王 雨，劉 麗，馬小萍，李洋洋，杜田菊

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004；2.銀川市第一人民醫(yī)院，寧夏醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，銀川 750001）

智力障礙（intellectual disability，ID）/全面發(fā)育遲緩（global developmental delay，GDD）是兒童常見的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，包括智力及適應(yīng)能力明顯低于同齡兒童，常合并注意缺陷多動障礙、孤獨癥等疾病[1]。根據(jù)年齡將此類疾病分為兩類，ID 應(yīng)用于≥5 歲的兒童，GDD 用于＜5 歲的幼兒，原因可能是5 歲以下的幼兒因年齡原因不能準確地進行系統(tǒng)的智能及社會適應(yīng)能力等量表的評估，導致誤差，尤其對于輕度智力障礙的患兒，隨年齡增長進行再次評估時可能不符合ID 的診斷標準[1]。據(jù)統(tǒng)計，ID/GDD 患病率約為1%～3%[2]。因智力受到不同程度的影響，輕者影響患兒的學習、社交等能力，重者生活不能自理，不僅給患者和家庭造成較大的影響，也給社會帶來了沉重的負擔，因此明確病因尤為重要。ID/GDD 的病因復(fù)雜，包括宮內(nèi)感染、窒息、腦外傷、顱內(nèi)感染、中毒、代謝性疾病及遺傳因素等，其中遺傳學病因包括染色體核型異常、染色體微缺失微重復(fù)、基因突變等[3]。目前對于診斷ID/GDD 患兒常用的基因檢測方法有染色體核型分析、拷貝數(shù)變異的檢測技術(shù)（CNV-Seq）、高通量測序技術(shù)（NGS）等。

1 染色體核型異常

1.1 基本概念

人類有23 對染色體，一般情況下，染色體的異常會導致大量基因的改變，因此大多數(shù)染色體異常的患兒病情較重，常伴有中、重程度的智力障礙、顏面部畸形及其他部位的畸形等。但也有例外，如羅伯遜易位，因丟失的染色體幾乎由異染色質(zhì)構(gòu)成，不參與基因的表達，而由長臂組成的新的染色體幾乎包含了兩條染色體的全部表達基因，因此一般表型正常[4]。染色體核型異常通常發(fā)生在細胞水平上，包括數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，數(shù)目異常包括染色體數(shù)目的增多和減少，結(jié)構(gòu)異常主要有染色體的倒位、易位、缺失、重復(fù)等[5-6]。對于合并各種畸形、癲癇、肌張力異常、孤獨癥等表現(xiàn)的ID/GDD 患兒，稱為綜合征性質(zhì)ID/GDD，而以單純的智力低下為主要表現(xiàn)的非綜合征性質(zhì)ID/GDD，一般染色體核型異常因累及的基因數(shù)目較多，所以常導致綜合征性質(zhì)的ID/GDD[5]。

1.2 檢測染色體核型異常的方法及優(yōu)缺點

診斷染色體核型異常一般采用染色體核型分析技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）等。目前檢測染色體核型異常最為常用的方法是G 顯帶核型分析技術(shù)（Gbanding karyotype analysis technology），其可以在普通顯微鏡下清晰直觀地分析每條染色體的形態(tài)特征，包括染色體的大小、結(jié)構(gòu)、著絲點的位置等，而且標本易于存放，因此被廣泛應(yīng)用[5，7]。由于染色體核型異常累及的基因數(shù)目較多，導致臨床表型復(fù)雜、多樣，且大多數(shù)智力障礙程度較重，因此對于合并多器官畸形、多系統(tǒng)病變及智力障礙程度重的患兒，建議先行染色體核型分析檢測[8]。FISH 檢查針對染色體位點進行熒光探針標記，從而檢測出某疾病。例如，對于臨床上高度懷疑特納（Turner）綜合征時，表現(xiàn)為身高明顯低于同齡兒童、肘外翻、蹼頸、到青春期時乳房仍呈幼稚型、智力程度不一，也可正常，超聲提示性腺發(fā)育不良等臨床表現(xiàn)時，可對X 染色體進行熒光標記，根據(jù)熒光信號點進行診斷，此方法具有耗時短、針對性強、準確率高、可以檢測部分＜5 Mb的染色體微缺失微重復(fù)等優(yōu)點，但其探針種類有限，只能對臨床醫(yī)生高度懷疑的疾病進行診斷，若合并其他染色體畸形是不能被識別出來的，同時也不能檢測出染色體的多態(tài)性及平衡易位等，所以應(yīng)用范圍較為局限[9-10]。染色體核型分析已廣泛用于確定患者ID/GDD 的原因，據(jù)統(tǒng)計其可明確5%～10%的遺傳學病因，但由于染色體核型分析技術(shù)只能檢測＞5 Mb 的染色體異常，對于＜5 Mb 的染色體微缺失微重復(fù)、基因突變等不能識別，因此導致很多陽性結(jié)果被遺漏[1，11]。

