馬欣旭，薛姍姍，張 甜，陳怡環(huán)，蔡 敏 (空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心身科，陜西 西安 710032)

抑郁癥以顯著而持久的情緒低落為主要特征，同時伴有睡眠質量差、食欲減退、反應遲鈍、注意力不集中和興趣缺失等癥狀[1]。據世界衛(wèi)生組織數據顯示，全球目前約有3.5億人患有抑郁癥[2]，目前抑郁癥多采用藥物治療、心理治療和物理治療等方案，但其療效不盡如人意[3]，因此進一步探究抑郁癥患者的發(fā)病機制具有重要的科學意義。

腸道菌群可通過腸-腦軸調節(jié)腦功能，在情緒加工和行為決策中起關鍵作用[4-6]。近年來的大量研究證實，抑郁癥患者菌群失調，且放線菌門、擬桿菌、腸桿菌科、腸桿菌屬的增加及毛螺菌門、普拉梭菌的降低與抑郁癥狀相關[7]，抗生素、益生菌治療能有效緩解，這提示腸道菌群紊亂也是抑郁癥的發(fā)病機制之一，但腸道菌群失調導致抑郁的具體分子機制并不清楚。

海馬內源性大麻素(endocannabinoid，eCB)系統在抑郁癥病理生理機制中的作用受到廣泛關注，海馬eCB信號的異常與抑郁樣行為有關[8]。已有研究發(fā)現，“偽無菌”小鼠接種抑郁小鼠腸道菌群后，表現出明顯的抑郁樣行為，其海馬神經發(fā)生減少，腦內2-花生四烯酸甘油(2-arachidonoylglycerol，2-AG)水平顯著下降[9]。然而，移植抑郁癥患者腸道菌群對小鼠海馬eCB系統的作用及其與抑郁樣行為之間的相關性尚未見報道，因此本研究以“偽無菌”小鼠為研究對象，分別接種抑郁癥患者和健康個體腸道菌群，觀察小鼠抑郁樣行為并探討對海馬eCBⅠ型受體(cannabinoid type 1 receptor，CB1R)二?；视椭久甫?diacylglycerol lipase α，DAGLα)和N-?；字Ｒ掖及妨字窪(N-acyl phosphatidylethanolamine phospholipase D，NAPE-PLD)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性C57BL/6J小鼠購于空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明(即保持12 h晝夜交替)，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度保持在(55±5)%。飼養(yǎng)環(huán)境安靜且干凈整潔，飼養(yǎng)期各組小鼠可自由獲得食物和水。本實驗經空軍軍醫(yī)大學實驗動物福利與倫理委員會批準(許可證號：KY20193307-2)，實驗過程遵循神經科學和行為學實驗中關于哺乳動物的飼養(yǎng)和使用規(guī)定。

1.1.2 主要試劑 無菌PBS(AG29791799，cytiva，美國)；甘油(C3H803，信泰生物，中國)；氨芐西林(NO907A，meilunbio，中國)；慶大霉素(00420A，meilunbio，中國)；甲硝唑(01224A，meilunbio，中國)；新霉素(S0912A，meilunbio，中國)；萬古霉素(J0628B，meilunbio，中國)；液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(HB5190，海博生物，中國)；瓊脂(EZ6688B172，BioFroxx，德國)；RIPA強裂解液(BA0615，中暉赫彩，中國)；BCA定量試劑盒(WB319621，Thermo Scientific，美國)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(PE012，中暉赫彩，中國)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(CW0022，康為世紀，中國)；anti-CB1R(ab259323，1∶500，Abcam，英國)；anti-DAGLα(#13626，1∶250，Cell Signaling，美國)；anti-MAGL(100035，1∶200，Abcam，英國)；anti-NAPE-PLD(ER 191-52，1∶200，華安生物，中國)；anti-FAAH(101600，1∶200，Cayman，美國)；anti-β-actin antibodies(ab8227，1∶5 000，Abcam，英國)。

