武 坤，馬曉波，楊金榮，聶 波，周 強(qiáng)，程沈菊，羅 珊，曾 云

（1.云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032；2.云南省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，昆明 650032；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 a.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科；b.血液科，昆明 650032; 4.云南省血液病研究中心，昆明 650032）

噬血細(xì)胞綜合征（hemophagocytic syndrome,HPS）是一種臨床危重綜合征，主要由遺傳、獲得性免疫缺陷、重癥感染等導(dǎo)致的無法控制的過度炎癥引起，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、脾腫大、淋巴結(jié)病、黃疸、皮疹、三酰甘油和鐵蛋白水平升高、纖維蛋白原水平降低等[1]。HPS與敗血癥、多臟器衰竭等疾病癥狀相似，臨床表現(xiàn)不具有特異性，并且病情進(jìn)展迅速，因此該病的診斷、治療成為臨床難點(diǎn)[2]。HPS通常伴有免疫細(xì)胞異?；罨琀PS的潛在機(jī)制之一是T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性受損，進(jìn)而引起抗原驅(qū)動(dòng)的繼發(fā)免疫系統(tǒng)激活，釋放大量細(xì)胞因子，造成“因子風(fēng)暴”，對(duì)患者造成重大打擊[3]。由于細(xì)胞因子之間、細(xì)胞因子與免疫細(xì)胞之間均存在復(fù)雜的作用機(jī)制，因此IL-6，IL-8和IL-10等細(xì)胞因子被認(rèn)為是HPS進(jìn)展的關(guān)鍵因素[4]。本研究對(duì)成人HPS患者免疫活細(xì)胞、細(xì)胞因子水平進(jìn)行測(cè)定，并分析其臨床意義，以期為成人HPS診斷、治療研究提供新方向。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年1月～2021年1月入昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的HPS患者60例為研究對(duì)象，其中男性36例，女性24例，中位年齡47（23～74）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合國(guó)際組織細(xì)胞協(xié)會(huì)修訂的《HLH-2004診斷和治療指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②年齡＞18周歲；③臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①兒童HPS；②不同意參加本研究者。另選取120例健康成人作為對(duì)照組，其中男性65例，女性55例，中位年齡44（25～77）歲。HPS組和對(duì)照組間一般資料相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.927,均P＞0.05），具有可比性。該研究已經(jīng)過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且獲得所有研究對(duì)象的知情同意。

1.2 儀器與試劑 CD3-APC，CD56-PE，CD8-PE/cy7，CD28-FITC，CD14-FITC和CD64-PE等抗體（美國(guó)BD公司）；細(xì)胞因子（IL-6，IL-8，IL-10）檢測(cè)試劑盒（青島瑞斯凱爾生物科技有限公司）；FACSCantoIITM流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)方法：使用EDTA，無抗凝劑采血管采集患者和對(duì)照組人群空腹靜脈血（4ml/管），EDTA抗凝管用于細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，無抗凝劑采血管收集血清標(biāo)本用于細(xì)胞因子水平測(cè)定。使用FACSCantoIITM流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血自然殺傷細(xì) 胞（naturalkillcell，NK cell,CD3-/CD56+）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL,CD3+/CD8+/CD28+）和單核細(xì)胞（monocyteCD14+/CD64+）的數(shù)量，及細(xì)胞因子（IL-6，IL-8，IL-10）水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 臨床資料收集：收集HPS患者的一般資料、癥狀和體征，一般資料主要包括年齡和性別，體征主要包括體溫、肝脾淋巴結(jié)腫大情況、皮疹、黃疸、漿膜腔積液及各系統(tǒng)累犯情況等。隨訪資料為總生存時(shí)間（患者開始治療至死亡或末次隨訪的間隔時(shí)間）。

1.3.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)：比較HPS組、對(duì)照組免疫活細(xì)胞和細(xì)胞因子水平。根據(jù)患者處于急性期或緩解期分為急性期組、緩解期組，根據(jù)患者結(jié)局分為存活組、死亡組，比較細(xì)胞因子水平差異。比較總生存時(shí)間差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析；采用Kaplan-Meier法分析細(xì)胞因子表達(dá)水平與患者生存時(shí)間的關(guān)系；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPS患者的臨床癥狀和體征 在60例成人HPS患者中，出現(xiàn)發(fā)熱癥狀的患者60例（100%），肝脾腫大51例（85.0%），淺表淋巴結(jié)腫大22例（36.7%），呼吸系統(tǒng)癥狀31例（51.7%），消化系統(tǒng)癥狀10例（16.7%），神經(jīng)系統(tǒng)癥狀6例（10.0%），黃疸19例（31.7%），皮疹7例（11.7%）。