1.3 相關(guān)疾病

目前常見的染色體核型異常的疾病有21-三體綜合征、5P-綜合征、Turner 綜合征等。其中21-三體綜合征根據(jù)核型的不同分為三種類型：標準型、易位型、嵌合型，以標準型最多見，核型為47，XX，（或XY），+21，常表現(xiàn)為眼裂小、眼距寬、眼睛上斜，面部扁平、鼻梁低平、外耳小，常張口伸舌、流涎，頭小而圓、頸部短而寬等特殊面容及中重程度的智力障礙等[6]。

2 染色體微缺失微重復(fù)

2.1 基本概念

染色體微缺失微重復(fù)是由染色體微小片段重復(fù)或缺失引發(fā)的染色體疾病，通常累及的基因改變較染色體核型異常少，對于長度＞1 kb 的DNA 片段的重復(fù)或缺失稱為拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV），其具有較為復(fù)雜的臨床表型，如智力障礙、發(fā)育遲緩、畸形等[12-13]。研究[11，14]表明，在正常健康人群中檢測到的95%CNV 長度都＜100 kb ，僅有1%～2% CNVs＞1 Mb，95.4%致病性CNV 都＞500 kb，故考慮CNV 片段的大小與致病性相關(guān)。

2.2 檢測CNV 常用的方法及其優(yōu)缺點

針對CNV 的主要基因檢測方法有：FISH、多重連接依賴探針擴增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、CNV-Seq、CMA、NGS 等。MLPA 檢測較FISH 的檢測通量高，其利用DNA 探針雜交和PCR 技術(shù)等，可同時對多達55 個已知的疾病位點進行檢測和定量分析，具有檢測速度快、準確度高、可檢測已知的CNV、基因突變及基因甲基化（MS-MLPA）等優(yōu)點，其檢測技術(shù)較大程度地提高了ID/GDD 的診斷率，其缺點是因已知疾病位點的探針有限，因此不能檢測到?jīng)]有探針覆蓋的區(qū)域，同時平衡易位產(chǎn)生DNA 順序的變化，而不是DNA 數(shù)量的變化，所以無法檢測到染色體的平衡易位、倒位等[15-17]。CMA包括基于芯片的比較基因組雜交技術(shù)（array comparative genomic hybridization，aCGH）和單核苷酸多態(tài)性微陣列（single nucleotide polymorphism array，SNP array），近年來許多基因檢測平臺已將兩者融合在一起使用，能在全基因水平上發(fā)現(xiàn)大量的CNV、染色體的非整倍體、染色體重排等，具有覆蓋范圍廣、通量高、分辨率高等優(yōu)點，對于ID/GDD 患兒能夠檢測出15%～20%致病性CNV[18-19]。因此，該檢測已被視為檢測CNV 最常用的方法[12]。隨著技術(shù)的發(fā)展，NGS 也可以檢測大部分的致病性CNV，但由于其存在一定的假陽性率，必要時需進行拷貝數(shù)的檢測進行確認[3]。CMA 技術(shù)同樣具有一些缺點，如該技術(shù)不能檢測染色體的倒位、平衡易位、非整倍體易位及同源染色體重復(fù)與缺失等，也無法對大部分基因突變導致的疾病做出明確診斷[2]。對于染色體片段＞5 Mb 的平衡易位、倒位，可通過染色體核型分析進行檢測，但基因突變需要Sanger 測序、NGS 等進行檢測。