1.1.3 主要儀器 行為錄像系統(一唯科技，中國)；Top Scan行為分析系統(TopScan3D，Clever Sys，美國)；冷凍高速離心機(75002420，Thermo Scientific，美國)；冷凍型高通量組織研磨器(SCIENTZ-48L，Scientz，中國)；酶標儀(A51119500C，Thermo Scientific，美國)；電泳儀(00001，Bio-Rad，美國)；轉膜儀(1704150，Bio-Rad，美國)；凝膠成像分析系統(1708265，Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計 小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，建立“偽無菌”小鼠模型，隨后將“偽無菌”小鼠隨機分為對照組和抑郁組，其中，對照組6只，接種健康個體腸道菌群3周；抑郁組10只，接種抑郁癥患者腸道菌群3周。在糞菌移植結束后進行行為學測試(包括糖水偏好實驗、曠場實驗和懸尾實驗)。

1.2.2 “偽無菌”模型構建 參考趙慧亮等[10]報道的方法，將氨芐西林、慶大霉素、甲硝唑、新霉素(均為0.250 mg/d)和萬古霉素(0.125 mg/d)制備成抗生素“雞尾酒”，通過灌胃的方式使用抗生素“雞尾酒”連續(xù)灌胃14 d以廣泛清除小鼠的腸道菌群。最后一次抗生素灌胃結束48 h后，開始進行糞菌移植重建腸道微生物群[11]。

1.2.3 菌液制備及糞菌移植

1.2.3.1 抑郁癥患者糞便采集 選擇空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院2021年5月至7月心身科門診抑郁癥患者6人，平均年齡(48.33±2.88)歲，平均病程(1.79±1.76)年，漢密爾頓抑郁量表(Hamilton Depression Scale，HAMD)評分(24.3±4.5)分。本研究方案通過空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批(許可證號：KY20193307-2)。入組前已將本研究可能存在的風險和受益，具體研究計劃告知患者和家屬。所有患者表示理解并簽署紙質版知情同意書后收取其糞便樣本。

抑郁癥患者納入標準：18～65歲；符合《美國精神障礙診斷與統計手冊第五版》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders Fifth Edition，DSM-5)抑郁障礙的診斷標準；HAMD-17評分≥18分；入組前未使用過抗精神病藥物、抗抑郁藥及鎮(zhèn)靜催眠類藥物，且未接受過心理治療和物理治療；最近1個月內未使用益生元、益生菌和益生菌發(fā)酵食物；未使用任何抗生素。排除標準：患有其他符合DSM-5診斷標準的精神障礙；患有炎性腸病、克羅恩病、胰腺炎、脂肪肝等消化系統疾病者及患有其他器質性疾病者；肥胖，體質量指數≥28.0 kg/m2；高血糖，空腹血糖≥6.1 mmol/L和/或2 h內血清總膽固醇≥7.8 mmol/L和/或確診為糖尿病后已進行治療者；甘油三酯≥2.3 mmol/L；高血壓，收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg；飲食嚴重不均衡者，如高脂肪飲食偏好者或長期素食者；有酒精或其他物質依賴或濫用者；妊娠期或哺乳期抑郁癥患者[12-13]。

健康個體納入標準：18～65歲；既往未曾患過任何精神障礙疾病，HAMD-17評分<8分。排除標準：患有其他精神疾病和其他軀體疾病，尤其是胃腸道疾?。挥袊乐刈詺A向者；有酒精或其他物質依賴或濫用者；妊娠期或哺乳期女性抑郁癥患者；最近1個月內接受過抗生素或益生菌治療[12-13]。

1.2.3.2 菌液制備 使用糞便取樣器采集抑郁癥患者和健康個體糞便2～3管，稱取1 g糞便，加入5 mL無菌PBS吹打混勻，用紗布制成0.25 mm孔徑的篩子，過濾除去雜質，收集濾液；將濾液分裝至2 mL管中，6 000g，4 ℃離心15 min，棄上清；加入1 mL無菌PBS重懸沉淀，將菌液稀釋至106、107、108、109、1010cfu/mL。將各濃度菌液吸取100 μL進行平板涂布，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，20 h后取出并用平板計數法計算菌落數，用無菌PBS將菌群終濃度稀釋為2.5×1010cfu/mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 糞菌移植 待“偽無菌”小鼠模型建立成功后，將小鼠隨機分為對照組和抑郁組兩組，分別灌胃抑郁癥患者及對照組的腸道菌群混懸液(10 μL/g)，每周一、三、五灌胃，持續(xù)3周以重建腸道微生物群[11]。

