劉晴晴，王寧寧，成 軍，周華君，車飛虎，楊春利，孫青陽，王 月，戴玉柱，張英杰（.蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院，安徽蚌埠 33000；.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇三醫(yī)院臨床研究部，杭州 3003）

人腺病毒（human adenovirus，HAdV）是無包膜雙鏈DNA病毒，可引起各種臨床疾病，包括呼吸道感染、肺炎、結(jié)膜炎等[1-3]。據(jù)報道，至少5%～ 10%的兒童和1%～7%的成人呼吸道感染是由HAdV導(dǎo)致的[4-6]。2005年起人腺病毒14型（human adenovirus serotypes 14，HAdV-14）病毒已在多國導(dǎo)致數(shù)次大規(guī)模急性呼吸道感染疫情，引起了病毒學(xué)、流行病學(xué)、傳染病學(xué)等領(lǐng)域?qū)＜业膹V泛關(guān)注[7]。因此，開發(fā)快速、靈敏、特異的HAdV-14診斷方法，及時診斷HAdV-14，對于控制HAdV-14感染擴散和傳播至關(guān)重要。隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）、實時熒光PCR等分子診斷技術(shù)已經(jīng)成為檢測HAdV感染的常用工具[8-11]，但因其需要熱循環(huán)儀難以在醫(yī)療資源相對有限的地區(qū)和醫(yī)院實現(xiàn)。相比之下，重組酶介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)（recombinase-aided amplification，RAA）是一種新型的等溫核酸擴增技術(shù)，不需要高溫變性或低溫退火的過程，反應(yīng)簡捷、快速、高效[12-16]，已成功用于多種病原體的檢測，如2019新型冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎克雷伯菌等[17-20]。因此，本研究針對HAdV-14的Hexon基因設(shè)計特異性引物和探針，將RAA與熒光探針相結(jié)合，擬建立一種快速實時熒光RAA測定法，為HAdV-14的臨床診斷或現(xiàn)場評估提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2017～2022年在中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇三醫(yī)院就診的發(fā)熱性呼吸綜合征患者的50份咽拭子。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有發(fā)熱或呼吸道感染的其他癥狀的住院患者；②符合急性呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)；③實驗室檢測指標(biāo)和臨床信息完整；④進行咽拭子腺病毒核酸檢測。經(jīng)實時熒光PCR明確病原體，包括：5個HAdV-3陽性樣本，1個HAdV-4陽性樣本，5個HAdV-7陽性樣本，1個HAdV-14陽性樣本，1個HAdV-21陽性樣本，5個HAdV-55陽性樣本，10個甲型流感病毒陽性樣本，10個2019新型冠狀病毒陽性樣本，10個呼吸道合胞病毒陽性樣本，1個肺炎支原體陽性樣本和1個肺炎鏈球菌陽性樣本。樣本均通過中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核[批準(zhǔn)文號20230303/01/01/001]。

1.2 試劑與儀器 核酸提取或純化試劑盒（圣湘生物科技股份有限公司），不同病原核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，圣湘生物科技股份有限公司），RAA核酸擴增試劑盒（熒光法，江蘇奇天基因生物科技有限公司），SYBR Green qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒（Biosharp生物技術(shù)公司），ABI 7500熒光PCR儀（Applied Biostems公司），Natch 96核酸提取儀（圣湘生物科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物探針的設(shè)計與合成：在NCBI（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank 數(shù)據(jù)庫檢索并下載HAdV常見亞型的hexon 基因序列，使用Jaview軟件進行多序列比對，以HAdV-14亞型內(nèi)保守亞型間特異的序列（GenBank: AY803294）為靶標(biāo)，根據(jù)之前的研究中提到的RAA引物探針設(shè)計原則，使用Primer 6和Snap Gene設(shè)計引物和熒光探針[21-22]。本研究設(shè)計的引物和探針均由生工生物技術(shù)（上海）有限公司合成，引物探針序列見表1。

表1 用于檢測HAdV-14的RAA引物和探針序列

1.3.2 陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建：將篩選的HAdV-14（GenBank：AY803294）特異性保守序列片段連接到pUC 57載體上，構(gòu)建HAdV-14陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，該質(zhì)粒由生工生物技術(shù)（上海）有限公司直接合成。使用Qubit 2.0熒光測定儀對上述質(zhì)粒進行濃度測定，拷貝數(shù)計算公式如下：濃度(copies/μl)=[6.02×1023×濃度 (ng/μl)×10-9]/[DNA 長度（bp）×660]。將上述質(zhì)粒從106，105，104，103，102，101copies/μl 進行梯度稀釋，隨后保存至-80℃冰箱備用。

1.3.3 樣本核酸提取：從收集的咽拭子及HAdV-14陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（人上皮細胞和HAdV-14陽性質(zhì)粒構(gòu)成的混合懸液）中取300μl，采用磁珠提取法提取核酸，具體操作嚴格按照試劑說明書進行，提取后的核酸-80℃保存，用于進一步檢測和分析。

