生命科技有限公司),光學(xué)顯微鏡 (LEICA,德國),Image-lab圖像分析系統(tǒng)和Image-Pro圖像分析系統(tǒng)(BIORADHERCULES,美國),石蠟切片機(RM2235,德國Leica公司),全波長酶標儀(Epoch,BioTek公司,美國)。

1.3實驗方法 將60只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、烙灸組、西藥組、Wnt抑制劑組和Wnt抑制劑+烙灸組,每組10只。假手術(shù)組大鼠麻醉后打開T9椎板再逐層縫合,其余組大鼠采用撞擊T9椎板方法建立脊髓損傷模型。具體造模參照文獻[10]實驗方法:采用1%戊巴比妥鈉(20 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后將其俯臥位固定于手術(shù)臺上,備皮消毒,以T11椎體棘突作為定位標志,行背正中切口,切開皮膚,鈍性剝離肌肉,暴露T8～11棘突及椎板,用單關(guān)節(jié)骨剪咬去T8～11棘突及T9椎板,充分暴露脊髓,使用脊髓打擊器(撞針直徑2.5 mm,撞錘質(zhì)量為15 g,撞錘下落高度20 cm)對T9節(jié)段進行撞擊,以大鼠出現(xiàn)身體扭曲、后肢回縮撲動及尾部痙攣性擺動為造模成功。造模成功后,采用0.9%氯化鈉溶液沖洗傷口,逐層縫合并包扎傷口,消毒后將大鼠置于恒溫臺等待蘇醒。術(shù)后單籠飼養(yǎng),每日2次腹部按摩輔助排尿,直到自主排尿。西藥組于建模后0.5 h給予20 mg/kg 醋酸潑尼松注射,之后按照4.9 mg/(kg·d)繼續(xù)干預(yù);Wnt抑制劑組于建模后0.5 h在損傷部位皮下注射40 μg/(kg·d)IWR-1;烙灸組于建模后24 h在損傷部位局部進行烙灸:將大鼠俯臥置于固定器內(nèi),雙側(cè)后肢拉直固定,確定損傷大鼠兩側(cè)夾脊穴(距損傷上下端兩個椎體的棘突間隙旁開距中線3～4 mm 處)后,將特制烙灸器(W形薄鐵皮灸槽,長度略超出損傷脊柱長度,帶有手柄)蓋在該部位,將艾絨放入灸槽內(nèi)點燃,通過鐵器將熱傳導(dǎo)于患處,使局部發(fā)紅為宜,避免燙傷,1次/d,每次5 min;Wnt抑制劑+烙灸組于建模后0.5 h在損傷部位皮下注射40 μg/(kg·d)IWR-1,然后按照烙灸組方法進行烙灸。各組均連續(xù)干預(yù)28 d。

1.4標本采集與處理 干預(yù)28 d并完成BBB運動評定量表評定[11]和斜板試驗后,處死各組大鼠,每組取5只全身灌注多聚甲醛后,以脊髓損傷為中心取縱向離損傷點長約1 cm脊髓段,制成石蠟包塊用于HE染色、免疫組化檢測;每組剩余大鼠,以脊髓損傷為中心取長約2 cm脊髓段放入EP管中,液氮速凍,-80 ℃保存,用于Western blot檢測。

1.5觀察指標及方法

1.5.1后肢運動功能 于脊髓損傷術(shù)后第3,7,14,21,28天,由2名不知曉實驗分組的觀察者采用BBB運動評定量表[11]評定各組大鼠后肢運動功能,評估的指標主要包括各個關(guān)節(jié)的活動情況、跨步能力、協(xié)調(diào)性與軀干平衡能力等,評分范圍0～21分,0分為無運動功能,21分為正常運動功能,二人背對背進行,取平均值作為每只大鼠運動功能的最終得分。

1.5.2斜板試驗 于脊髓損傷術(shù)后第7,14,21,28天對各組大鼠進行斜板試驗。具體方法:在長方形木板上,將大鼠頭部朝前,身體縱軸與傾斜板縱軸垂直放置,逐步增加傾斜板與水平面之間的夾角,以大鼠在斜板上停留5 s不掉落為標準,測定記錄傾斜平面臨界角度即斜板角度。

1.5.3脊髓組織病理形態(tài) 將取出的脊髓組織經(jīng)脫水和石蠟包埋后切片,厚度為5 μm,脫蠟后用蘇木素及伊紅染色,于鏡下觀察脊髓組織病理形態(tài)。

