宋 毅，李銀濤，常維山，王祥錕，撒瑞雪，劉建華*，苗立中

（ 1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000 ； 2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271000 ；3. 中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730000 ； 4. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600 ）

大腸桿菌是一種廣泛分布于人、家禽、反芻動物、寵物及野生動物胃腸道中的革蘭氏陰性菌[1]。雖然大多數(shù)大腸桿菌與宿主共生，但該菌的某些血清型獲得了一些毒性相關(guān)基因后能夠引起腸道或腸外疾病[2]。其中引起腸外疾病的大腸桿菌稱為腸外致病性大腸桿菌（ExPEC），是一種重要的人畜共患病病原體，可在哺乳動物和鳥類中引起廣泛的感染[3]，鴨是ExPEC的宿主[4-5]。鴨肉是動物源性高品質(zhì)蛋白質(zhì)來源，含有大量的維生素、微量元素、必需和非必需氨基酸[6]，肉鴨在我國東部沿海地區(qū)具有較大養(yǎng)殖規(guī)模。近年來，農(nóng)村非集約化養(yǎng)殖快速發(fā)展，大腸桿菌病呈高發(fā)、多發(fā)態(tài)勢。但預(yù)防和治療過程中，細菌耐藥性持續(xù)增強、多藥耐藥菌株不斷出現(xiàn)[7]。污染鴨肉的大腸桿菌對人類具有致病性；此外，治療細菌性疾病時，人和鴨使用的部分抗菌藥物一致，提示存在相同耐藥背景的耐藥菌產(chǎn)生和多藥耐藥菌傳遞的風(fēng)險，而鴨也被認為是潛在的耐藥菌儲藏庫[8]。本文以山東部分地區(qū)鴨源大腸桿菌為研究對象，了解當?shù)伉喸创竽c桿菌的耐藥性及相關(guān)耐藥基因攜帶情況，以期為獸醫(yī)臨床合理用藥提供參考，同時也為鴨源大腸桿菌耐藥性監(jiān)測提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

36株大腸桿菌來源：山東省濟南市（6株）、山東省德州市（9株）、山東省濱州市（11株）、山東省泰安市（10株）。

1.1.2 主要試劑及儀器

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物科技有限公司）；2×Tap PCR Master Mix（索萊寶生物科技有限公司）；瓊脂糖（北京沃比森科技有限公司）；DNA Marker DL2000（賽國生物科技有限公司）。

HZ-98A 恒溫振蕩器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、SW-CJ-2D 雙人單面超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、GSX1梯度PCR擴增儀（美國Eppendorf公司）、DYY-7C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）、WD-9413A 凝膠成像分析系統(tǒng)（北京市六一儀器廠）、XHF-30L電壓式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）。

1.1.3 引物設(shè)計（見表1）

表1 引物信息Tab.1 Primer information

參照文獻[9-10]設(shè)計大腸桿菌phoA靶基因及待測耐藥基因引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.4 藥敏紙片

藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）包括氨基糖苷類：安普霉素（APR）、新霉素（NEO）、丁胺卡那（AK）、慶大霉素（CN）；β-內(nèi)酰胺類：頭孢噻呋（EFT）、頭孢曲松（CRO）；林可酰胺類：林可霉素（LCM）；氯霉素類：氟苯尼考（FFC）；磺胺類：磺胺甲惡唑（SMZ）；四環(huán)素類：多西環(huán)素（DOX）、土霉素（OTC）；氟喹諾酮類：恩諾沙星（ENR）、環(huán)丙沙星（CIP）、甲磺酸加替沙星（GAME）、氟甲喹鈉（FLSO）；多肽類：硫酸黏菌素（CT）；青霉素類：氨芐西林（AMP）；其他：利福平（RFP）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離與鑒定

將采集樣品置于TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。用接種環(huán)蘸取菌液劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃溫箱培養(yǎng)16 h，平板上生長出鮮桃紅色、圓形、扁平、表面光滑且濕潤的菌落，可初步判斷為大腸桿菌。

挑取單個菌落于TSB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12 h后，取1.5 mL 菌液通過煮沸裂解法提DNA 模板，利用PCR 擴增大腸桿菌特異性phoA基因。

PCR 擴增體系（12.5 μL）：2×TapPCR Master Mix 6.25 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL、ddH2O 補至12.5 μL。

