陸方苗 羅紅尚 韋永享 覃向平 馬靖羽 蔣師東 何 驥 肖 瀟 黃旭華 韋善教

(1廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站, 廣西南寧 530007; 2環(huán)江毛南族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 廣西河池 547100; 3河池市綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展中心, 廣西河池 547000)

消毒是養(yǎng)蠶生產(chǎn)中殺滅環(huán)境病原微生物,控制各種蠶病發(fā)生的重要措施,蠶藥是養(yǎng)蠶生產(chǎn)應用的重要物資[1]。長期以來,養(yǎng)蠶生產(chǎn)中主要使用漂白粉、次氯酸鈉、強氯精(三氯異氰尿酸)和優(yōu)氯凈(二氯異氰尿酸鈉)等含氯制劑以及福爾馬林等醛制劑進行蠶業(yè)消毒[2]。隨著科技的發(fā)展,人類醫(yī)療衛(wèi)生、畜牧養(yǎng)殖等方面研發(fā)應用的消毒劑層出不窮,部分消毒劑逐漸推廣到蠶業(yè)生產(chǎn)中進行養(yǎng)蠶消毒,如一些季銨鹽類(表面活性劑)、醛制劑和碘類等[3]。家蠶傳染性病原種類多,有病毒、真菌、細菌、原蟲等病原體,而且有的還是比較難以殺滅的病原體,如家蠶核型多角體病毒(BombyxmoriNuclear Polyhedrosis Virus, BmNPV)和家蠶質型多角體病毒(BombyxmoriCytoplasmic Polyhedrosis Virus, BmCPV)有蛋白質多角體外殼保護,家蠶微孢子蟲也具有幾丁質外殼保護,而家蠶真菌的分生孢子、細菌的芽孢也具有特殊的防御能力[4],這些病原微生物對理化因子和環(huán)境因子都有一定的抵抗力,特別是包埋于多角體蛋白中的BmNPV和BmCPV病毒粒子在失水、冰凍、酶降解、酸和去污劑處理條件下仍能夠存活[5],只有在pH≥10.5的強堿性條件下將病毒(BmNPV和BmCPV)的多角體蛋白融解后才能將病毒粒子從蛋白多角體中釋放出來加以殺滅[6]。另外,隨著工廠化養(yǎng)蠶應用的機器設備和鐵制設施越來越多,以及農(nóng)村生活條件改善使用的電器也越來越多,使蠶農(nóng)在養(yǎng)蠶生產(chǎn)中對強腐蝕性消毒劑避而遠之。因此,養(yǎng)蠶生產(chǎn)中使用的消毒劑的有效性、酸堿度及腐蝕性影響著它們的使用范圍。目前,農(nóng)村養(yǎng)蠶生產(chǎn)中使用的消毒劑種類繁多,而這些消毒劑是否適合應用于養(yǎng)蠶生產(chǎn)還有待深入研究。為此,本研究從廣西蠶區(qū)蠶藥市場上分別篩選含醛、含碘、季銨鹽、含氯和其他類的消毒劑,每種類選擇1～3種(共10種),對這些消毒劑的有效性、酸堿性和腐蝕性等性能進行比較試驗,以期為養(yǎng)蠶生產(chǎn)選擇合適的蠶藥并為有效消毒防控蠶病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試消毒劑 試驗藥物從廣西蠶區(qū)蠶藥市場上選擇含醛類的戊二醛、福爾馬林,含碘類的聚維酮碘、癸甲丙二醇氯銨復合碘,季銨鹽類的苯扎溴銨、癸甲溴銨、月芐三甲氯銨,含氯類的優(yōu)氯凈、漂白粉精及其他類消毒劑二氧化氯等10種消毒劑。各種消毒劑的生產(chǎn)廠家及生產(chǎn)使用濃度詳見表1。

表1 試驗應用的10種消毒劑

1.1.2 供試家蠶品種 家蠶品種為932,2齡,由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,北京奧博星生物技術有限公司產(chǎn)品;LB肉湯液體培養(yǎng)基,北京奧博星生物技術有限公司產(chǎn)品;PDA培養(yǎng)基,SOLARBIO公司產(chǎn)品。

