劉之熙 閔軍 劉三雄 劉利成 胡敏 李詠誼

摘 要：香稻是一種具有芳香氣味的特種稻資源，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。通過克隆香味基因Badh2啟動子區(qū)插入序列badh2-p，構(gòu)建啟動子區(qū)插入突變表達載體pCAMBIA 1300-badh2-pi，轉(zhuǎn)化水稻品種C5。采用qRT-PCR分析Badh2基因的表達量，同時利用GC-IMS聯(lián)用技術(shù)測定香味物質(zhì)2-AP和其他揮發(fā)性有機物的含量。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因株系葉片中Badh2基因的表達水平都升高了，其中有2株的Badh2基因表達水平極顯著升高；轉(zhuǎn)基因株系葉片中大部分揮發(fā)性化合物的含量高于野生型C5，2-AP濃度與Badh2基因的相對表達量水平成正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：水稻；Badh2基因；啟動子區(qū)插入突變；香味；分子機制

中圖分類號：S511文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2023）10-0001-06

Function and effect analysis of Badh2 Gene in rice

LIU Zhi-xi， MIN Jun， LIU San-xiong， LIU Li-cheng， HU Min， LI Yong-yi

（Hunan Rice Research Institute， Key Laboratory of Indica Rice Genetics and Breeding in the Middle and Lower Reaches of Yangtze River Valley， Ministry of Agriculture， Changsha 410125， PRC）

Abstract：Fragrant rice is a kind of special rice resource with aromatic smell， which has high nutritional and economic values. By establishing promoter insertion mutation of Badh2 gene， analyzing Badh2 gene expression， and determining content difference of 2-AP and other volatile organic compound， the relationship between promoter insertion mutation of Badh2 gene and aroma formation， and the molecular mechanism of rice aroma formation were explored. The results showed that the expression levels of Badh2 gene in the leaves of transgenic strains increased， with two of them showing extremely significant increases; the content of most volatile compounds in the leaves of transgenic strains was higher than that of wild-type C5， and the concentration of 2-AP was positively correlated with the relative expression level of Badh2 gene.

Key words：rice; Badh2 gene; promoter insertion mutation; fragrance; molecular mechanism

收稿日期：2022-12-20

基金項目：湖南省自然科學(xué)基金青年基金項目（2019JJ50334）；湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新資金項目（2018QN06）

作者簡介：劉之熙（1981—），女，山西長治市人，副研究員，主要從事水稻分子育種和種子質(zhì)量檢測技術(shù)研究。

水稻（Oryza sativa L．）是世界上最重要的糧食作物之一，全世界有近 30 億人口以水稻為主食[1]。香米不僅在蒸煮后清香可口，更具有很高的營養(yǎng)價值。同時香米在國際市場上廣受歡迎，價格比非香大米高2倍以上，這也為香稻研究提供了廣闊的市場前景。

香稻含有多種揮發(fā)性化合物，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)直接與水稻香味相關(guān)的揮發(fā)性物質(zhì)為2-乙酰1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2-A'P）[2-3]。由于甜菜堿醛脫氫酶基因Badh2功能的缺失，翻譯提前終止而產(chǎn)生無功能的BADH2蛋白，中斷了2-AP合成底物γ-氨基丁醛的代謝，使其轉(zhuǎn)而生成了香味物質(zhì)2-AP[4]。Badh2基因位于8號染色體上[5]，由 15 個外顯子和 14 個內(nèi)含子組成，常見的突變類型為第7外顯子8 bp缺失和3個SNP差異導(dǎo)致的移碼突變，以及第2外顯子上7 bp缺失造成的翻譯提前終止[6-7]。隨著香味基因的克隆和香稻資源的收集，共發(fā)現(xiàn)有20余種badh2的等位基因[8-11]。除了編碼區(qū) SNPs 或 InDels 引起非同義突變或移碼框突變而導(dǎo)致無功能的BADH2蛋白產(chǎn)生的變異類型外，還有一些Badh2基因的變異發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)、啟動子區(qū)及5'UTR區(qū)，攜帶這些變異類型的水稻品種大多散發(fā)獨特的香氣。