2.2 HPS組和健康組免疫活性細(xì)胞水平比較 成人HPS患者NK細(xì)胞（CD3-/CD56+）的檢出率（15.59%±2.81%）低于健康對(duì)照人群（23.92%±3.92%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.969，P=0.000）；CTL細(xì)胞（31.07%±3.29%）和單核細(xì)胞（7.59%±1.84%）檢出率均高于健康組（22.53%±5.41%，5.16%±1.72%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.224，8.728，均P＜0.05）。

2.3 HPS組和健康組細(xì)胞因子水平比較 成人HPS患者血漿IL-6（83.2±9.8 pg/ml），IL-8（104.8±14.3 pg/ml），IL-10（211.2±17.3 pg/ml）水平均高于健康組（31.1±7.4 pg/ml，16.5±4.3 pg/ml，26.9±1.9 pg/ml），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=39.824，62.382，115.630，均P＜0.01）。

2.4 急性期和緩解期HPS患者細(xì)胞因子水平比較 急性期HPS患者血漿IL-6（99.8±7.5pg/ml），IL-8（127.6±12.9pg/ml）和IL-10（294.9±24.1pg/ml）水平均高于緩解期（69.1±4.1pg/ml，84.8±6.6pg/ml，137.9±7.7pg/ml），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.004，16.477，34.908，均P＜0.05）。

2.5 細(xì)胞因子水平與HPS預(yù)后之間的關(guān)聯(lián) 死亡組患者IL-6（125.1±16.7pg/ml），IL-8（193.9±25.8 pg/ml）和IL-10（474.7±65.3pg/ml）顯著高于存活 組（75.8±6.3pg/ml，89.2±9.0pg/ml，164.7±18.7pg/ml），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.994，22.777，28.747，均P＜0.05）

采用Kaplan-Meier法分析血漿IL-6，IL-8和IL-10水平與患者生存時(shí)間的關(guān)系，以IL-6，IL-8，IL-10中位值分為高水平、低水平。結(jié)果顯示，IL-6高表達(dá)的HPS患者中位總生存時(shí)間（16.4±2.8月）低于低表達(dá)患者（24.7±5.3月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.229，P＜0.05），見圖1A。IL-8高表達(dá)的HPS患者中位總生存時(shí)間（14.7±3.8月）低于低表達(dá)患者（24.0±1.7月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.608，P＜0.05），見圖1B。IL-10高表達(dá)的HPS患者中位總生存時(shí)間（30.5±5.1個(gè)月）低于低表達(dá)患者（55.3±4.7個(gè)月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=35.411，P＜0.05），見圖1C。

圖1 細(xì)胞因子IL-6 (A),IL-8 (B),IL-10 (C)與HPS患者生存時(shí)間之間的關(guān)聯(lián)

2.6 HPS患者血漿細(xì)胞因子水平隨病程的變化 見表1。所有納入研究的HPS患者，至研究截止有36例獲得長(zhǎng)期臨床緩解（A組），24例處于疾病活動(dòng)、疾病復(fù)發(fā)或最終死亡（B組）。兩組患者血清IL-6，IL-8和IL-10水平隨疾病治療均有下降的趨勢(shì)（均P＜0.05）。

表1 HPS患者血漿細(xì)胞因子水平隨病程的變化（±s,pg/ml）

表1 HPS患者血漿細(xì)胞因子水平隨病程的變化（±s,pg/ml）

項(xiàng) 目 第0 天 第5天 第10 天 第15天 F值 P值IL-6 A組 75.3±3.5 70.5±3.5 66.1±2.7 59.5±1.2 5.33 0.011 B組 92.7±2.3 88.3±0.4 79.7±3.9 72.1±3.7 IL-8 A組 92.7±0.8 85.6±4.7 77.3±5.5 66.7±2.4 1.244 0.026 B組 122.5±8.1 117.4±5.8 97.3±6.4 91.3±2.9 IL-10 A組 137.3±12.7 114.5±10.6 91.5±8.7 82.8±10.2 3.632 0.003 B組 230.6±9.6 227.9±5.1 185.6±14.2 177.2±7.4

3 討論

噬血細(xì)胞綜合征（HPS）發(fā)病迅速，進(jìn)展快，患者預(yù)后差，其典型特征是細(xì)胞因子介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活和增殖異常，導(dǎo)致無法控制的體內(nèi)炎癥應(yīng)答[6]。HPS在兒童中更為常見，但是成人HPS發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高趨勢(shì)，據(jù)最新的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，HPS在中國(guó)漢族人群的總體發(fā)病率約為1.04/10萬，其中成人患者約為35%[7]。HPS無典型的臨床癥狀，誤診、漏診率高，臨床治療難度大[8]。HPS的發(fā)生、進(jìn)展與活化T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子密切相關(guān)[7]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重感染時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂，導(dǎo)致免疫細(xì)胞過度激活并產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，如：IL-6，IL-10，IL-8等，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化，活化的巨噬細(xì)胞進(jìn)而分泌更多細(xì)胞因子，造成“細(xì)胞因子風(fēng)暴”[8-9]。高水平細(xì)胞因子是HPS的主要病理特征。因此，分析成人HPS患者體內(nèi)細(xì)胞因子水平，有助于進(jìn)一步明晰該病發(fā)病機(jī)制和尋找針對(duì)性治療靶點(diǎn)。

