程 方,孫婷玉,葉建仁*

(1.南京林業(yè)大學林草學院,南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037; 2.廣東象頭山國家級自然保護區(qū)管理局,廣東 惠州 516001)

由松針座盤孢菌(Lecanostictaacicola)引發(fā)的松針褐斑病嚴重阻礙了濕地松的推廣[1]。自開展?jié)竦厮?Pinuselliotii)抗松針褐斑病無性系的組織培養(yǎng)研究工作以來[2-5],以濕地松成熟胚、離體胚無菌苗、無菌實生苗等為外植體,已成功建立其器官發(fā)生的組織培養(yǎng)再生體系,并且使試管苗移栽成活[6-7]。相對于器官發(fā)生而言,體細胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、速度快、結構完整、再生率高、變異小等優(yōu)點,是植物規(guī)?；?、產業(yè)化快速繁殖和基因轉化再生植株的重要手段,在良種繁育中有著廣泛的應用前景[8-9]。目前關于濕地松的體細胞胚胎發(fā)生研究已有報道[10-15],但是仍存在胚性愈傷組織誘導率低的問題。影響胚性愈傷組織誘導的主要因素有基因型、培養(yǎng)基種類、激素和培養(yǎng)條件等。不同因素對胚性愈傷組織誘導的效果隨不同因素組合及培養(yǎng)材料而不盡相同。為此,本研究以抗病濕地松未成熟合子胚為外植體,探索適宜抗病濕地松體胚誘導的培養(yǎng)條件,進一步提高抗病濕地松優(yōu)良基因型的胚性愈傷組織誘導率,為濕地松的體胚發(fā)生提供更多的精英細胞系,促進抗病濕地松家系組培苗的推廣應用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從葉建仁等[4-5]在福建沙縣官莊林場建立的抗松針褐斑病濕地松種子園采集9號、8號、34號、2號、23號、39號、11號、25號、10號抗病家系的未成熟合子胚為外植體材料,6—8月采取定點定株分批采集濕地松未成熟球果,確定6月15日、6月22日、6月28日、7月4日、7月13日、7月28日、8月3日等7個球果采收期,每次每株采集6個球果。

1.2 外植體發(fā)育階段檢測

隨機抽取各濕地松家系球果7個采集時間的合子胚在體視顯微鏡((Leica MZ16, Wetzlar, Germany)下觀察合子胚的發(fā)育階段,參照Pullman等[16]的松屬合子胚發(fā)育階段劃分標準判斷不同家系、采集期合子胚的發(fā)育階段。

1.3 球果采集、家系和冷藏處理

球果采集以9號家系2019年7個采收期的雌配子體為試驗材料(其中7月13日采集的球果采用冷藏運輸?shù)姆绞?其余采收期的球果采用郵寄方式),誘導培養(yǎng)基為lobbly pine medium(LP)基本培養(yǎng)基[17],添加2.2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、1.0 mg/L 6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、15 g/L麥芽糖、200 mg/L肌醇、250 mg/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、500 mg/L 酸水解酪蛋白(CH)、450 mg/L 谷氨酰胺、5.2 g/L瓊脂,每個處理50個雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察并統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導率。

球果家系以7月13日采集的濕地松9號、8號、34號、2號、23號、39號、11號、25號家系為試驗材料,將其雌配子體培養(yǎng)在誘導培養(yǎng)基中,每個處理35個雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察統(tǒng)計胚性愈傷誘導率。

冷藏時間以7月13日采集的8號家系為材料,培養(yǎng)在誘導培養(yǎng)基中,設置球果冷藏時間為0、5、15、30、60 d,每個處理32個雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察并統(tǒng)計胚性愈傷誘導率。

1.4 誘導培養(yǎng)基中添加物的處理

糖種類處理以7月4日采集的11號家系為試驗材料,誘導培養(yǎng)基為LP添加2.2 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA、200 mg/L肌醇、250 mg/L MES 、500 mg/L CH、450 mg/L谷氨酰胺、5.2 g/L瓊脂,添加的各種糖質量濃度分別為麥芽糖15、30 g/L,蔗糖15、30 g/L,葡萄糖15、30 g/L,每個處理35個雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察統(tǒng)計胚性愈傷誘導率。

肌醇處理以6月15日采集的10號家系為試驗材料,誘導培養(yǎng)基為LP添加2.2 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA、15 g/L麥芽糖、250 mg/L MES、500 mg/L CH、450 mg/L谷氨酰胺、5.2 g/L瓊脂,添加的肌醇質量濃度分別為0、100、300、500、1 000 和 2 000 mg/L,每個處理35個雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察統(tǒng)計胚性愈傷誘導率。

