周朝東，黃哲甦

(天津市藥品檢驗研究院，天津 300070)

鮭魚降鈣素鼻噴劑適用于治療骨質(zhì)疏松癥、由于骨質(zhì)溶解或骨質(zhì)減少引起的骨痛以及高血鈣癥等。經(jīng)查閱，《中國藥典》2015年版、《美國藥典》41版、《歐洲藥典》9.0版、《英國藥典》2018年版及日本藥局方17版中均未收載鮭魚降鈣素鼻噴劑。搜索國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站，目前國內(nèi)有2家企業(yè)有鮭魚降鈣素鼻噴劑批準文號，分別是銀谷制藥有限公司和深圳大佛藥業(yè)股份有限公司。國外只有Novartis(諾華)制藥有限公司有批準文號。由于鼻噴劑為多劑量噴霧劑，故按照《中國藥典》2015年版四部通則0106和0112的要求，除非制劑本身有足夠的抑菌性能，否則應(yīng)添加適宜濃度的抑菌劑。苯扎氯銨又名潔兒滅，是具有殺菌作用的季銨鹽類陽離子表面活性劑，是氯化二甲基芐基烴銨的混合物，其殺菌特性源于季銨離子和烷烴鏈。季銨離子在水中帶正電荷，可以吸附于帶負電荷的微生物表面形成微團，并逐步滲入細胞漿的類脂層，從而改變細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)容物外滲，阻礙其代謝，從而起到殺滅微生物的作用[1]。目前，苯扎氯銨作為抑菌劑被廣泛應(yīng)用于各類制劑中，因此有必要對其含量進行準確測定。本文建立了鮭魚降鈣素鼻噴劑中苯扎氯銨含量測定的高效液相色譜法，以苯扎氯銨n-C10H21、n-C12H25、n-C14H29和n-C16H33取代同系物峰面積之和計算含量，方法簡單快速，結(jié)果準確，可以應(yīng)用于鮭魚降鈣素鼻噴劑中苯扎氯銨的含量測定。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津LC-20A型高效液相色譜儀，SPD-20A紫外檢測器，LCsolution色譜工作站(日本島津公司)； METTLER XS205型十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2試藥 苯扎氯銨含量測定用對照品由LGC生產(chǎn)，批號82370，純度91.6%；鮭魚降鈣素對照品由企業(yè)提供，批號為H6091；3批鮭魚降鈣素鼻噴劑為本科室留樣,由瑞士諾華制藥企業(yè)生產(chǎn),批號分別為H5096A，H5098和H5095A；五水合四甲基氫氧化銨購自sigma公司，批號為MKBX6732V。其余試劑均為分析純,水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：waters μBondpak?CN 125?色譜柱(150 mm×3.9 mm，10 μm)；流動相：乙腈-水-四甲基氫氧化銨(475 ml∶525 ml∶1.99 g，磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)；流速：0.6 ml/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：50 μl；紫外檢測器，檢測波長：210 nm。由LCsolution軟件計算得知，C10-苯扎氯銨與C12-苯扎氯銨峰之間的分離度為2.2，C12-苯扎氯銨與C14-苯扎氯銨峰之間的分離度為3.0，C14-苯扎氯銨與C16-苯扎氯銨峰之間的分離度為4.1，符合《中國藥典》要求(大于1.5)。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取苯扎氯銨對照品約100 mg置100 ml量瓶中，用稀釋液(取氯化鈉0.850 g，加水使溶解成100 ml，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.7，即得)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為苯扎氯銨對照品貯備液。精密量取5 ml置50 ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，即得，此時苯扎氯銨對照品濃度約為0.1 mg/ml，平行制備2份對照品。

2.2.2供試品溶液的制備 取供試品溶液直接進樣分析。

2.2.3陰性對照溶液的制備 按鮭魚降鈣素鼻噴劑的處方稱取除苯扎氯銨外的成分配制成溶液，然后進樣分析。

2.3專屬性試驗 取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各50 μl ，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，見圖1。由圖1可知，陰性對照溶液在苯扎氯銨出峰處均沒有干擾峰出現(xiàn)，因此，鼻噴劑中其他成分、稀釋液以及流動相對苯扎氯銨的含量測定均沒有干擾。

2.4線性關(guān)系考查 精密稱取苯扎氯銨對照品約50 mg置50 ml量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液貯備液；分別精密量取2.5、4、5、6和7.5 ml置50 ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，即得，其濃度范圍從45.525 2～136.575 6 μg/ml，相當于供試品溶液標示濃度的約50%～150%。按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，以苯扎氯銨濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果，回歸方程為：Y=38 299 906X-18 967 467(r=1.000 0)，苯扎氯銨濃度在45.525 2～136.575 6 μg/ml內(nèi)，其濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

1.C10-苯扎氯銨 2.C12-苯扎氯銨

2.5精密度試驗 取“2.2.1”項下苯扎氯銨對照品溶液按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。結(jié)果，峰面積的RSD為0.17%，表明儀器精密性良好。