2.3 相關(guān)疾病

常見的CNV 導致的疾病包括15q11.2-q13.1區(qū)域、7q11.23 區(qū)域、4p16.3 區(qū)域微缺失等[14]。其中15q11.2-q13.1 區(qū)域的微缺失因基因組印記的原因可導致小胖威利綜合征（Prader-Willi syndrome，PWS）及天使綜合征（angelman syndrome，AS）[20]?；蚪M印記是指對于來自同源染色體的等位基因，由于特定位點的DNA 甲基化修飾等原因，僅表達等位基因中一個親代基因，15q11.2-q13.1 區(qū)域中包含多個與基因印記調(diào)控相關(guān)的位點，當可以表達的親本基因缺失時，就造成了疾病的發(fā)生[20]。PWS 可有以下幾種情況：此片段的缺失來自父親（70%～75%）、母系單親二倍體（25%～30%），印記缺陷（1%）等，其臨床表型主要有不同程度的智力障礙、肌張力低下、身材矮小、性腺功能減退，嬰兒早期表現(xiàn)為喂養(yǎng)困難，隨后出現(xiàn)過度進食，進而導致過度肥胖等并發(fā)癥[21]。AS 可見于以下幾種情況：此片段的缺失來自母系（75%）、父系單親二倍體（1%～2%）、印記缺陷（3%）、UBE3A基因突變（5%～10%）等，常表現(xiàn)為嚴重的智力缺陷、語言障礙、小頭畸形、癲癇發(fā)作、運動的共濟失調(diào)、多動、無誘因發(fā)笑、睡眠障礙等[22]。這兩種疾病有多種致病機制，因此需多種檢測方法才可全部覆蓋，首先考慮選用覆蓋范圍最廣的檢測方法，例如甲基化特異性FISH（MSFISH），可以檢測片段的缺失、單親二倍體、印記缺陷，但不能具體區(qū)分是哪種機制引起的，所以逐漸被MS-MLPA（可以檢測甲基化位點、CNV）所取代，它可以檢測約99%的PWS 以及約80%的AS，具體包括的范圍和MS-FISH 幾乎相同；此檢測可以區(qū)分片段的缺失以及印記缺陷中印記中心的缺失，對于剩余的單親二倍體和印記缺陷中沒有染色體缺失的可行微衛(wèi)星分析檢測（microsatellite analysis，MSA） 進行鑒別。如果MS-MLPA 檢測陰性，對于PWS，幾乎可排除此疾??；對于AS，如果臨床表型高度懷疑，不排除UBE3A 突變引起，可行UBE3A 基因突變檢測明確診斷[22]。

3 基因突變

3.1 基本概念

基因突變是指分子水平上的單個或者多個堿基的組成或順序發(fā)生改變，從而導致疾病的發(fā)生[5]。引起單個基因突變常見的原因有小的插入與缺失（short insertion and deletion，Indel）、單核苷酸變異（single nucleotide varianiont，SNV）等[7]。

3.2 檢測Indel、SNV 的常用方法及其優(yōu)缺點

對于檢測Indel、SNV 的主要基因檢測技術(shù)有Sanger 測序、NGS 等。Sanger 測序準確度高，接近100%，不足之處是耗時、通量較低、成本高，所以臨床上常用于其他基因檢測結(jié)果的驗證上[23]。目前臨床較為常用的是NGS，它包括疾病靶向基因測序（targeted panel sequencing，TPS）、全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）和全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）[3]。TPS可以測大量已知疾病的靶向序列，因測序深度高，所以靈敏度及特異性較高，缺點是不能識別尚未被人類發(fā)現(xiàn)的疾病位點[3]。WES 是對編碼大部分蛋白質(zhì)的區(qū)域的基因組DNA 進行測序，即大部分外顯子區(qū)域，其變異因影響蛋白質(zhì)的表達，故對臨床表型影響較大[8]。WGS 是指對人類全部基因組進行測序，相比前兩者，測序深度略低、價格昂貴，主要用于完善其他基因檢測后病因仍未明確的患兒[5]。目前三者中較為常用的是WES，因為WES 相對于TPS 覆蓋范圍更廣，更有助于新致病基因的發(fā)現(xiàn)，相對于WGS 測序深度更高、成本更低，易于被患者家屬接受，同時檢測的陽性率相對較高，據(jù)統(tǒng)計WES 報告的ID/GDD遺傳病因的診斷率為16%～45%，該技術(shù)更加適合于臨床[5]。

WES 也有其缺點，其不能檢測染色體大片段的異常、內(nèi)含子區(qū)域、線粒體基因以及GC 高富集區(qū)、大量串聯(lián)重復(fù)區(qū)，并且WES 可能出現(xiàn)假陽性率，需要額外的Sanger 測序驗證，增加了檢測的成本和時間[3，7]。隨著科技的發(fā)展，WGS 從測序深度、價格方面可能會逐漸改進，不久的將來可能取代WES，成為檢測ID/GDD 的常用方法。

