蔣紅英，王依陽，趙 慧，梁宸源，姜瑞嘉，任園園，陳 亮，許百靈，程 功

（1.陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710068；2.美國密蘇里哥倫比亞大學(xué)-核科學(xué)暨工程研究所，密蘇里州MO 65211）

冠狀動(dòng)脈疾病(coronary artery disease，CAD)是全球發(fā)病和死亡的主要原因[1]。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)是治療冠狀動(dòng)脈病變的主要方法之一。然而，臨床工作中發(fā)現(xiàn)有部分患者行PCI術(shù)后仍有心絞痛等心肌缺血相關(guān)癥狀存在。有證據(jù)[2]表明，這些患者中有很大一部分是因?yàn)榇嬖诠跔顒?dòng)脈微血管疾病(coronary microvascular disease，CMVD)。據(jù)報(bào)道[3]，CMVD是心血管不良事件的獨(dú)立預(yù)測因子，與心血管事件的發(fā)生率及死亡率存在顯著關(guān)聯(lián)。因此，探討早期冠心病PCI術(shù)后生物標(biāo)志物對CMVD早期識(shí)別和干預(yù)具有重要意義。有研究[4]表明，纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)水平升高與CMVD之間顯著相關(guān)。研究[5]證實(shí)，血管內(nèi)皮功能障礙是導(dǎo)致CMVD發(fā)病率增加的主要潛在因素，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3)[6]和白細(xì)胞衍生趨化因子2(leukocyte cell-derived chemotaxin 2，LECT-2)[7]均可通過核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)通路促進(jìn)炎癥因子釋放，導(dǎo)致冠脈血管內(nèi)皮損傷，加重心肌灌注不足。目前，國內(nèi)外針對NLRP3，LECT2與CMVD發(fā)生的相關(guān)研究較少。鑒于此，本研究首次基于一種無創(chuàng)性SPECT定量技術(shù)測算CFR診斷冠狀動(dòng)脈微血管疾病，通過檢測冠心病PCI術(shù)后患者血液FIB，NLRP3和LECT-2表達(dá)水平，評價(jià)其與冠心病PCI術(shù)后患者CMVD發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取 2021年 7 月～2022年9月冠心病PCI術(shù)后患者仍有心肌缺血相關(guān)癥狀就診于陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科患者，冠狀動(dòng)脈造影或冠脈CT血管成像檢查提示心外膜冠脈狹窄直徑＜50%，根據(jù)行單電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(single-photon emission computer tomography，SPECT)檢查測定冠狀動(dòng)脈血流儲(chǔ)備(coronary flow reserve，CFR)進(jìn)行分組，CFR＜2.0患者為CMVD組（n=78），CFR≥2.0患者為對照組（n=47）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～80歲，性別不限；②PCI術(shù)后患者出現(xiàn)心肌缺血癥狀經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影/冠脈CT血管成像復(fù)查提示各支心外膜冠脈狹窄直徑＜50%；③簽署知情同意書，自愿參加本次研究；④成功完成了SPECT測定CFR[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患慢性肺源性心臟病、擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌?。虎诓l(fā)上呼吸道感染等對炎癥相關(guān)指標(biāo)影響較大的疾?。虎蹏?yán)重肝功能不全(ALT或AST＞200U/L)、腎功能不全(GFR＜60ml/min)；④心臟超聲檢查提示左室射血分?jǐn)?shù)＜50%；⑤可能引起血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定的嚴(yán)重心律失常；⑥有三磷酸腺苷靜脈注射禁忌癥或?qū)ζ溥^敏。體質(zhì)量指數(shù)（BMI)=體重（kg)/身高2（m)2。本研究經(jīng)陜西省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[倫理審查批件號(hào)（NO）：2022K194]，所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。兩組患者的年齡、體重指數(shù)、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、腦梗史等資料相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.478,-0.732,χ2=0.063,0.454,0.164,0.216,1.642,3.243,均P＞0.05)。

1.2 儀器與試劑 全自動(dòng)血液分析儀[Sysmex，XN-10(B2)]；全自動(dòng)生化分析儀(貝克曼，AU5801)；人NLRP3試劑盒(美國SAB公司)；人IL-18，LECT2試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)。