筆者前期利用二代測序技術(shù)對3個香稻品種XW13、YZX及XW17進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)3個香稻品種的Badh2基因序列一致，在編碼區(qū)無明顯變異的情況下，啟動子區(qū)距離ATG -1487 bp處有一個8 bp的插入突變，這種變異類型在已測序并公開發(fā)表的76份香稻資源的Badh2基因序列中也有發(fā)現(xiàn)，命名為 badh2-p[12]。但該變異類型如何影響B(tài)adh2基因的表達，從而使水稻產(chǎn)生香味的遺傳機制還未見報道。研究通過克隆badh2-p，構(gòu)建啟動子區(qū)插入序列與非香品種編碼區(qū)序列的雙元表達載體轉(zhuǎn)化水稻品種C5，分析Badh2基因的表達差異并測定香味物質(zhì)2-AP和其它揮發(fā)性有機物成分的差異，分析該位點變異對香味形成的遺傳效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因受體C5由湖南省水稻研究所水稻輕簡安全高效遺傳改良創(chuàng)新團隊提供。經(jīng)測序驗證，C5中Badh2基因的變異類型為第7外顯子存在8 bp缺失，即badh2-E7。

1.2 badh2-p的克隆及載體的構(gòu)建

試驗采用CTAB法提取香稻品種XW13葉片DNA，并以其為參考序列設(shè)計Badh2基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)擴增引物，p1（+）：5'- CGATGGTCTCACAACGAAGGCTATTTTAATTTTATT ATTGTTAGATTTTTTTTGCCTAA-3'；p1（-）：5'- CGATGGTCTCATGGTGGAGTGGAGCGTTGAGG TGGAAAGCGATAGGTATCTTTCTATCT-3'，ba（+）：5'-CGATGGTCTCAACCAATGGCCACGGCGATCCCGCAGCGGCAGCTCTTCGTCGCCGGCGA-3'；ba （-）：5-'CAGTGGTCTCATACATTACAGCTTGGAAGGGGATTTGTACCATCCCCACGGCTCATCGG-3'。擴增片段通過同源重組連接到植物表達載體pCAMBIA 1300上，構(gòu)建啟動子區(qū)插入突變植物表達載體pCAMBIA 1300-badh2-pi。

1.3 T1代轉(zhuǎn)基因植株鑒定

將經(jīng)過驗證的表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞EHA105中，浸染并轉(zhuǎn)化C5愈傷組織，通過潮霉素抗性基因特異引物篩選T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株。取陽性株系和野生型各20粒種子種植，在苗期采用CTAB法提取基因組DNA，利用潮霉素抗性基因特異引物對T1代轉(zhuǎn)基因植株進行篩選。hyg（280）-F： 5'-ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC-3'；hyg（280）-R：5'-TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGA-3'。PCR反應(yīng)體系（10 ?L）為：2×Taq Master Mix 5 ?L、 正反向引物各0.2 ?L、DNA 1 ?L和H2O 3.6 ?L。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 4 min； 94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s， 35個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物在4%的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，Gelred核酸染料染色后在紫外燈下拍照。

1.4 Badh2基因的表達量分析

利用RNA-easy Isolation Reagent提取試劑盒分別提取T1代轉(zhuǎn)基因與野生型植株齊穗期葉片的總RNA，采用HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，然后利用熒光定量 PCR分析 Badh2基因在轉(zhuǎn)基因和野生型植株中的表達量。以Actin 基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR 反應(yīng)體系如下：cDNA 模板 3 μL，2×SYBR? qPCR? Mix? （TOYOBO） 10 μL，正反引物（10 μmol/L）各 1 μL，dd H2O 補足至 20 μL。PCR 擴增程序如下：95℃下預(yù)變性 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，45 個循環(huán)。利用公式 2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量。

1.5 揮發(fā)性化合物分析測定

根據(jù)qRT-PCR結(jié)果，在齊穗期選取T1代轉(zhuǎn)基因植株中Badh2基因表達量極顯著上升的單株和野生型單株，采用GC-IMS聯(lián)用技術(shù)測定其中揮發(fā)性有機物成分的含量。各剪取0.5 g葉片置于20 mL頂空瓶中，60℃孵育15 min，密封后備用，每個樣品做3 個平行。