1.1.4 供試病原菌 試驗用病原菌為家蠶靈菌(Serratinmarcescens)、家蠶白僵菌(Beauveriabassiana)、BmNPV和家蠶微孢子蟲(Nosemabombycis,Nb),均由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站保存和提供。

1.1.5 主要儀器設備 SW-CJ-1FD型超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司產(chǎn)品;MODEL ECLIPSE Ci-L型生物顯微鏡, 日本NIKON CORPORATION TOKYO公司產(chǎn)品;3k15型臺式高速冷凍離心機,SIGMA公司產(chǎn)品;CR60型立式自動壓力蒸汽滅菌器, 致微(廈門)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基準備 各稱取LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基32 g、LB肉湯液體培養(yǎng)基20 g、PDA培養(yǎng)基38 g,分別加入1 000 mL蒸餾水中,加熱煮沸溶解,分裝,LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和LB肉湯液體培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃高壓滅菌15 min后備用,PDA培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min后備用。

1.2.2 病原菌的配制 (1)靈菌的配制。從靈菌平板上挑取病原菌接種到LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接種到LB肉湯液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h,配成濃度約為5.0×108個/mL的菌體懸浮液。(2)白僵菌的配制。從白僵菌平板上挑取白僵菌分生孢子接種到PDA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)10 d,挑取分生孢子加入到無菌水中,配成濃度為1.5×108個/mL的分生孢子懸浮液。(3)BmNPV的配制。取家蠶血液型膿病病蠶血液,經(jīng)離心純化后用無菌水配成濃度為1.5×107個多角體/mL的多角體懸浮液。(4)Nb的配制。取家蠶微粒子病病蠶,研磨、過濾、離心純化后,用無菌水配成濃度為1.5×107個孢子/mL的孢子懸浮液。

1.2.3 各種消毒劑對不同家蠶病原體的殺滅試驗 (1)對家蠶靈菌敗血病病原體的殺滅試驗。采用懸浮液法[7]調(diào)查10種消毒劑溶液不同時間、不同濃度殺滅家蠶靈菌的情況。利用移液槍取200 μL的5.0×108個/mL靈菌懸浮液加入到1.5 mL離心管中,以12 000 r/min離心5.0 min,去掉上清,分別加入10種消毒劑的生產(chǎn)實用濃度的溶液1.0 mL,震蕩搖勻,分別處理10 min、20 min、30 min;離心,利用無菌水清洗2次,再加入50 μL無菌水,取菌懸液加入到LB平板中,利用玻璃棒均勻涂抹,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察是否有紅色菌落生長。同時分別配制10種消毒劑的生產(chǎn)實用濃度的2倍、5倍、10倍濃度的溶液,用配制好的消毒液處理家蠶靈菌病原體10 min。每種處理設3個重復,同時設立無菌水處理菌體的陽性對照和無菌水空白陰性對照。(2)對家蠶白僵病病原體的殺滅試驗。參考1.2.3(1)家蠶靈菌敗血病病原體的殺滅試驗處理方法進行,以PDA平板于28 ℃培養(yǎng)10 d的白僵菌配制成1.5×108個/mL的分生孢子懸浮液代替5.0×108個/mL的靈菌懸浮液,處理好的PDA平板以28 ℃培養(yǎng)72 h,觀察是否有白色菌落生長,其余處理與1.2.3(1)相同。(3)對BmNPV的殺滅試驗。采用懸浮液法[7]調(diào)查10種消毒劑不同時間、不同濃度殺滅BmNPV的情況。用移液槍取200 μL的BmNPV多角體懸浮液于1.5 mL滅菌離心管中,以4 000 r/min離心5.0 min,去掉上清,分別加入10種消毒劑的生產(chǎn)實用濃度的溶液1.0 mL,震蕩搖勻,分別處理10 min、20 min、30 min;離心,利用無菌水清洗2次,再加入200 μL無菌水;將處理后的懸浮液200 μL均勻涂抹在2張4.0 cm2的桑葉上,給2齡起蠶(30頭)添食;當家蠶食完含病原體的桑葉后,更換蠶座紙片,改用潔凈桑葉飼養(yǎng)5 d,調(diào)查各區(qū)家蠶血液型膿病發(fā)病率。同時分別配制10種消毒劑的生產(chǎn)實用濃度的2倍、5倍、10倍濃度的溶液,處理BmNPV多角體10 min。每種處理設3個重復,同時設立無菌水處理BmNPV的陽性對照和無菌水空白陰性對照。(4)對Nb的殺滅試驗。參考1.2.3(3)BmNPV的殺滅試驗處理方法進行,以1.5×107個孢子/mL的孢子懸浮液代替1.5×107個多角體/mL的BmNPV多角體懸浮液,其余處理與1.2.3(3)相同。家蠶添食Nb后飼養(yǎng)12 d(至5齡第3 天),對各區(qū)家蠶逐頭進行研磨鏡檢,調(diào)查并計算家蠶微粒子病發(fā)病率。