1.3.4 實時熒光RAA法的建立：構(gòu)建RAA反應(yīng)體系（50μl），在RAA含凍干粉的微型離心管中加入 25μl緩沖液VI，2.1μl正向引物（10μmol/L），2.1μl反向引物（10μmol/L），0.6μl（10μmol/L）探針，5μl的模板，12.7μl純化水。為確保所有反應(yīng)系統(tǒng)同時進行，最后將2.5μl乙酸鎂加到管蓋中，瞬時離心后啟動擴增反應(yīng)，立即置于ABI 7500型實時熒光定量PCR儀中進行熒光檢測。熒光檢測程序設(shè)置為：39℃或40℃或42℃ 30s，60個循環(huán)。

1.3.5 引物探針的篩選：①將設(shè)計的4組候選引物和1組探針進行組合，在相同反應(yīng)體系及擴增條件下使用4組不同的引物探針組合進行RAA擴增，通過比較擴增曲線的閾值時間（threshold time，TT）來篩選最佳的引物探針組合。②熔解曲線分析：將SYBR Green qPCR Mix 熒光定量PCR試劑盒在室溫下溶解并充分混勻，短暫離心后置于冰上，按照試劑盒說明書配制反應(yīng)液，并根據(jù)說明書推薦兩步法PCR程序進行反應(yīng)。將設(shè)計的1個上游引物和4個下游引物進行組合，在相同反應(yīng)體系及擴增條件下使用4組不同的引物組合進行熔解曲線分析。

1.3.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化：將相同反應(yīng)體系在不同溫度下（39℃，40℃，42℃）進行實時熒光RAA擴增，每個溫度重復(fù)5次，比較不同溫度之間擴增曲線的TT，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.3.7 靈敏度分析：將HAdV-14陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋至終濃度為104，103，102，101copies/μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以無核酶水為陰性對照，運用HAdV-14實時熒光RAA方法進行檢測，每個濃度重復(fù)5次，以評估實時熒光RAA測定法的靈敏度，并分析5次重復(fù)檢測結(jié)果的TT值批內(nèi)CV。

1.3.8 特異度及臨床樣本分析：使用建立的HAdV-14實時熒光RAA方法，對在中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇三醫(yī)院收集的50份咽拭子進行檢測，具體操作嚴格按照操作說明進行，并與實時熒光PCR檢測結(jié)果進行比較，評估HAdV-14實時熒光RAA測定法的特異度及其在臨床樣本中的檢測性能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPASS16.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件處理，其中TT值為計量資料，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 引物和探針的篩選 熔解曲線分析結(jié)果見圖1。4組引物的溶解曲線均呈單峰，熔鏈溫度在82℃左右，說明4組引物對的特異度良好。4組引物探針組合均出現(xiàn)了特異性熒光曲線，其中組合1（HAdV14-F1-4，HAdV14-R1，HAdV14-P）的TT最早，提示組合1為最佳引物探針組合，見圖2。

圖1 不同引物組合熔解曲線分析結(jié)果

圖2 不同引物探針組合實時熒光RAA擴增結(jié)果

2.2 不同溫度下擴增效果比較 不同反應(yīng)溫度時擴增曲線的TT值不同見圖3。在40℃條件下擴增時，特異性熒光曲線TT最早，且5次檢測結(jié)果重復(fù)性良好，表明40℃為HAdV-14實時熒光RAA檢測的最適反應(yīng)溫度。

圖3 不同溫度HAdV-14實時熒光RAA擴增結(jié)果

2.3 靈敏度評價 結(jié)果見圖4。以HAdV-14陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，當(dāng)濃度為104，103，102，101copies/μl時均有特異性擴增曲線，所以HAdV-14實時熒光RAA檢測方法的靈敏度為101copies/μl。另外，5次重復(fù)檢測結(jié)果的TT值批內(nèi)CV＜5%，結(jié)果見表2，表明該方法的重復(fù)性良好。

表2 不同模板濃度RAA檢測的重復(fù)性

2.4 特異度及臨床樣本分析 見圖5。HAdV-14陽性樣本的DNA為模板時出現(xiàn)特異性熒光信號，但是當(dāng)HAdV其他亞型（HAdV-3，HAdV-4，HAdV-7，HAdV-21，HAdV-55）與其它5種病原體核酸作為模板時，無特異性熒光信號，表明該檢測方法的特異度良好，可滿足臨床檢測需求。