1.2.4 行為學實驗 行為學測試在最后一次糞菌移植24 h后進行。每次實驗前，需將小鼠置于實驗環(huán)境中至少適應30 min。

1.2.4.1 糖水偏好實驗 將各組小鼠進行單籠飼養(yǎng)，給予兩瓶20 g/L蔗糖適應24 h，然后用飲用水代替其中一瓶20 g/L蔗糖，適應24 h，時間中點(即12 h后)交換蔗糖和飲用水水瓶的位置。適應性訓練結束后剝奪小鼠食物和水24 h。在測試階段，預先稱重飲用水和20 g/L蔗糖溶液，小鼠自由飲用液體2 h(自由飲用1 h后交換兩個水瓶的位置)。測量蔗糖和飲用水的消耗量，計算蔗糖偏好率。蔗糖偏好率=[蔗糖消耗量/(蔗糖消耗量+飲用水消耗量)]×100%。

1.2.4.2 曠場實驗 用750 mL/L乙醇將曠場擦拭干凈后，將小鼠置于曠場行為觀察箱(50 cm×50 cm×40 cm)中，10 s適應期后通過位于曠場正上方的攝像機記錄小鼠行為10 min，采用Top Scan行為學分析系統(Top Scan，Clever Sys Inc，美國)分析小鼠進入曠場及曠場中心區(qū)的次數、中心區(qū)停留時間、中心運動距離、運動總距離、中心區(qū)時間比、中心運動距離比等。

1.2.4.3 懸尾實驗 將動物尾部懸吊，膠布粘在離小鼠尾端2 cm處，使小鼠呈倒懸體位，頭部離懸尾箱底部20 cm；攝像機記錄小鼠行為6 min，采用Top Scan行為學分析系統分析后5 min小鼠的不動持續(xù)行為。

1.2.5 Western blotting 行為學實驗結束后處死小鼠，迅速剝離海馬組織，并加入組織裂解液，經勻漿和離心后，制備蛋白樣品。使用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。樣品通過SDS-PAGE凝膠電泳進行分離并轉移到PVDF膜上(每通道總蛋白40 μg)，50 g/L脫脂奶粉室溫搖床封閉，后加入特異性一抗進行過夜孵育(4 ℃)。漂洗后加入相應二抗，最后使用凝膠成像分析系統(Bio-Rad，美國)檢測相關分子。使用圖像分析系統測定各蛋白的相對含量。

2 結果

2.1 糞菌移植對小鼠抑郁樣行為的影響

行為學結果顯示，與對照組比較，抑郁組進入中心區(qū)次數、中心區(qū)運動距離、運動總距離、中心區(qū)停留時間比、蔗糖攝入量均顯著減少，懸尾不動時間顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.05，表1)，表明抑郁癥患者腸道菌群可使小鼠產生抑郁樣行為。

2.2 各處理組海馬eCB相關分子表達的比較

Western blotting結果顯示，與對照組比較，抑郁組小鼠海馬組織中CB1R、eCB N-花生四烯酸氨基乙醇(anandamide，AEA)和2-AG的合成酶DAGLα、NAPE-PLD表達水平均明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)，表明抑郁癥患者腸道菌群可顯著改變小鼠海馬組織中大麻素相關分子的表達。

CB1R：海馬eCBⅠ型受體；DAGLα：二?；视椭久甫?；NAPE-PLD：N-酰基磷酯酰乙醇胺磷脂酶D。aP<0.05，bP<0.01。圖1 兩組小鼠海馬CB1R、DAGLα、NAPE-PLD蛋白表達情況