2.6重復性試驗 取批號為H5096A的供試品5份，按“2.1”項下色譜條件測定分析，結(jié)果5份供試品的苯扎氯銨含量平均值為0.092 mg/ml，RSD為0.06%，表明供試品的重復性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液1份，按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8和24 h各進樣2針。結(jié)果，供試品溶液中的苯扎氯銨在24 h內(nèi)峰面積的RSD為0.12%，表明苯扎氯銨溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8回收率試驗 按鮭魚降鈣素鼻噴劑處方精密稱取鮭魚降鈣素對照品和氯化鈉適量置50 ml量瓶中，平行制作9份。然后分別精密量取“2.2.1”項下苯扎氯銨對照品貯備液4、5和6 ml置上述50 ml量瓶中，用鹽酸溶液(pH 3.7)溶解并稀釋至刻度，制成每1 ml含苯扎氯銨0.08、0.1和0.12 mg的溶液，每個加樣濃度平行做3份，共9份，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。結(jié)果，9份樣品的平均回收率為99.4%，RSD為0.69%。見表1。

表1 回收率測定結(jié)果(n=9)

2.9檢出限和定量限試驗 取“2.2.1”項下苯扎氯銨對照品溶液進行稀釋，并按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，以信噪比S/N=3作為最低檢出限，以信噪比S/N=10作為定量限。結(jié)果，最低檢出濃度為8.19 ng/ml，檢出限為0.4 ng；最低定量濃度為27.3 ng/ml，定量限為1.4 ng。

2.10苯扎氯銨含量計算公式 苯扎氯銨(mg/ml)=C對×

2.11供試品中苯扎氯銨測定結(jié)果 取3批供試品按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰峰面積，然后按照“2.9”項下計算公式進行計算，結(jié)果見表2。

表2 供試品中苯扎氯銨測定結(jié)果

3 討論

苯扎氯銨由于其神經(jīng)毒副作用小、抑菌作用強，被廣泛地添加至消毒劑、健康護理液、化妝品、滴眼液和滴鼻液中[2]。苯扎氯銨原料及其溶液在《中國藥典》2015年版[3]、《美國藥典》41版[4]、《歐洲藥典》9.0版[5]和《英國藥典》2018年版[6]均有收載。 《中國藥典》2015年版二部收載的苯扎氯銨原料僅規(guī)定本品為氯化二甲基芐基烴銨的混合物，按無水物計算，含烴銨基應(yīng)為95.0%～105.0%，未對苯扎氯銨各取代同系物組成及其比例作出規(guī)定?！睹绹幍洹?1版、《歐洲藥典》9.0版和《英國藥典》2018年版則對苯扎氯銨各取代同系物組成及其比例作出規(guī)定且限度要求均為C12同系物不低于40%，C14同系物不低于20%，二者之和不低于70%?！睹绹幍洹?1版、《歐洲藥典》9.0版和《英國藥典》2018年版在苯扎氯銨各取代同系物組成測定方法上大致相同，略有差異。相同之處為：①均采用高效液相色譜法，配合紫外檢測器，檢測波長均為254 nm；②色譜柱均為氰基鍵合硅膠色譜柱，流速均為2 ml/min；③流動相均為乙腈-0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)；④對照品和供試品的濃度均為4 mg/ml。不同之處主要有3點：①進樣量不同，《美國藥典》41版進樣量為20 μl，《歐洲藥典》9.0版和《英國藥典》2018年版進樣量則是10 μl。②系統(tǒng)適用性要求不同，《美國藥典》41版要求C12同系物與C14同系物之間的分離度應(yīng)不小于1.5，此外還要求C12同系物峰面積的相對標準偏差不低于2.0%。而《歐洲藥典》9.0版和《英國藥典》2018年版則只規(guī)定了C12同系物與C14同系物之間的分離度不小于1.5。③《美國藥典》41版還提供了C10同系物的相對保留時間(相對C12同系物為0.9)和平均分子量(312)，而《歐洲藥典》9.0版和《英國藥典》2018年版只提了C12、C14和C16同系物的分子量，未提及C10同系物。

對于含量測定，《中國藥典》2015年版、《美國藥典》41版、《歐洲藥典》9.0版和《英國藥典》2018年版均采用滴定法，先精密加入碘化鉀溶液與苯扎氯銨反應(yīng)，再用碘酸鉀滴定液滴定剩余的碘化鉀溶液，結(jié)果用空白試驗校正?！吨袊幍洹?015年版與國外藥典有三處異同：一是限度不同，《中國藥典》2015年版規(guī)定限度為以無水物計算，含烴銨基應(yīng)為95.0%～105.0%。《美國藥典》41版規(guī)定限度為按無水物計算，應(yīng)為97.0%～103.0%，《歐洲藥典》9.0版和《英國藥典》2018年版限度則為按無水物計算，應(yīng)為95.0%～104.0%；二是萃取劑不同，《中國藥典》2015年版采用三氯甲烷作為萃取劑，而《美國藥典》41版、《歐洲藥典》9.0版和《英國藥典》2018年版則采用二氯甲烷作為萃取劑；三是滴定度的表述不同， 《中國藥典》2015年版規(guī)定每1 ml碘酸鉀滴定液(0.05 mol/L)相當于35.40 mg的C22H40ClN。而《美國藥典》41版、《歐洲藥典》9.0版和《英國藥典》2018年版則規(guī)定每1 ml碘酸鉀滴定液(0.05 mol/L)相當于X/10 mg的苯扎氯銨，X是平均相對分子量。

由于不同廠家生產(chǎn)的苯扎氯銨同系物組成不同，而苯扎氯銨不同取代同系物的抑菌譜又有差異[7]，因此，有必要對苯扎氯銨的同系物組成及其比例進行質(zhì)量控制，而本文建立的高效液相色譜法操作簡單快速，方法準確，可以應(yīng)用于鮭魚降鈣素鼻噴劑中防腐劑苯扎氯銨的含量測定。