1.2.4 各種消毒劑生產(chǎn)實用濃度溶液的酸堿度測定 利用超純水配制各種消毒劑的生產(chǎn)實用濃度溶液,再分別利用pH計測定各種消毒劑生產(chǎn)實用濃度溶液的pH值。

1.2.5 各種消毒劑的腐蝕性測定 準備好尺寸基本一致的鐵片,用120號粒度的水砂紙將鐵片磨光,去掉金屬表面層,用水洗凈涼干,于50 ℃烘干1 h,精確稱其質量。將每種樣片分別放入10種消毒劑的生產(chǎn)實用濃度溶液中浸泡3 d,每日更換1次新配的消毒液,同時設自來水為對照。浸泡結束后,將鐵片洗凈后干燥(于50 ℃烘干1 h),精確稱其質量,根據(jù)公式R=8.76 ×107×(M-Mt )/(S×t×D)計算各種消毒劑的腐蝕速率(R)。其中R為腐蝕速率;M、Mt分別為試驗前后金屬片質量(g);S為金屬片表面積(cm2);t為浸泡時間(h);D為金屬密度(kg/m3)。本試驗重復1次[8]。

2 結果與分析

2.1 10種消毒劑對家蠶病原體的殺滅效果

2.1.1 10種消毒劑的生產(chǎn)實用濃度溶液不同處理時間對靈菌、白僵菌、BmNPV和Nb的殺滅效果 從表2可以看出:戊二醛、聚維酮碘和癸甲丙二醇氯銨復合碘等3種消毒劑對家蠶病原體殺滅能力很差,即使處理30 min對家蠶靈菌、白僵菌仍然沒有達到完全的殺滅效果;苯扎溴銨對家蠶靈菌有很好的殺滅效果,但對家蠶白僵菌、BmNPV、Nb的殺滅能力較差;癸甲溴銨、月芐三甲氯銨對家蠶靈菌、白僵菌有很好的殺滅效果,但對BmNPV、Nb的殺滅能力較差;二氧化氯和優(yōu)氯凈對家蠶靈菌、白僵菌和Nb具有很好的殺滅效果,但對BmNPV的殺滅能力較差,利用它們的生產(chǎn)實用濃度處理BmNPV達30 min也沒有達到完全的殺滅效果。福爾馬林對家蠶靈菌、白僵菌和BmNPV有很好的殺滅效果,但對Nb作用10 min仍未能達到完全的殺滅效果,20 min以上才達到完全的殺滅效果。漂白粉精對4種家蠶病原體殺滅效果最佳,利用它的生產(chǎn)實用濃度(有效氯含量為1.0%)處理病原體10 min,即可達到完全的殺滅效果。

表2 10種消毒劑生產(chǎn)實用濃度不同處理時間對靈菌、白僵菌、家蠶核型多角體病毒(BmNPV)、家蠶微孢子蟲(Nb)的殺滅情況

在靈菌和白僵菌處理組中“-”表示無菌生長 ,“+”表示有少量菌生長,“++”表示有較多菌生長,“+++”表示有大量菌生長;在BmNPV和Nb處理組中各數(shù)據(jù)為各區(qū)蠶的發(fā)病率。陽性CK為不做任何處理的病原對照,陰性CK為無菌水對照。表3同。