本研究首先對(duì)患者的臨床癥狀和體征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示成人HPS患者不同程度地出現(xiàn)發(fā)熱、肝脾腫大、淺表淋巴結(jié)腫大、呼吸系統(tǒng)癥狀、消化系統(tǒng)癥狀、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、黃疸和皮疹等臨床特征，這與以往文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致。HPS是一種以體內(nèi)過度炎癥應(yīng)答為特征的臨床綜合征，其首發(fā)癥狀通常是非特異性的，持續(xù)不明原因的發(fā)熱、肝脾腫大和血細(xì)胞減少被認(rèn)為是HPS的三聯(lián)征，而這些癥狀與免疫細(xì)胞異?；罨?、細(xì)胞因子分泌增多關(guān)系密切[11]。當(dāng)前觀點(diǎn)認(rèn)為，HPS患者通常出現(xiàn)免疫功能調(diào)節(jié)異常，免疫細(xì)胞的增殖、活化及凋亡作用減弱，使體內(nèi)病原體不能被及時(shí)清除，免疫反應(yīng)異?；钴S，免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)正常細(xì)胞進(jìn)行“錯(cuò)殺”，加重機(jī)體損傷[12-13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)成人HPS患者NK細(xì)胞檢出率明顯下降，而CTL細(xì)胞和單核細(xì)胞檢出率明顯升高，提示在成人HPS患者NK細(xì)胞活化受到抑制，而CTL細(xì)胞、單核細(xì)胞則被異常激活。

成人HPS的主要原因是膿毒血癥[12]。此外，免疫細(xì)胞異常激活，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子大量釋放[13]。細(xì)胞因子可以通過多種途徑促進(jìn)免疫反應(yīng)過度激活，驅(qū)動(dòng)HPS的發(fā)生、進(jìn)展。IL-6主要來源于單核巨噬細(xì)胞，可以激活細(xì)胞內(nèi)促炎信號(hào)，增強(qiáng)T細(xì)胞遷移能力和細(xì)胞毒性，抑制Treg細(xì)胞分化[14]。在病毒誘發(fā)的HPS患者中，IL-6水平通常較低，而由自身系統(tǒng)性炎癥應(yīng)答誘發(fā)的HPS則IL-6呈高表達(dá)狀態(tài)[15]。IL-10是由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，可以活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞、B細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)作用[16]。IL-8是中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的引誘劑和激活劑，可由上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，IL-8過度分泌是機(jī)體嚴(yán)重炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。這些細(xì)胞因子持續(xù)分泌進(jìn)入血液循環(huán)，加之免疫細(xì)胞的異?；罨?，最終引起組織損傷和多器官功能衰竭。本研究結(jié)果顯示，成人HPS患者IL-6，IL-8和IL-10水平顯著升高，提示患者體內(nèi)存在嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)急性期患者細(xì)胞因子水平要明顯高于緩解期患者。這些結(jié)果提示炎癥因子可能是該病診斷、治療的潛在靶標(biāo)。

HPS是致死率較高的炎癥綜合征，患者預(yù)后較差。本研究進(jìn)一步探討了細(xì)胞因子與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，患者緩解后IL-6，IL-8和IL-10水平均出現(xiàn)下降，一方面表明細(xì)胞因子升高可能是HPS病情加重的因素之一；另一方面也提示細(xì)胞因子水平可作為患者病情緩解的可靠指標(biāo)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)死亡組患者IL-6，IL-8和IL-10水平明顯高于存活組患者，且高水平細(xì)胞因子患者生存時(shí)間低于低水平患者。這些結(jié)果提示，細(xì)胞因子IL-6，IL-8和IL-10可作為判斷成人HPS患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，成人HPS患者NK細(xì)胞活化受到抑制，而CTL細(xì)胞、單核細(xì)胞則被異常激活，IL-6，IL-8和IL-10水平明顯升高。高水平IL-6，IL-8和IL-10提示成人HPS患者預(yù)后不佳。但本研究收集病例數(shù)較少，對(duì)疾病病因的研究還不夠深入，在后續(xù)研究工作中，我們將繼續(xù)積累病例，進(jìn)一步驗(yàn)證這些細(xì)胞因子在成人HPS中的作用，深入闡明HPS發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制。