1.3 方法 收集所有患者一般資料、血液及常規(guī)生化指標(biāo)。抽取所有患者入院時(shí)的空腹靜脈血5ml，以3 000r/min離心15min，離心完成后提取血漿并保存于-80℃待檢。全自動(dòng)血液/生化分析儀檢測血細(xì)胞、血漿生化指標(biāo)，血清NLRP3，IL-18和LECT2蛋白水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測，操作步驟均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。偏態(tài)分布以M (P25，P75) 表示，組間比較用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗(yàn)。二元Logistic回歸分析CMVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，受試者工作特征(recciver operating characteristic，ROC）曲線分析FIB和NLRP3診斷冠心病PCI術(shù)后患者CMVD發(fā)生的預(yù)測價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血液及常規(guī)生化指標(biāo)水平比較 見表1。CMVD組FIB，PLR，HbA1c，NLPR3和LECT-2水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，其他指標(biāo)如PT-T，APTT，WBC，NEU，LYM，MONO，HB，PLT，NLR，LMR，ALT，AST，TBIL，DBIL，TP，ALB，TC，TG，HDL-C，LDL-C，ApoAI，ApoB，ApoE，LP(a)，UREA，CRE，UA和HCY水平組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

表1 兩組血液及常規(guī)生化指標(biāo)水平比較[±s或M（P25，P75）]

表1 兩組血液及常規(guī)生化指標(biāo)水平比較[±s或M（P25，P75）]

項(xiàng) 目CMVD組(n=78)對照組(n=47)t/Z值P值FIB(g/L)3.31±1.092.83±0.771.1030.032 PT-T(s)12.10(11.50，12.70)12.10(11.58，12.45)-0.0230.980 APTT(s)30.00(27.15，32.45)29.50(26.90，32.88)-0.0460.960 WBC(×109/L)6.46±1.726.39±1.410.8440.800 NEU(×109/L)0.60±0.080.58±0.080.3270.250 LYM(×109/L)0.30±0.080.31±0.070.5390.410 MONO(×109/L)0.07±0.020.08±0.021.2740.060 HB(g/L)145.00(137.00，151.00)143.00(134.00，151.25)-0.9430.350 PLT(×109/L)206.00(170.00，246.00)195.50(159.75，218.75)-1.5460.120 NLR2.00(1.56，2.74)1.93(1.45，2.51)-0.9910.320 LMR3.97(3.11，5.21)3.96(2.89，4.62)-0.7090.480 PLR742.69(515.82，968.25)642.23(482.28，767.54)-2.1720.030 ALT(U/L)24.00(16.00，35.50)25.00(17.50，32.50)-0.4090.680 AST(U/L)22.00(19.00，27.00)21.00(18.00，27.00)-0.7390.460 TBIL(umol/L)15.09(11.10，19.40)11.80(9.60，17.89)-2.1750.060 DBIL(umol/L)4.97(3.90，6.60)4.20(3.29，6.00)-1.9010.060 TP(U/L)67.95±9.9268.10±7.860.0010.920 ALB(g/L)41.00(37.50，45.10)42.3(38.55，46.05)0.7400.460 TC(mmol/L)3.40±0.773.64±0.880.9000.110 TG(mmol/L)1.13(0.92，1.47)1.32(0.94，1.82)-1.4700.140 HDL-C(mmol/L)1.12±0.261.09±0.250.1270.500 LDL-C(mmol/L)1.76±0.581.97±0.651.0510.060 ApoAI(g/L)1.28±0.211.30±0.240.7450.570 ApoB(g/L)0.64±0.180.69±0.190.3540.100 ApoE(g/L)33.00(29.50，38.65)33.80(29.40，39.46)-0.6420.520 LP(a)(mg/L)184.00(115.75，477.25)220.20(81.00，473.00)-0.3350.740 UREA(mmol/L)5.76(4.83，6.50)5.55(4.67，6.79)-0.2280.820 CRE(umol/L)70.58±16.1771.85±18.150.1730.690 UA(umol/L)351.88±82.06363.95±105.503.5370.480 HCY(umol/L)18.59±8.4619.51±13.050.9220.830 HbAlc(%)6.20(5.70，7.50)5.80(5.50，6.50)-2.2130.027 NLRP3(pg/ml)343.29(217.20，504.90)245.02(170.00，328.60)-3.2390.001 LECT-2(ng/ml)23.24(14.92，27.24)17.85(10.30，26.41)-2.5920.010

2.2 發(fā)生CMVD危險(xiǎn)因素Logistic 回歸分析 見表2。以CMVD為因變量，血液FIB，PLR，HbA1c，NLRP3，LECT-2水平作為協(xié)變量進(jìn)行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：FIB和NLRP3是冠心病PCI術(shù)后CMVD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P＜0.05)。