GC-IMS測定條件：采用自動頂空進樣；頂空孵化溫度60 ℃；孵化時間15 min；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；進樣針溫度85 ℃；進樣體積500 μL，不分流模式；色譜柱MXT-5（15 m×0.53 mm，1 μm）；柱溫60 ℃；分析時間20 min；載氣為高純N2（純度≥99.99%）；柱流速初始為2 mL/min，保持2 min，2～10 min柱流速線性增加至10 mL/min，10～20 min柱流速線性增加至100 mL/min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用儀器自帶分析軟件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）和3款插件（Reporter插件、Gallery Plot插件、Dynamic PCA插件）以及GC×IMS Library Search進行揮發(fā)性化合物分析；采用SPSS 25.0進行顯著性分析，顯著性差異為P＜0.05，Origin 2020軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

利用CTAB法提取香稻品種XW13葉片DNA，以其為參考序列設(shè)計Badh2基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)擴增引物，擴增片段通過同源重組連接到植物表達載體pCAMBIA 1300上，構(gòu)建啟動子區(qū)插入突變植物表達載體pCAMBIA 1300-badh2-pi（圖1）。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化C5愈傷組織，通過潮霉素抗性基因特異引物篩選T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株，獲得轉(zhuǎn)基因T0代陽性植株31株（圖2）。

2.2 T1代轉(zhuǎn)基因株系中香味基因Badh2 相對表達量的檢測

T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株自交獲得T1代，在苗期利用潮霉素抗性基因特異引物對T1代轉(zhuǎn)基因植株進行篩選。將陽性單株移栽，齊穗期分別提取T1代轉(zhuǎn)基因與野生型植株葉片的總RNA，利用熒光定量 PCR進行Badh2基因總mRNA表達分析。結(jié)果顯示，31株轉(zhuǎn)基因株系葉片中Badh2基因表達水平均有升高，其中2株轉(zhuǎn)基因株系Badh2基因表達水平極顯著升高，分別為：311-3，311-4；4株轉(zhuǎn)基因株系Badh2基因表達水平顯著升高，分別為：311-7，311-18，311-26，311-29（圖3～圖5）。

2.3 轉(zhuǎn)基因株系揮發(fā)性化合物GC-IMS分析

選取Badh2基因表達量極顯著上升的單株311-3、311-4，及野生型C5單株齊穗期的葉片，采用GC-IMS儀器LAV分析軟件中的Reporter插件程序?qū)Σ煌D(zhuǎn)基因株系和野生型葉片中揮發(fā)性化合物進行三維對比，結(jié)果見圖6。圖6中每一個峰都代表

一種揮發(fā)性化合物，以點的顏色和面積表示含量高低，點的顏色越深、面積越大表示該物質(zhì)含量越高，紅色點表示物質(zhì)含量較高，而白色點表示含量較低。從色彩角度觀察3D譜圖，不同轉(zhuǎn)基因株系較為相似但又存在不同，很難直觀區(qū)分。

為了便于比較不同轉(zhuǎn)基因株系葉片中揮發(fā)性化合物的差異，以野生型C5指紋圖譜作為參比，其他轉(zhuǎn)基因株系圖譜扣除參比，若揮發(fā)性化合物含量相同則扣除背景后為白色，高于參比為紅色，低于參比為藍色，如圖7所示。不同轉(zhuǎn)基因株系的揮發(fā)性化合物含量存在差異，311-3樣品藍色部分和紅色部分較311-4樣品明顯較多，說明311-3和311-4樣品中各有一部分揮發(fā)性物質(zhì)含量高于野生型C5，一部分低于野生型C5，且311-3和311-4樣品的揮發(fā)性物質(zhì)含量存在明顯差異。