表3 10種消毒劑生產(chǎn)實用濃度的不同倍數(shù)溶液對靈菌、白僵菌、BmNPV和Nb的殺滅情況

2.1.2 10種消毒劑不同濃度對家蠶靈菌、白僵菌、BmNPV和Nb的殺滅效果 采用懸浮液法測定10種消毒劑的不同濃度溶液殺滅4種家蠶病原體的效果。從表3可以看出:各種消毒劑的使用濃度對它們殺滅家蠶病原體能力具有一定影響,如提高戊二醛、聚維酮碘和癸甲丙二醇氯銨復合碘3種消毒劑的濃度為生產(chǎn)實用濃度的10倍后對家蠶靈菌、白僵菌和Nb就具有很好的殺滅效果,提高苯扎溴銨濃度也能夠增強殺滅白僵菌的效果,證實戊二醛、聚維酮碘、癸甲丙二醇氯銨復合碘、苯扎溴銨等消毒劑的生產(chǎn)實用濃度偏低,需要提高濃度才能對家蠶病原體具有一定的殺滅效果;癸甲溴銨、月芐三甲氯銨、二氧化氯、優(yōu)氯凈保持對家蠶靈菌、白僵菌具有很好的殺滅效果,而且二氧化氯、優(yōu)氯凈對Nb還具有完全的殺滅效果,但這8種消毒劑基本對BmNPV沒有殺滅效果,即使提高濃度的消毒效果也不佳。只有漂白粉精和福爾馬林的各種濃度溶液對家蠶病原體均具有很好的殺滅效果。

2.2 10種消毒劑的生產(chǎn)實用濃度溶液的酸堿度

利用pH計測定10種消毒劑的生產(chǎn)實用濃度懸浮液的pH值(表4)。福爾馬林、聚維酮碘、癸甲丙二醇氯銨復合碘、苯扎溴銨、癸甲溴銨、月芐三甲氯銨和二氧化氯消毒劑屬于酸性,優(yōu)氯凈和戊二醛為弱堿性,漂白粉精為強堿性。

表4 10種消毒劑生產(chǎn)實用濃度溶液的酸堿度(pH值)

2.3 10種消毒劑的生產(chǎn)實用濃度溶液的腐蝕性

10種消毒劑的生產(chǎn)實用濃度溶液對鐵片的腐蝕性測定結果見表5。從表5可以看出,戊二醛、福爾馬林、聚維酮碘、癸甲丙二醇氯銨復合碘、苯扎溴銨、癸甲溴銨、月芐三甲氯銨等7種消毒劑對鐵片有輕度腐蝕,二氧化氯對鐵片有中度腐蝕,而優(yōu)氯凈和漂白粉對鐵片的腐蝕程度達到重度腐蝕,優(yōu)氯凈腐蝕性最強。

表5 10種消毒劑生產(chǎn)實用濃度溶液對鐵片的腐蝕情況

3 小結與討論

消毒是控制養(yǎng)蠶生產(chǎn)傳染性病害流行的重要手段,而家蠶病原微生物特征及養(yǎng)蠶方式?jīng)Q定了養(yǎng)蠶消毒不同于人用及其他獸用的消毒,應用的消毒劑有自身要求,消毒劑種類的選擇直接影響蠶業(yè)生產(chǎn)的消毒效果和病害流行的控制[9]。目前,農(nóng)村養(yǎng)蠶生產(chǎn)中使用的消毒劑種類繁多,本試驗測定了10種消毒劑對家蠶病原體的殺滅效果,測定的戊二醛、聚維酮碘和癸甲丙二醇氯銨復合碘消毒劑的生產(chǎn)實用濃度溶液對家蠶各種病原體基本沒有殺滅效果;苯扎溴銨、癸甲溴銨和月芐三甲氯銨消毒劑的生產(chǎn)實用濃度溶液只對家蠶病原細菌和真菌有一定的殺滅效果,但對BmNPV和Nb的殺滅能力均很差;二氧化氯和優(yōu)氯凈的生產(chǎn)實用濃度溶液對家蠶病原細菌、真菌和Nb有較好的殺滅效果,但對BmNPV的殺滅能力均很差;只有漂白粉和福爾馬林的生產(chǎn)實用濃度溶液對各種家蠶病原體均具有較好的殺滅效果。試驗證明各種消毒劑對家蠶病原體的消毒效果存在顯著差異。