表2 發(fā)生CMVD相關(guān)因素的Logistic回歸分析

2.3 ROC曲線預(yù)測 見圖1。以入院時(shí)FIB和NLRP3為檢驗(yàn)變量，以發(fā)生CMVD為狀態(tài)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示曲線下面積（area under the curve，AUC）分別為0.648和0.679，二者聯(lián)合診斷時(shí)AUC為0.712。其中FIB以2.39s為最佳臨界值時(shí)，敏感度和特異度分別為85.7%和41.2%；NLRP3最佳臨界值為304.83pg/ml，敏感度和特異度分別為61.5%和74.5%；二者聯(lián)合診斷的敏感度和特異度分別為81.6%和65.9%。

圖1 ROC曲線分析FIB與NLRP3對CMVD發(fā)病預(yù)測價(jià)值

3 討論

缺血性心臟病是全球死亡和殘疾的主要原因之一[9]。在冠狀動(dòng)脈微血管疾?。–MVD）有心肌缺血癥狀的患者中，冠脈造影檢查表明非梗阻性病變的發(fā)生率為45%～60%[10]。已知CMVD與大血管CAD有許多相似的危險(xiǎn)因素[11-12]，包括吸煙、糖尿病、衰老、高血壓等。本研究中年齡、BMI，性別、吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、腦梗死史這些傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素組間比較差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這同既往研究[11-12]結(jié)果不符，分析原因可能是由于我們的研究例數(shù)太少?zèng)]有對高血壓、糖尿病等傳統(tǒng)因素進(jìn)行亞組分析，導(dǎo)致這些傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素對CMVD的影響被低估而未分析出兩者的相關(guān)性。但我們觀測到HbA1c組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明高血糖可能參與了CMVD的發(fā)生發(fā)展。據(jù)報(bào)道[13]，炎癥與內(nèi)皮功能障礙、動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈微血管疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。因此，尋找更為準(zhǔn)確、可靠的標(biāo)記物指導(dǎo)臨床決策具有重要意義。

纖維蛋白原(FIB)是一種炎癥標(biāo)志物，與冠狀動(dòng)脈疾病的病理生理學(xué)、存在、嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān)[14]。研究[15]證實(shí)，即使在低密度脂蛋白膽固醇高患者中，如果FIB水平低，心血管風(fēng)險(xiǎn)也不會(huì)增加。這表明，F(xiàn)IB在動(dòng)脈壁上的沉積可能是吸附低密度脂蛋白顆粒和觸發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和生長的必要條件。研究[16]表明，梗死相關(guān)冠狀動(dòng)脈機(jī)械再通成功后的基線FIB濃度是心肌再灌注缺乏的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在本研究中，無論單因素和多因素分析均發(fā)現(xiàn)FIB濃度是CMVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素?？紤]與以下作用機(jī)制相關(guān)：①FIB及其代謝物可能導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。黏附在內(nèi)皮表面的纖維蛋白原導(dǎo)致血管活性分子的釋放并擾亂內(nèi)皮通透性，導(dǎo)致FIB沉積在內(nèi)皮下區(qū)域，這為動(dòng)脈粥樣硬化聚集體的細(xì)胞外積累提供了易感的內(nèi)皮表面[17]。此外，F(xiàn)IB可能刺激內(nèi)皮細(xì)胞退化和紊亂，并增加內(nèi)皮細(xì)胞來源生長因子的釋放。所有這些過程都表明FIB在刺激血管炎癥中發(fā)揮作用，并導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[18]。②高FIB濃度可能影響血液流變學(xué)參數(shù)。增加FIB含量可增加血漿黏度、紅細(xì)胞聚集和血小板血栓形成，從而改變血管反應(yīng)性和損害內(nèi)皮細(xì)胞層完整性來影響微循環(huán)[19]。

血小板與淋巴細(xì)胞比值（PLR）。眾所周知，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成同血小板聚集密不可分。有研究[20]表明，PLR是冠心病患者冠脈斑塊穩(wěn)定性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且與預(yù)后密切相關(guān)。因此，PLR越高，提示炎癥和血小板相關(guān)機(jī)制在心血管疾病中的貢獻(xiàn)越大。YILDIZ等人[21]證明高PLR(＞160)是STEMI患者無再流的獨(dú)立預(yù)測因子。除此之外，SZOLC等[22]人研究表明，PLR可作為慢性冠脈綜合征和無明顯心外膜狹窄時(shí)冠脈微血管病變的預(yù)測指標(biāo)。我們的研究與該結(jié)論一致，組間比較中PLR在CMVD組中更高。因此有理由認(rèn)為，高水平PLR可能參與CMVD發(fā)生過程。