抗壞血酸處理以6月28日采集的11號家系為試驗材料,誘導培養(yǎng)基為LP添加2.2 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA、15 g/L麥芽糖、200 mg/L肌醇、500 mg/L CH、250 mg/L MES、450 mg/L谷氨酰胺、5.2 g/L瓊脂,添加的抗壞血酸質量濃度分別為0、1、2、3 mg/L,每個處理35個雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察統(tǒng)計胚性愈傷誘導率。

a-c.發(fā)育早期 early stage; d-f. 發(fā)育中期 metaphase; g-i. 發(fā)育后期 late stages。圖1 濕地松合子胚發(fā)育的9個階段Fig. 1 The nine development process of zygotic embryo of Pinus elliottii

α-酮戊二酸和丙酮酸處理。以7月4日采集的34號家系為試驗材料,誘導培養(yǎng)基為LP添加2.2 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA、15 g/L麥芽糖、200 mg/L肌醇、250 mg/L MES、500 mg/L CH、450 mg/L 谷氨酰胺、5.2 g/L瓊脂,添加的α-酮戊二酸和丙酮酸質量濃度組合分別為0 mg/Lα-酮戊二酸和0 mg/L 丙酮酸(CK),0 mg/Lα-酮戊二酸和60.7 mg/L 丙酮酸,100 mg/Lα-酮戊二酸和0 mg/L丙酮酸,100 mg/Lα-酮戊二酸和60.7 mg/L丙酮酸,每個處理40個雌配子體,培養(yǎng)21～35 d觀察統(tǒng)計胚性愈傷誘導率。

1.5 激素組合

以7月13日采集的9號、8號、34號、2號、23號家系為試驗材料,誘導培養(yǎng)基為LP添加15 g/L麥芽糖、200 mg/L肌醇、250 mg/L MES、500 mg/L CH、450 mg/L谷氨酰胺、5.2 g/L瓊脂,激素質量濃度分別為2,4-D(2、4、6、8、10 mg/L)、6-BA(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/ L)和激動素(KT)(0、0.5、1.5、2.5、4.0 mg/ L)3因素5水平全面試驗的125個組合,實驗編號為Ⅰ-13～Ⅰ-137。每個處理35個雌配子體(每個家系7個雌配子體),培養(yǎng)21～35 d觀察并統(tǒng)計胚性愈傷誘導率。

1.6 培養(yǎng)條件及數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有培養(yǎng)基在滅菌前pH調至5. 8,高溫高壓蒸汽滅菌(121 ℃,20 min)。所有材料均在(23±1) ℃,暗培養(yǎng)條件誘導胚性愈傷組織。實驗結果數(shù)據(jù)采用Excel 2020整理、分析。

2 結果與分析

2.1 濕地松未成熟合子胚的發(fā)育階段

本研究發(fā)現(xiàn)在福建沙縣官莊林場采集的濕地松球果的發(fā)育階段大致可分為9個階段(圖1),其中:a—c為合子胚發(fā)育早期階段;d—f為合子胚發(fā)育中期階段;g—i為合子胚發(fā)育后期階段。研究中,6月15日和6月22日兩個時間未檢測出合子胚形態(tài);6月28日和7月4日合子胚在發(fā)育早期階段;7月13日合子胚由發(fā)育早期向發(fā)育中期階段(b—d階段);7月28日合子胚由發(fā)育中期向發(fā)育后期階段(e—h階段);8月3日合子胚已完全發(fā)育至后期階段(g—i階段)。

2.2 濕地松誘導的愈傷組織形態(tài)分類

根據(jù)本實驗愈傷組織表面形態(tài)和細胞結構將雌配子體誘導的愈傷組織劃分為6種類型(圖2)。其中,細胞形態(tài)為胚性胚柄細胞團結構的愈傷組織在后期產生體胚的概率較高,稱之為胚性愈傷組織(圖2a—2b);反之,稱之為非胚性愈傷組織(圖2c—2i),但圖2g、2h、2i無法進行增殖培養(yǎng)。因此,本研究統(tǒng)計的出愈率指愈傷組織類型即圖2a、2b、2d、2e所占百分比之和。