2.4 轉(zhuǎn)基因株系葉片中揮發(fā)性化合物的指紋圖譜分析

為了更直觀反映轉(zhuǎn)基因株系葉片中揮發(fā)性化合物的變化規(guī)律及相對含量差異，每個樣品重復(fù)3 次測定，采用Gallery Plot插件繪制揮發(fā)性化合物指紋譜圖。圖中每行代表一個樣品的揮發(fā)性化合物，顏色深淺代表揮發(fā)性化合物的含量高低。由圖8可知，不同轉(zhuǎn)基因株系的揮發(fā)性化合物分布不同，各自有特征峰區(qū)域同時也存在共同區(qū)域。野生型C5和轉(zhuǎn)基因株系之間的差異顯著，紅框所示物質(zhì)在各自樣本中含量相對較高。其中，香稻典型性香氣成分—2-AP（爆玉米花、茉莉花香）在311-3中濃度最高，在311-4中濃度次之，在C5中濃度最低，這與Badh2基因在3個單株中的相對表達量水平成正相關(guān)。311-3中異戊醛（具有蘋果香氣）、1-戊烯-3-醇（水果香味）、反-2-庚烯醛（具青草香氣）、庚醛（水果香味）、2-戊基呋喃（具豆香、果香等香氣）、2-庚酮（梨香）等含量較高；311-4中2-甲基丁醛（咖啡、可可香氣）、2-丁酮（甜醋、似橙皮香氣）、丁醛、乙偶姻（呈奶油香氣）、2-乙基呋喃（甜香和咖啡似香氣）、2-乙?；秽ㄓ行尤?、堅果、焦糖似香氣）、苯甲醛（苦杏仁氣味）、異丁酸異丁酯（呈菠蘿、葡萄皮香氣）、水楊酸甲酯（具有冬青葉香味）等含量較高；C5中反-2-辛烯醛（呈脂肪和肉類香氣）、反-2-戊烯醛（呈土豆和豌豆似香氣）、正戊醇（略有奶油香氣）、順-2-戊烯醇（綠茶陳化風(fēng)味）等揮發(fā)性化合物含量最高。2，4-庚二烯醛（水果香味）、丙酮（似薄荷香氣）、2-己烯醇等揮發(fā)性物質(zhì)在不同株系中含量接近。由圖8可知，轉(zhuǎn)基因株系大部分揮發(fā)性化合物含量高于野生型C5，且311-3、311-4中部分揮發(fā)性物質(zhì)含量增加較為明顯。

2.5 轉(zhuǎn)基因株系葉片揮發(fā)性化合物的主成分分析

主成分分析是多元統(tǒng)計分析中一種無標簽的數(shù)據(jù)降維方法，并能最大限度保留樣本原始信息。采用Dynamic PCA插件對轉(zhuǎn)基因株系和野生型C5揮發(fā)性化合物進行主成分分析，可以更直觀地判別區(qū)分并可視化不同株系揮發(fā)性化合物的差異。由圖9可知，野生型C5和2個轉(zhuǎn)基因株系均能夠較好地分離。其中，野生型C5和311-3之間的距離較遠，表明兩者之間揮發(fā)性化合物存在較大差異。而野生型C5和311-4距離較近，表明二者之間的揮發(fā)性化合物差異較小。主成分結(jié)果表明，GC-IMS分析結(jié)果能夠較好地判別和區(qū)分不同的株系。

3 討 論

前人對控制香味性狀的甜菜堿醛脫氫酶基因（Badh2）的研究主要集中在編碼區(qū)和內(nèi)含子區(qū)堿基的插入、缺失或突變，對啟動子區(qū)的變異研究較少。本文通過建立啟動子區(qū)插入片段突變轉(zhuǎn)化體系，分析其與野生型Badh2基因的表達水平、香味物質(zhì)2-AP的含量差異及其它揮發(fā)性有機物成分的差異，發(fā)現(xiàn)該啟動子區(qū)插入突變會引起B(yǎng)adh2基因RNA水平顯著上升，2-AP含量和大部分揮發(fā)性化合物含量也明顯提高。究其原因，可能是因為轉(zhuǎn)基因株系中2-AP代謝通路上某些酶（鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶、吡咯啉-5-羧酸合成酶）含量增加，導(dǎo)致谷氨酸-脯氨酸相互轉(zhuǎn)化過程中間物1-吡咯啉-5-羧酸的積累，能夠生成1-吡咯啉，最終與乙酰基團結(jié)合生成2-AP，從而導(dǎo)致2-AP含量和大部分揮發(fā)性化合物含量出現(xiàn)了明顯的上升。具體的調(diào)控機理與分子機制，目前正在深入的分析研究中。

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（責(zé)任編輯：高國賦）