核因子-κB（NF-κB）蛋白家族是一種多效轉(zhuǎn)錄因子，它可以特異性地結(jié)合到各種啟動(dòng)子的κB位點(diǎn)以促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，被認(rèn)為是一種典型的促炎信號(hào)通路[23]。既往研究發(fā)現(xiàn)，由于炎癥和細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)可通過NF-κB信號(hào)途徑調(diào)節(jié)微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[24]。在CMVD發(fā)展過程中，冠脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞（coronary microvascular endothelial cells，CMEC）受損是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[25]。CMEC約占心肌細(xì)胞總數(shù)的1/3，CMEC功能障礙往往先于心肌損傷[26]。血管內(nèi)皮在維持血管穩(wěn)定狀態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，內(nèi)皮功能障礙有助于心血管疾病的發(fā)生和進(jìn)展[27]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)是一種多核蛋白復(fù)合體，在心血管疾病中起著重要作用，包括心肌缺血/再灌注、心肌梗死和心臟毒性[28-30]。近年來發(fā)現(xiàn)，NLRP3信號(hào)通路參與了CMEC的損傷。NLRP3介導(dǎo)的信號(hào)通路可激活NF-kB，誘發(fā)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)活化，進(jìn)而促進(jìn)下游白介素-1β及白介素-18的成熟和分泌，引起局部炎癥反應(yīng)，損傷內(nèi)皮功能[31]。另有研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3蛋白在心肌細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，但在CMEC中表達(dá)，這進(jìn)一步表明NLRP3炎性小體在CMEC的病理生理學(xué)中起重要作用[32]。因此，我們認(rèn)為NLRP3炎癥體也可能參與了CMVD的發(fā)展過程。在對NLRP3的相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析中發(fā)現(xiàn)，組間比較CMVD組NLRP3水平更高，Logistic回歸分析提示高NLRP3是CMVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，ROC曲線分析提示NLRP3對CMVD有一定的預(yù)測作用，這表明NLRP3可能通過NF-kB信號(hào)調(diào)節(jié)通路參與CMVD的發(fā)生發(fā)展。

除經(jīng)典的直接參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)蛋白外，近年來發(fā)現(xiàn)還有其他蛋白參與了微血管內(nèi)皮損傷過程的調(diào)節(jié)，白細(xì)胞衍生趨化因子 2 ( LECT2) 是一種主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生的 16 kDa 蛋白，被鑒定為一種新的中性粒細(xì)胞趨化因子。研究[33]表明，LECT2通過NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)，在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起重要作用。JUNG等[34-35]人同樣發(fā)現(xiàn)，LECT2 可通過NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)激活誘導(dǎo)促炎過程，增加人細(xì)胞間黏附因子1、促炎細(xì)胞腫瘤壞死因子α、人單核細(xì)胞趨化蛋白-1和IL-1β的表達(dá)，這些物質(zhì)可導(dǎo)致血管局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致冠脈血管內(nèi)皮的損傷，加重心肌灌注不足。綜合以上文獻(xiàn)回顧，發(fā)現(xiàn)LECT2可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)進(jìn)而引起冠脈血管內(nèi)皮的損傷。本研究經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)兩組患者LECT2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述研究結(jié)論相符，提示高水平LECT2可能通過增加炎癥反應(yīng)損傷微血管內(nèi)皮而影響CMVD。

綜上所述，F(xiàn)IB和NLRP3升高可能是冠心病PCI術(shù)后患者發(fā)生CMVD的危險(xiǎn)因素，兩者具有較好的發(fā)病預(yù)測價(jià)值。但本研究仍有不足之處：首先，本研究是一個(gè)單中心、小樣本量的臨床研究，研究中的數(shù)據(jù)測量可能存在一定的誤差，對影響冠狀動(dòng)脈微血管疾病的危險(xiǎn)因素及生物標(biāo)志物需要大樣本量及更長時(shí)間的研究來進(jìn)一步證實(shí)；其次，F(xiàn)IB和NLRP3都可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)損傷冠脈血管內(nèi)皮進(jìn)而參與CMVD的發(fā)生過程，但其潛在的具體機(jī)制仍不清楚.因此仍需在基礎(chǔ)研究中進(jìn)一步深入探索。