2.3 海馬eCB分子表達量與抑郁樣行為的相關性分析

對各組海馬eCB相關分子表達量和行為學指標進行相關分析后發(fā)現，海馬DAGLα蛋白表達量與進入曠場中心區(qū)次數、中心區(qū)運動距離和糖水偏好率均呈正相關，與懸尾不動時間則呈負相關，且有顯著性差異(P<0.05)；海馬NAPE-PLD蛋白表達量與進入曠場中心區(qū)次數、中心區(qū)運動距離、中心區(qū)停留時間比和糖水偏好率均呈正相關，與懸尾不動時間則呈負相關，有統計學差異(P<0.05，表2)。上述結果提示，小鼠海馬中的eCB相關蛋白表達量與抑郁樣行為密切相關，可能在抑郁癥患者腸道菌群所致抑郁過程中起著重要作用。

表2 海馬eCB相關分子與小鼠行為學指標的Pearson相關分析

3 討論

腸道菌群是人體最大的細菌儲存庫，總數高達1014，也被稱為“第二大腦”。近年來，大量研究證實腸道菌群可通過微生物-腸-腦軸調節(jié)情緒和行為，在抑郁癥發(fā)病機制中扮演重要角色。糞菌移植可將供體腸道菌群移植到受體腸道內并使其長期穩(wěn)定生長。動物研究表明，“偽無菌”小鼠接種抑郁小鼠腸道菌群后表現出明顯抑郁樣行為[14-16]，外源性補充益生元或益生菌可調節(jié)情緒，減少抑郁焦慮樣行為[17-19]。然而，實驗動物的生理代謝及腸道菌群構成與人的腸道菌群組成和代謝有明顯差異。人源化菌群小鼠可有效控制宿主遺傳背景、環(huán)境因素和菌群等，還可提供豐富的生物學信息，縮小動物與人的腸道菌群差異，有效避免人體實驗倫理問題。因此，采用人源化菌群小鼠探討人腸道菌群與人類疾病的關系是目前研究腸道菌群的重要手段之一[20]。研究表明，“偽無菌”大鼠和無菌小鼠接種抑郁癥患者腸道菌群后均表現出明顯的抑郁樣行為，且與腸道微生物的豐度和多樣性的降低有關[21-22]；乳酸桿菌和雙歧桿菌治療可改善其抑郁樣行為[23-24]。與上述研究結果相一致，本研究構建了“偽無菌”小鼠，發(fā)現較接種健康個體腸道菌群的小鼠，接種抑郁癥患者腸道菌群的小鼠出現明顯的抑郁樣行為，表現為：進入曠場中心區(qū)次數減少、曠場中心區(qū)運動距離下降、曠場中心區(qū)停留時間比降低、糖水偏好減少、懸尾不動時間增加。上述發(fā)現提示本研究構建的“人源化”抑郁小鼠模型具有明顯的抑郁表型，可用于后續(xù)指標的觀察。

eCB系統作為一種逆行脂質信號系統，參與多種神經系統生理功能。近年來，eCB系統在抑郁癥發(fā)展過程中的作用已被證實[25]。eCB系統包括eCB及其受體兩部分，eCB主要有AEA和2-AG兩種，分別由NAPE-PLD和DAGLα合成；eCB受體主要包括CB1R和CB2R，CB1R主要分布于海馬、杏仁核、邊緣系統以及額葉皮層等與抑郁密切相關的腦區(qū)?；A研究發(fā)現，慢性不可預見溫和應激模型(chronic unpredictable mild stress，CUMS)大鼠海馬的CB1R和DAGLα的mRNA和蛋白水平下調，而氟西汀或電針干預可逆轉該變化[26-27]。也有研究發(fā)現，CUMS大鼠海馬內CB1R、DAGLα和NAPE-PLD蛋白表達下調，重復經顱磁刺激治療后可逆轉該變化[9]。本研究發(fā)現，“人源化”抑郁小鼠海馬的CB1R和eCB合成酶DAGLα和NAPE-PLD表達下調，提示抑郁癥患者糞菌移植可能降低了海馬AEA和2-AG合成，從而抑制eCB系統活性。這一結果與CHEVALIER等[9]的研究相一致，提示抑郁癥患者糞菌移植和抑郁小鼠糞菌移植存在相似的機制，而eCB則可能是其作用的關鍵機制之一。