圖5 HAdV-14實時熒光RAA測定法的臨床樣本分析

3 討論

人腺病毒（HAdV）是一種具有高傳染性的病原體，能導(dǎo)致嚴重的呼吸道疾病。近年來，HAdV-14在全球范圍內(nèi)重新出現(xiàn)，引起一系列嚴重的呼吸道疾病的暴發(fā)和流行。由于人群普遍易感，其感染率較其它亞型高，可引起更嚴重的急性呼吸道疾病。因此，迫切需要開發(fā)快速、靈敏且特異的HAdV-14檢測方法對這種病毒進行適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測，以預(yù)防HAdV-14感染的暴發(fā)和傳播。傳統(tǒng)的HAdV檢測方法主要采用病毒分離、培養(yǎng)、免疫分析等技術(shù)，但這些技術(shù)存在費時費力等缺點，難以實現(xiàn)HAdV感染的快速診斷。目前，常用的分子診斷技術(shù)包括PCR和實時熒光PCR等，它們具有較高的靈敏度和特異度，已被廣泛用于臨床上HAdV感染的診斷。但是因為變溫擴增過程需要熱循環(huán)儀和訓(xùn)練有素的操作人員，這些方法不適用于野外或資源有限地區(qū)進行HAdV的快速診斷。與常用分子診斷技術(shù)相比，等溫核酸擴增方法簡單、快速且具有成本效益。RAA是一種新的等溫擴增方法，周轉(zhuǎn)時間短、溫度低、靈敏度高、特異性強，特別適用于HAdV-14的快速診斷或現(xiàn)場評估。鑒于現(xiàn)存HAdV-14病毒檢測方法的不足以及HAdV-14病毒快速現(xiàn)場檢測的需求，研究一種可在常溫下快速檢測HAdV-14病毒且能應(yīng)用于基層醫(yī)療的RAA擴增方法非常有必要。

等溫擴增技術(shù)可以在相對較低的恒溫條件下進行擴增，使用便攜式實時熒光掃描儀或者膠體金試紙條對結(jié)果進行可視化檢測。與實時熒光定量PCR相比，該方法檢測時間大大縮短，所需設(shè)備簡單，是一種檢測HAdV-14簡便且快速的方法，適用于在資源有限地區(qū)進行HAdV-14的快速診斷。盡管本研究建立的實時熒光RAA檢測方法具有檢測時間短、操作簡便、對儀器要求低等諸多優(yōu)勢，但是該方法仍然具有一些局限性：①HAdV-14陽性樣本較少，應(yīng)該使用更多HAdV-14陽性的臨床樣本來評估該方法；②該方法沒有加入內(nèi)參作為對照，在實際應(yīng)用中應(yīng)加入內(nèi)參以消除樣品中潛在抑制劑的影響；③在撰寫本文時，還沒有專門的軟件可用于設(shè)計RAA引物探針，如果將來開發(fā)專門的軟件，可以進一步簡化RAA的引物探針設(shè)計；④RAA技術(shù)目前在臨床的應(yīng)用多為定性試驗，尚無絕對定量，即當(dāng)高模板含量（＞107拷貝）時，反應(yīng)達閾值的時間很早，一般在一兩分鐘就可迅速擴增，這時反應(yīng)曲線的閾值時間就很難準(zhǔn)確檢測，變異度大，所以閾值時間與模板起始拷貝數(shù)對數(shù)之間難以呈現(xiàn)線性[23]。

雖然 RAA 的優(yōu)勢在于等溫擴增，檢測過程無需大型核酸擴增儀，但是該方法仍需要核酸提取純化這一繁瑣的步驟，因此需要開發(fā)能夠以與RAA方法兼容的快速核酸提取技術(shù)或核酸免提取技術(shù)，使其更加適用于資源匱乏地區(qū)的即時診斷。本課題組已成功研發(fā)了一種適用于PCR，實時熒光PCR及等溫PCR的核酸免提取技術(shù)，該技術(shù)可能在常溫下5～10 min內(nèi)有效裂解呼吸道感染性疾病的病原體使其釋放核酸（DNA和RNA），不需提取步驟即可直接進行核酸擴增。另外，隨著2019新冠肺炎疫情的暴發(fā)，在戶外及床旁檢測SARS-CoV-2的需求日益增加，基于RAA技術(shù)的即時檢驗（pointof-care testing,POCT）應(yīng)運而生[24-26]。截止目前，尚無關(guān)于HAdV-14的RAA檢測試劑結(jié)合膠體金技術(shù)的報道。因此，課題組將在下一階段開展核酸免提取、RAA與膠體金技術(shù)相結(jié)合的研究，有望得到用于HAdV-14的POCT檢測試劑，并在軍隊、疾控等單位實施推廣。

綜上所述，我們開發(fā)了一種快速靈敏的實時熒光RAA檢測方法用于檢測HAdV-14。該方法在40℃條件下20min內(nèi)即可檢測出HAdV-14，靈敏度為101copies/μl，不與HAdV其他亞型及其他常見呼吸道病原體發(fā)生交叉反應(yīng)。與實時熒光PCR相比，RAA檢測更簡便，耗時更少，它為臨床快速診斷HAdV-14感染提供了新方法。