1.5.4脊髓組織中Nestin、β-catenin、GFAP和GSK-3β蛋白表達情況 分別采用免疫組化法和Western blot法檢測。①免疫組化法:將5 μm石蠟切片脫蠟入水,經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水,利用檸檬酸進行微波修復(fù)抗原、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷、血清封閉后滴加 Nestin(1∶250)、β-catenin(1∶400)、GFAP(1∶400)和GSK-3β(1∶400),4 ℃過夜;PBS漂洗后加入二抗孵育40 min,PBS漂洗后DAB 顯色,蘇木素復(fù)染,鹽酸乙醇分化,沖洗返藍,脫水、透明、中性樹膠封固,顯微鏡下觀察并拍片。②Western blot法:取凍存的脊髓組織,加入裂解液(配比按照凱基全蛋白提取試劑盒)研磨10 min,應(yīng)用BCA 法測總蛋白濃度(凱基BCA試劑盒),SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫下封閉1.5 h,加入Nestin(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、GFAP(1∶1 000)和GSK-3β(1∶1 000),4 ℃過夜;TBST洗滌后加入二抗 (1∶20 000)常溫反應(yīng)1 h,曝光。采用Image-lab圖像分析系統(tǒng)和Image-Pro圖像分析系統(tǒng)計算相對表達量。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠BBB運動功能評分和斜板角度 各造模組大鼠 術(shù)后各時間點的BBB評分和斜板角度均明顯低于同期假手術(shù)組(P均<0.05),隨術(shù)后時間延長,除Wnt抑制劑組的BBB評分和斜板角度無明顯變化外,其余各造模組大鼠的BBB評分和斜板角度均呈遞增趨勢;其中烙灸組和西藥組大鼠術(shù)后第7,14,21,28天的BBB評分均明顯高于同期模型組、Wnt抑制劑組、Wnt抑制劑+烙灸組(P均<0.05),術(shù)后第21,28天的斜板角度均明顯高于同期模型組、Wnt抑制劑組、Wnt抑制劑+烙灸組(P均<0.05)。見圖1。

2.2各組大鼠脊髓組織病理學(xué)形態(tài) 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常,灰質(zhì)未見彌漫性水腫。模型組、Wnt抑制劑組、Wnt抑制劑+烙灸組大鼠的脊髓背側(cè)白質(zhì)和中央灰質(zhì)均有嚴重損傷,組織呈海綿狀,細胞壞死,可見炎性細胞浸潤,內(nèi)見空洞形成,神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,胞體結(jié)構(gòu)不完整,顏色淺淡,組織炎性反應(yīng)較重。烙灸組和西藥組大鼠的脊髓結(jié)構(gòu)較清晰,細胞水腫及壞死較輕,空洞面積較小,神經(jīng)元數(shù)量比模型組多,神經(jīng)元胞體較大,結(jié)構(gòu)相對完整。見圖2。

圖2 各組大鼠脊髓組織HE染色形態(tài) (A×20;B×100)

2.3各組大鼠脊髓組織中Nestin、β-catenin、GFAP和GSK-3β蛋白表達情況 Nestin、β-catenin、GFAP和GSK-3β的表達主要出現(xiàn)在大鼠脊髓組織中的中央管周圍、前角、后角部位。GFAP和Nestin在假手術(shù)組大鼠脊髓組織中有極少量陽性細胞即細胞質(zhì)染色,GFAP在烙灸組、西藥組可見不同程度的棕褐色染色, 與假手術(shù)組比較,模型組、Wnt抑制劑組和Wnt抑制劑+烙灸組染色更深。Nestin在烙灸組、西藥組、模型組、Wnt抑制劑組和Wnt抑制劑+烙灸組表達染色顯著增強,且烙灸組和西藥組棕黃色染色較模型組、Wnt抑制劑組和Wnt抑制劑+烙灸組染色更重。β-catenin和GSK-3β在假手術(shù)組、西藥組和烙灸組中都可見黃色、棕褐色不同程度的染色,且與假手術(shù)組比較,模型組、Wnt抑制劑組和Wnt抑制劑+烙灸組染色較淺。模型組、Wnt抑制劑組和Wnt抑制劑+烙灸組脊髓組織中Nestin和GFAP蛋白相對表達量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05),β-catenin和GSK-3β蛋白相對表達量均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05);西藥組和烙灸組脊髓組織中Nestin、 β-catenin、GSK-3β蛋白相對表達量均明顯高于模型組、Wnt抑制劑組和Wnt抑制劑+烙灸組(P均<0.05),GFAP蛋白相對表達量均明顯低于模型組、Wnt抑制劑組和Wnt抑制劑+烙灸組(P均<0.05);Wnt抑制劑+烙灸組β-catenin蛋白表達量明顯高于模型組(P<0.05),Nestin、GFAP和GSK-3β蛋白表達量與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3及圖4。