3.3 相關(guān)疾病

目前導致ID/GDD 常見的突變基因有MECP2、FMR1、SCN1A 等。由于遺傳異質(zhì)性，MECP2、CDKL5、FOXG1 基因突變均可導致雷特（Rett）綜合征，其中最常見的是MECP2 基因突變所致，約占典型Rett 綜合征的95%～97%，由于此突變基因包含甲基化-CpG 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，故其既可通過NGS 檢測，也可通過甲基化特異多重連接依賴探針擴增技術(shù)（methylation-specific MLPA，MS-MLPA）進行檢測，因此，大部分的PWS、AS 也適用[24-25]。Rett 綜合征好發(fā)于女性，呈X 染色體連鎖顯性遺傳，其特征是大多數(shù)患兒，尤其是典型Rett 綜合征的患兒出生后6 個月之內(nèi)一般無明顯的發(fā)育異常，隨后出現(xiàn)發(fā)育倒退現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在語言和手功能的倒退，其他癥狀還包括智力障礙、步態(tài)異常、手的刻板動作、異常發(fā)笑等[25]。另外，F(xiàn)RM1 基因改變導致的脆性X 綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）好發(fā)于男性，呈X 連鎖不完全顯性遺傳，其最為常見的分子機制是由于（CGG）n 過度擴增導致啟動子區(qū)CPG 島的甲基化，在正常人群中樣本量為5～44，由于動態(tài)突變的原因，在傳代的過程中當其累計達到200 時引起全突變，導致FRM1 基因表觀遺傳沉默（此基因的組成或順序未發(fā)生改變，但功能發(fā)生了改變），從而使生成的FMRP（FMR1 protein）減少或缺失，導致FXS 的發(fā)生；另一種是由于FRM1 基因的點突變或缺失引起，占比不足1%[26]。臨床表型常表現(xiàn)為不同程度的智力障礙（由于女性X 染色體的隨機失活，通常女性患者的智力障礙程度較輕）、面部畸形（前額突出、臉型較長、耳廓大、嘴唇厚、下頜突出等）、語言障礙、注意缺陷障礙、孤獨癥等[27]。目前應(yīng)用的檢測方法有Southern 印跡雜交結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)、三引物PCR 方法等[28]。由于NGS 不能檢測大量串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，因此約99%的FXS 不能通過此方法進行檢測。對于臨床表型高度懷疑FXS，但CGG 擴增呈陰性的患兒，不排除由不足1%的FRM1 基因的點突變或缺失的引起，可選擇此方法進行檢測[26]。

3.4 線粒體疾病

線粒體疾病主要是由于線粒體基因和核基因突變引起，從而影響機體的能量代謝，因線粒體在人體分布廣泛且致病機制復(fù)雜，也可在少數(shù)患者中引起發(fā)育遲緩[29]。線粒體疾病是臨床異質(zhì)性疾病，發(fā)病年齡不一，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，兒童期發(fā)病的線粒體疾病通常比較嚴重，常導致全身乏力、運動耐力下降、肌張力低下、發(fā)育遲緩、癲癇等[29]。一般在成年期發(fā)病的線粒體疾病主要是線粒體基因突變引起，約占80%，兒童期發(fā)病的線粒體疾病主要是由于核基因突變引起，約占75%～80%，因此可選用包含線粒體基因的NGS明確診斷[29-30]。

ID/GDD 病因復(fù)雜、臨床表型多樣，具有遺傳異質(zhì)性，許多地區(qū)對于此類疾病的診療仍有欠缺。從目前診療指南程序來看，首先考慮是否與環(huán)境、社會文化經(jīng)濟有關(guān)，排除因感染、毒物、外傷、腫瘤、社交隔離等因素引起的智力障礙后，可考慮遺傳因素。對于家族中具有明確的遺傳病及臨床表型特別符合某類疾病史的患者，可直接行相關(guān)基因檢測明確診斷。目前明確遺傳因素的診斷程序依次為遺傳代謝病篩查、染色體核型分析、CMA 或直接行NGS，因為其既可診斷基因突變，也可診斷大部分CNV。如果以上檢測技術(shù)都不能明確診斷，可行三代測序，其可實現(xiàn)單分子與實時測序、測序時間短、覆蓋NGS 不能覆蓋的區(qū)域，即GC 高富集區(qū)、大量串聯(lián)重復(fù)區(qū)等，但目前三代測序尚處于發(fā)展階段，準確度欠佳、成本高，因此主要應(yīng)用于實驗室當中[31]。

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，我國由于遺傳學因素導致的ID/GDD 的確診率在逐年升高。雖然大多數(shù)ID/GDD 無法治愈，但明確病因是治療疾病的基礎(chǔ)，有針對性地康復(fù)訓練、藥物以及特殊食物等治療方法可以在一定程度上改善預(yù)后、減輕并發(fā)癥。同時，也為既往生育過ID/GDD 患兒的家庭提供精準的遺傳咨詢，以此減少ID/GDD 的患病率，最大限度地減輕家庭和社會的養(yǎng)育負擔。