PCR 擴增條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃終延伸10 min。

將出現(xiàn)目的條帶的陽性樣品送生工測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對分析。

1.2.2 藥敏試驗

采用紙片擴散法檢測分離菌耐藥性。將新鮮菌液均勻涂布于TSA平板，將14種藥敏紙片貼于TSA平板表面，37 ℃溫箱培養(yǎng)14 h，記錄抑菌圈大小并判定敏感程度。

1.2.3 耐藥基因檢測

利用PCR技術(shù)對分離菌進行下列耐藥基因的檢測，包括β-內(nèi)酰胺類耐藥基因：blaTEM、blaSHV；氨基糖苷類耐藥基因：aac(3')-Ⅰa、aac(3')-Ⅱc、aac(3')-Ⅳ、aph(2')-Ⅰb、aph(3')-Ⅱ、aph(3')-Ⅳ、aph(3')-Ⅶ、aadA1；喹諾酮類耐藥基因：qnrA、qnrB、qnrD、oqxA；磺胺類耐藥基因：Sul1、sul3；四環(huán)素類耐藥基因：tet(B)、tet(C)；氯霉素類耐藥基因：cmlA、floR；大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因：ermF。

PCR 擴增體系（12.5 μL）：2×TapPCR Master Mix 6.25 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL、ddH2O 補至12.5 μL。

PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性45 s，退火30 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸45 s，72 ℃終延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離鑒定結(jié)果

對采集的220份病死鴨肝組織樣品進行大腸桿菌的分離鑒定。結(jié)果顯示，共分離鑒定出大腸桿菌36株，分離率為16.4%。

2.2 大腸桿菌分離株耐藥率分布（見圖1）

由圖1可知，分離株對氨芐西林、土霉素、氟甲喹鈉、磺胺甲惡唑、林可霉素耐藥情況嚴重，耐藥率分別為75.0%（27/36）、63.9%（23/36）、58.3%（21/36）、58.3%（21/36）、52.8%（19/36）；對氟苯尼考和新霉素的耐藥率分別為41.7%（15/36）和33.3%（12/36）；丁胺卡那、硫酸慶大霉素、頭孢曲松、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、利福平、頭孢噻呋、恩諾沙星、安普霉素耐藥率分布在11.1%～27.8%；對硫酸黏菌素、甲磺酸加替沙星高度敏感。

2.3 大腸桿菌分離菌多藥耐藥情況及耐藥譜型（見圖2、表2）

圖2 大腸桿菌分離株多藥耐藥情況Fig.2 Multidrug resistance of Escherichia coli isolates

表2 大腸桿菌分離株耐藥譜型Tab.2 Drug resistance profile of Escherichia coli isolates

由圖2 可知，分離株多藥耐藥在1～7 耐、10～12 耐及14 耐均有分布，其中3 耐最多，占比22.2%；其次是5 耐和10 耐，占比均為13.9%；除1 耐、6 耐占比為11.1%外，其余多藥耐藥率均未超過10.0%。

由表2 可知，于36 株鴨及鴨胚源大腸桿菌中共檢出34 種耐藥譜。其中3 耐最多，共8 種，菌株為：DZ1、DZ3、DZ7、TA1、TA7、TA8、BZ3、BZ6。其次是5 耐和10 耐，各5 種。5 耐菌株為：TA4、TA9、BZ5、BZ8、BZ9；10 耐菌株為：JN3、JN4、JN6、BZ4、BZ11。

1耐譜型以O(shè)TC為主，DZ6、DZ9、TA6菌株只對OTC耐藥，TA10菌株僅對AMP 耐藥。6 耐譜型菌株為：JN2、JN5、TA5、BZ7；4 耐譜型菌株為：DZ5、DZ8、BZ2；7 耐譜型菌株為：DZ2、DZ4；12 耐菌株為：BZ1、BZ10。2 耐、11 耐、14 耐譜型菌株分別為：TA2、JN1、TA3。

2.4 大腸桿菌分離菌耐藥基因檢測結(jié)果（見圖3）

圖3 大腸桿菌分離株耐藥基因檢測結(jié)果Fig.3 Detection results of drug resistance genes of Escherichia coli isolates