我們進一步對行為學與海馬eCB表達進行了相關性分析。發(fā)現海馬DAGLα蛋白表達量與進入曠場中心區(qū)次數、中心區(qū)運動距離和糖水偏好率呈正相關，與懸尾不動時間則呈負相關；而海馬NAPE-PLD蛋白表達量與進入曠場中心區(qū)次數、曠場中心區(qū)運動距離、曠場中心區(qū)停留時間比、糖水偏好率均呈正相關，與懸尾不動時間呈負相關，說明DAGLα和NAPE-PLD均與抑郁樣行為相關，而且NAPE-PLD的關聯性更為顯著。已有研究證實，抑郁小鼠海馬組織內AEA和2-AG含量下降，且抑郁小鼠腸道菌群亦可導致其海馬組織內AEA和2-AG含量下降[9]。有研究表明，慢性應激大鼠海馬內2-AG含量降低，給予CB1R拮抗劑AM251抑郁樣行為得到緩解，海馬內2-AG含量上升，且藥物上調AEA和2-AG可緩解小鼠抑郁樣行為[28]。此外，2-AG在應激反應和負反饋中起重要作用，JZL184阻斷2-AG水解可產生抗抑郁作用，并增強抑郁小鼠的海馬神經發(fā)生和突觸可塑性。AEA作為另一種內源性配體，也參與了海馬突觸可塑性[27]。上述研究提示，DAGLα和NAPE-PLD表達降低，可能與抑郁癥患者糞菌移植導致抑郁樣行為密切相關。

此外，AEA由ω-6多不飽和脂肪酸(N6-polyunsaturated fatty acids，N6-PUFA)衍生物花生四烯酸(arachidonic acid，AA)衍生而來，N6-PUFA可促成AEA合成。通過飲食補充ω-3多不飽和脂肪酸(N3-polyunsaturated fatty acids，N3-PUFA)可上調AA[29]，長期缺乏N3-PUFA可致小鼠出現焦慮抑郁樣行為，其eCB信號通路受損；2-AG可由十六烷酸通過甘油二酯轉化而來，外源性補充脂肪酸可以上調eCB水平[30]；此外，無菌小鼠接種CUMS小鼠的腸道菌群后，其海馬eCB水平減少，而外源性給予eCB前體AA或乳酸菌補充物則上調了該模型小鼠海馬eCB水平[30]，對脂肪酸代謝的調節(jié)則是腸道菌群重要的生理功能之一，提示腸道菌群可能通過影響脂肪酸代謝進而調節(jié)海馬eCB表達，從而影響小鼠抑郁樣行為，但尚需進一步的實驗證實。

綜上所述，本研究發(fā)現抑郁癥患者腸道菌群移植可誘導小鼠產生抑郁樣行為，顯著降低小鼠海馬CB1R、DAGLα和NAPE-PLD表達，且小鼠抑郁樣行為的產生與海馬eCB相關分子表達下降有關。我們前期研究發(fā)現抑郁癥患者腸道菌群構成和功能發(fā)生變化，且其甘油脂代謝、甘油磷脂代謝、不飽和脂肪酸等相對豐度降低[12]，腸道菌群可通過調節(jié)細菌代謝物如脂肪酸等調節(jié)海馬eCB系統，說明抑郁癥患者腸道菌群可能通過調節(jié)海馬eCB系統影響其臨床癥狀。但本研究仍具有一定的局限性，只探討了抑郁癥患者和健康個體腸道菌群對小鼠海馬組織CB1R、DAGLα和NAPE-PLD的影響，并未利用藥物或者基因手段阻斷eCB信號，驗證其在糞菌移植中對抑郁癥的影響。因此，海馬eCB系統在人源化糞菌移植實驗動物模型中的作用機制有待進一步研究。