a.白色、透明、黏性強,細胞形態(tài)呈胚性胚柄團狀white, hyaline, sticky cells with embryonic germinal stalk clusters;b.絲狀、白色、透明、黏性強,細胞顯微形態(tài)呈胚性胚柄團狀的早期原胚,即胚頭聚攏,胚柄細胞呈長形細胞狀filamentous, white, hyaline, strongly adhesive cells and the clusters performed embryonal suspensor mass in cell microscopic form: embryonal heads clustered, the suspensor cells in the form of elongated cells;c.a—b早期原胚顯微觀察microscopic observation-early proembryos of a-b.;d.白色、透明、黏性較強,細胞顯微形態(tài)呈腎形或圓形white, transparent, sticky, with a reniform or rounded cell microscopic form;e.珠孔處1簇愈傷,質地松、軟,黏性較強,細胞形態(tài)呈腎形細胞female gametophyte with a cluster of callus at the bead hole ejection, soft, more viscous, with a kidney-shaped cell microscopic morphology;f.d—e腎形細胞顯微觀察microscopic observation-renal cells of d-e.;g.米黃色、黏性,附著在雌配子體表面的極少數(shù)愈傷組織female gametophyte cells are beige in colour and surrounded by a sticky substance;h—i.褐化,疙瘩狀,無愈傷組織產生female gametophyte browned, lumpy, no healing tissue produced。 圖2 濕地松雌配子體誘導的愈傷組織類型Fig. 2 The types of induced callus in P. elliottii

2.3 球果采集時間、家系和冷藏處理時間對濕地松胚性愈傷誘導的影響

研究發(fā)現(xiàn),在7個采收期中,6月28日、7月4日和7月13日球果的出愈率較高(表1),對比發(fā)育階段發(fā)現(xiàn),此時合子胚處在發(fā)育早期階段或由發(fā)育早期向發(fā)育中期過渡階段(圖1),此時間段之前或之后的出愈率較低,此時間段之前未檢測出合子胚形態(tài),此時間段之后合子胚發(fā)育至中、后期階段。因此,筆者認為濕地松合子胚在發(fā)育早期階段對愈傷組織的誘導是有利的,在福建官莊林場采集未成熟濕地松球果進行體胚誘導時間為6月底至7月中上旬最佳。本研究中8個家系的出愈率均較高,其中,23號家系的出愈率最優(yōu)(85.8%),其次是25號(82.4%)、34號(81.2%)、9號(80.6%)、11號(80.5%)。雖然這幾個家系均未獲得胚性胚柄細胞團結構的愈傷組織,但這些家系對誘導培養(yǎng)基的響應均較高,在合適的誘導條件下產生胚性愈傷組織的可能性會更高。濕地松球果冷藏5 d,其出愈率最高(80.6%),球果冷藏時間在15天內濕地松出愈率都較高,冷藏60 d的出愈率也能達到68.7%,但Ⅲ型、Ⅳ型愈傷組織能否轉化成胚性胚柄細胞團以及其轉化率多高還有待進一步觀察(表1)。

表1 采集時間、家系和冷藏時間對濕地松愈傷組織誘導率的影響

2.4 不同添加物對濕地松胚性愈傷誘導的影響

在添加的所有種類糖誘導培養(yǎng)基中,30 g/L麥芽糖的出愈率最高(78.6%),其次是添加15 g/L麥芽糖,并且出愈率大小依次為麥芽糖>蔗糖>葡萄糖,可見麥芽糖對濕地松胚性愈傷組織的誘導是有利的,而添加葡萄糖的誘導培養(yǎng)基出愈率最差(表2)。

表2 添加物對濕地松愈傷組織誘導率的影響

表2(續(xù))

出愈率最高的是500 mg/L肌醇的處理,質量濃度1 000 mg/L肌醇是唯一誘導出胚性胚柄結構愈傷組織的處理,當肌醇質量濃度高于1 000 mg/L時,出愈率降低(表2)。說明1 000 mg/L肌醇對濕地松未成熟合子胚胚性愈傷組織的誘導最合適,過高則會抑制其愈傷的誘導。在抗壞血酸質量濃度為0、1、2、3 mg/L時,對濕地松胚性愈傷組織誘導的影響區(qū)別不大(表2)。本研究中,α-酮戊二酸和丙酮酸單獨添加對愈傷誘導的促進作用較小,而當兩者同時添加時明顯促進了濕地松愈傷組織的誘導。α-酮戊二酸和丙酮酸同時添加時,濕地松雌配子體的出愈率為85.8%,單獨添加α-酮戊二酸或丙酮酸時出愈率分別為75.9%、76.3%,均高于對照處理(表2)。