由圖3 可知，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因以blaTEM為主（100.0%，36/36）；氨基糖苷類耐藥基因以aadA1 為主（86.1%，31/36），其次是aph(3')-Ⅶ（55.6%，20/36）、aph(3')-Ⅳ（30.6%，11/36）、aac(3')-Ⅳ（13.9%，5/36）；磺胺類耐藥基因以sul1 為主(100.0%，36/36)，其次是sul3（16.7%，6/36）；喹諾酮類耐藥基因以oqxA為主(100.0%，36/36)，其次是qnrD（33.3%，13/36）、qnrB（5.6%，2/36）；氯霉素類耐藥基因以floR為主(100.0%，36/36)；四環(huán)素類耐藥基因以tet（C）為主（36.1%，13/36）；其余耐藥基因均未檢出。

3 討論

大腸桿菌是腸道共生菌，同時也是病原體，可導(dǎo)致人類、鳥類和其他動物的腸道和腸外感染。在不同的病料中大腸桿菌的分離率存在顯著差異。本試驗結(jié)果顯示，從山東采集的220份鴨樣本中分離鑒定出36株大腸桿菌，分離率為16.4%，提示該地區(qū)鴨和鴨胚中大腸桿菌的流行率（16.4%）高于韓國家禽的感染率（4.6%）[11]和安徽?。?3.6%）[12]的分離率，但低于江蘇省（45.3%）和江西?。?7.3%）的分離率[13]。結(jié)果表明，山東部分地區(qū)與其他省市相比大腸桿菌感染情況并不嚴重，與山東地區(qū)近幾年[14-16]報道的大腸桿菌分離率幾乎一致。

臨床中抗生素的廣泛使用是導(dǎo)致大腸桿菌對多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的重要原因。本研究中分離菌對氨芐西林、土霉素、氟甲喹鈉、磺胺甲惡唑、林可霉素耐藥情況嚴重，耐藥率分別為75.0%（27/36）、63.9%（23/36）、58.3%（21/36）、58.3%（21/36）、52.8%（19/36）；對氟苯尼考和新霉素的耐藥率分別為41.7%（15/36）和33.3%（12/36）。駱延波等[17]試驗結(jié)果顯示，氨芐西林對大腸桿菌的抑菌率較低。周佳等[18]試驗結(jié)果表明，大腸桿菌對氨芐西林耐藥。以上結(jié)果與本試驗大腸桿菌耐藥情況基本一致。本研究中，大腸桿菌對丁胺卡那、硫酸慶大霉素、頭孢曲松、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、利福平、頭孢噻呋、恩諾沙星、安普霉素較為敏感，耐藥率在11.1%～27.8%之間，與泰州地區(qū)雞源大腸桿菌對丁胺卡那和頭孢噻呋的敏感率相似，但對其他抗菌藥物的敏感度與前人調(diào)查結(jié)果有所不同[19]。山東地區(qū)兔源大腸桿菌對氟苯尼考的敏感率為100%[20]，山西地區(qū)牛源大腸桿菌對慶大霉素的耐藥率為62.50%[21]，四川地區(qū)不同動物源大腸桿菌均對利福平高耐藥[22]，以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果差異較大，可見不同地區(qū)、不同動物源的分離菌對同種抗生素的耐藥性性存在較大差異。

本試驗共檢出10 種耐藥基因，其中blaTEM、aadA1、sul1、oqxA、floR較為流行（100.0%）。鄧翔文等[23]發(fā)現(xiàn)，福州地區(qū)寵物犬源大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥基因以blaTEM為主。吳立婷[24]發(fā)現(xiàn)，揚州地區(qū)貓源大腸桿菌100%攜帶blaTEM，以上結(jié)果與本研究結(jié)果相似。顧曉曉等[25]研究發(fā)現(xiàn)，新疆地區(qū)羊源大腸桿菌98%攜帶aadA1 耐藥基因，且即使aadA1耐藥基因的攜帶率很高，但分離菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性僅有44%，低于基因攜帶率，與本研究結(jié)果較為相似，其原因可能與基因的表達狀態(tài)有關(guān)。本研究中分離菌對土霉素的耐藥率為63.9%，但四環(huán)素類耐藥基因的檢出率僅為36.1%，這可能是因為其他因素如外排泵、滅活酶等導(dǎo)致菌株耐藥，也可能是本試驗未考慮到的其他耐藥基因?qū)е碌木昴退帯?/p>

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，山東部分地區(qū)鴨及鴨胚源大腸桿菌耐藥情況較為嚴重，耐藥譜復(fù)雜。因此，需要根據(jù)各地實際情況，科學(xué)指導(dǎo)臨床中的抗菌藥物使用。