各種消毒劑的酸堿度對它們的殺菌活性有重要影響[10],酸性和弱堿性不利于裂解病毒多角體而無法殺滅病毒粒子,因此聚維酮碘、癸甲丙二醇氯銨復合碘、苯扎溴銨、癸甲溴銨、月芐三甲氯銨、二氧化氯消毒劑、優(yōu)氯凈和戊二醛對BmNPV的殺滅能力差,而漂白粉精對BmNPV的殺滅能力最好。優(yōu)氯凈是一種有機氯消毒劑,其有效成分是二氯異氰尿酸鈉,呈酸性,對BmNPV多角體的殺滅效果很差,需要加入其他輔劑使混合物成為強堿性,才有利于完全殺滅家蠶病原體。

消毒劑有效成分的濃度對殺菌效果也有重要影響。如試驗中采用戊二醛、聚維酮碘、癸甲丙二醇氯銨復合碘、苯扎溴銨等消毒劑的生產(chǎn)實用濃度,對4種家蠶病原體幾乎都沒有殺滅效果,而增加各消毒劑的濃度才具有一定的殺菌效果,如戊二醛消毒劑在有效成分濃度為0.02%(1∶100)和0.04%(1∶50)時無法有效殺滅靈菌、白僵菌,當增加濃度為0.20%(1∶10)時才能實現(xiàn)殺滅效果,證明了生產(chǎn)實用濃度偏低。戊二醛和福爾馬林都是醛制劑,戊二醛消毒劑的生產(chǎn)實用濃度為0.02%,而福爾馬林的生產(chǎn)實用濃度為2%,很顯然福爾馬林殺滅家蠶病原體的能力強,而戊二醛殺滅家蠶病原體的能力弱。王娜等[11]報道聚維酮碘在有效成分濃度為1.250 mg/L時對家蠶病原細菌和病原真菌才有完全的殺滅效果,但聚維酮碘的生產(chǎn)實用濃度僅為0.125 mg/L,遠低于1.250 mg/L,很明顯是沒有殺滅效果的。因此,市場上銷售的一些蠶用消毒劑使用時有效成分濃度偏低,應該是生產(chǎn)廠家從控制成本等方面考慮減少藥物有效成分,這就造成這些消毒劑在養(yǎng)蠶生產(chǎn)中應用的消毒效果很差。另外,戊二醛、聚維酮碘、癸甲丙二醇氯銨復合碘、苯扎溴銨、癸甲溴銨和月芐三甲氯銨等藥劑常用于人體、獸用衛(wèi)生消毒,要求溫和、環(huán)保,如聚維酮碘廣泛應用于眼科術前結膜囊消毒,利用2.500 g/L的聚維酮碘消毒結膜囊才能有效降低結膜囊細菌量[12];而養(yǎng)蠶生產(chǎn)上應用聚維酮碘消毒的實用濃度是0.125 g/L,明顯低于應用于人體消毒的濃度,消毒效果也就順理成章地低了,這也是造成這些消毒劑對家蠶病原體消毒效果很差的原因。

隨著養(yǎng)蠶生產(chǎn)形勢的變化,蠶農(nóng)非常關注消毒劑的腐蝕性問題,都盡量避免使用高腐蝕性消毒劑。本試驗調(diào)查發(fā)現(xiàn)醛制劑、碘制劑和表面活性劑對鐵片有輕度腐蝕,而氯制劑(漂白粉、優(yōu)氯凈)和其他類的二氧化氯對鐵片的腐蝕性達到中度、重度腐蝕程度,這也是農(nóng)村養(yǎng)蠶逐步減少使用氯制劑而選擇醛制劑、碘制劑和表面活性劑進行蠶業(yè)消毒的主要原因之一。蠶業(yè)生產(chǎn)上,蠶病防控的主要措施仍然還是蠶室蠶具消毒、蠶體蠶座消毒,為達到有效控制蠶病的發(fā)生,也為了滿足農(nóng)村養(yǎng)蠶既能消毒防病又能降低成本的需求,仍需要進一步研發(fā)廣譜、高效、低毒、低刺激、低腐蝕的新型蠶用消毒劑。