2.5 不同激素組合對濕地松胚性愈傷誘導的影響

以不同濃度2,4-D、6-BA、KT的125個組合中,結果顯示有14個對濕地松愈傷組織誘導產生反應的培養(yǎng)基(表3),其中,Ⅰ-128出愈率最高,達到90.4%,且有早期原胚Ⅰ型愈傷1.8%;另一個產生早期原胚的Ⅱ型愈傷的誘導培養(yǎng)基為Ⅰ-26,其出愈率為78.9%,雖然比其余組合的出愈率低,但是其獲得早期原胚型愈傷組織的誘導率最高(2.9%)。另外,111個對濕地松愈傷組織誘導未產生反應的組合不列入表格分析。因此,筆者認為濕地松早期原胚愈傷誘導的較優(yōu)組合為LP+2 mg/L 2,4-D+2 mg/L 6-BA+2.5 mg/L KT。

表3 激素配比對濕地松愈傷組織誘導的影響

3 討 論

從體細胞轉變?yōu)榕咝杂鷤M織是一個復雜的過程,受多種因素的影響。本研究對誘導濕地松愈傷組織的影響因素進行了較為全面的探索,涉及影響因素比已有研究更為多樣,以抗病濕地松未成熟合子胚為外植體,從外植體采集、保存、基因型、培養(yǎng)基及添加物等胚性愈傷組織誘導的主要影響因素進行全過程的研究,取得了一定的成果,確定了在福建官莊林場采集未成熟濕地松球果進行體胚誘導最佳時間為6月底至7月中上旬即濕地松合子胚發(fā)育至2—4階段時,最利于胚性愈傷組織的誘導。這與胡繼文等[14]、張彩云等[15]對濕地松胚性愈傷組織的誘導以及吳靜等[18]對抗松材線蟲病赤松胚性愈傷組織的誘導研究結果一致。針葉樹體胚發(fā)生能力與基因型有很大關系[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)較易獲得愈傷組織的5個基因型為23號、25號、34號、9號和11號家系,孫婷玉等[21]在黑松的研究中也發(fā)現(xiàn)將基因型是胚性愈傷組織誘導的關鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)將濕地松球果冷藏5 d時其出愈率最高。唐巍等[12]將濕地松球果在4 ℃冰箱中放置1個月后進行誘導,胚性愈傷誘導率達25.12%;吳麗君[7]發(fā)現(xiàn)濕地松球果冷藏5～10 d胚性愈傷組織誘導率最高,冷藏時間延長至20 d以上,愈傷組織誘導率呈下降趨勢。誘導的胚性愈傷組織材料必須預先低溫(4～8 ℃)儲藏,沒有低溫處理不能啟動[22-23],與本研究結果一致。短時間冷藏對提高體胚誘導率有一定的促進作用,這可能由于冷藏運輸?shù)牡蜏貤l件抑制了合子胚的繼續(xù)發(fā)育,也可能由于郵寄的球果在途中受到的刺激,導致活性不如冷藏運輸?shù)母?。本研究發(fā)現(xiàn)添加30 g/L的麥芽糖對濕地松胚性愈傷組織的誘導是有利的。吳麗君[7]在濕地松胚性愈傷誘導時添加15 g/L的麥芽糖,Pullman等[16]誘導火炬松胚性愈傷組織也添加了15 g/L的麥芽糖,而在馬尾松和云南松的胚性愈傷組織的誘導實驗中均添加30 g/L蔗糖[24-25],這說明不同的松樹對糖類的需求存在差異。α-酮戊二酸和丙酮酸同時添加明顯促進了濕地松愈傷組織的誘導。肌醇以1 000 mg/L最合適,過高則會抑制濕地松愈傷組織的誘導?？箟难豳|量濃度為0、1、2、3 mg/L時,對濕地松胚性愈傷組織誘導的影響區(qū)別不大。

本研究對影響濕地松胚性愈傷組織誘導的因素進行了全面的研究,篩選出1種較優(yōu)的濕地松胚性愈傷組織誘導的培養(yǎng)基,即LP+2 mg/L 2,4-D+2 mg/L 6-BA+2.5 mg/L KT,確定了適合濕地松胚性愈傷組織誘導的主要條件,可為提高濕地松胚性愈傷組織誘導率,促進濕地松體胚發(fā)生的研究提供依據(jù)。