圖3 各組大鼠脊髓組織中Nestin、β-catenin、GFAP和GSK-3β蛋白陽性表達情況(免疫組化染色,×400)

圖4 各組大鼠脊髓組織中Nestin、β-catenin、GFAP和GSK-3β蛋白表達情況

3 討 論

脊髓損傷為最常見的致殘性損傷,其病理過程復(fù)雜,與機體炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)平衡破壞及神經(jīng)細胞凋亡加快等均有關(guān)[12]。中醫(yī)學(xué)認為脊髓損傷是因為外力損傷督脈,致使氣亂血逆,瘀阻經(jīng)絡(luò),氣血不能溫煦濡養(yǎng)肢體所致[13]。烙灸將熱、宣、泄、善法集于一體,用刺激性藥物或大小、形狀不同金屬器械燒熱后,直接置于經(jīng)絡(luò)穴位皮膚上烙灼肌膚,作用于組織經(jīng)絡(luò),起到消炎、鎮(zhèn)痛、促進血液循環(huán)、增強機體代謝的作用[14];且該療法具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡作用,能夠抑制脊髓損傷局部的炎癥反應(yīng)和脊髓神經(jīng)細胞的凋亡,改善脊髓損傷后下肢功能[15]。

本實驗結(jié)果顯示,模型組大鼠的后肢運動功能受到影響,脊髓組織出現(xiàn)明顯水腫,結(jié)構(gòu)損傷嚴重并伴有大量空洞形成;烙灸干預(yù)后,大鼠后肢運動功能改善,損傷脊髓組織水腫和炎性細胞浸潤程度明顯減輕,壞死及空洞范圍縮小。提示烙灸療法可促進脊髓損傷大鼠運動功能的恢復(fù),可明顯減輕脊髓損傷程度。

Nestin是一種中間絲類型的蛋白,由脊髓中央管中的室管膜細胞表達,其為神經(jīng)發(fā)育中神經(jīng)干細胞的分子標記物之一[16]。GFAP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細胞活化的生物標志物,存在于白質(zhì)和灰質(zhì)的星形膠質(zhì)骨架中[17],以單體形式存在。Nestin和GFAP參與了脊髓損傷過程,并且都能對創(chuàng)傷性損傷作出反應(yīng),當(dāng)脊髓受到損傷時二者表達水平均顯著升高。Wnt信號通路作為一種普遍存在的信號級聯(lián),參與多種疾病的生理和病理過程,該通路調(diào)控著增殖、自噬、炎癥、器官發(fā)生和再生等關(guān)鍵過程,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后的神經(jīng)發(fā)育、突觸發(fā)生及神經(jīng)元生長、分化和存活中發(fā)揮重要作用[9]。GSK-3β和β-catenin是Wnt信號通路中至關(guān)重要的信號分子。在典型Wnt/β-catenin信號通路中,機體沒有出現(xiàn)Wnt配體,通路中的每一種蛋白都正常表達時,軸蛋白(Axin)會結(jié)合β-catenin,Axin同時已結(jié)合有GSK3和腺瘤性息肉病結(jié)(APC),于是GSK3就可以磷酸化β-catenin,β-catenin接著能夠被APC復(fù)合物泛素化并降解,此時無法入核啟動下游基因轉(zhuǎn)錄[18]。夏鉑等[5]研究證實,脊髓損傷后進行烙灸可激活Wnt通路,出現(xiàn)Wnt配體時,Wnt受體會結(jié)合Axin,β-catenin不會結(jié)合Axin,也就不會接觸GSK3以及APC,于是入核啟動下游基因轉(zhuǎn)錄,從而促進神經(jīng)元增殖分化,通過與損傷軸突形成連接,進一步促使軸突加速生長,達到神經(jīng)修復(fù)目的。本實驗結(jié)果顯示,烙灸組GSK-3β和β-catenin蛋白表達明顯增加,GFAP蛋白表達減少,提示烙灸可激活Wnt/β-catenin信號通路,促進損傷脊髓軸突再生,抑制受傷脊髓中的星形膠質(zhì)細胞瘢痕形成。

綜上所述,烙灸療法可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路,促進脊髓損傷大鼠脊髓軸突再生和神經(jīng)元存活,從而促進脊髓損傷后的神經(jīng)修復(fù),為該療法用于脊髓損傷的治療提供了一定理論基礎(chǔ)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。