王 鵬,劉宇瑤,陳 林,陳鴻平,王 福,胡 媛,劉友平

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611137

石斛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1],藥用歷史悠久。金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)始載于《本草衍義》[2],現(xiàn)今使用的金釵石斛為《本草綱目》[3]所載“石斛叢生石上。其根糾結(jié)甚繁,干則白軟。其莖葉生皆青色,干則黃色,開紅花……石斛短而中實(shí),木斛長(zhǎng)而中虛,甚易分別。處處有之,以蜀中者為勝”。為《中國(guó)藥典》2020年版石斛來源之一,以新鮮或干燥莖入藥,具益胃生津,滋陰清熱之功效?！缎滦薇静荨穂4]載:“(石斛)生石上者為勝”?！侗静輬D經(jīng)》[5]載“亦有生櫟木上者,名木斛,不堪用”?？梢姎v代本草所載石斛的附生基質(zhì)主要有石質(zhì)基質(zhì)和木質(zhì)基質(zhì)兩種,且以莖粗壯、節(jié)短、石上生者為質(zhì)優(yōu)。

金釵石斛主要含生物堿類、多糖類、酚類、黃酮類等化合物[6-8],具有抗氧化、抗腫瘤、抗白內(nèi)障等藥理作用[6,9,10]。金釵石斛在自然條件下繁殖能力低,生長(zhǎng)緩慢及野生石斛的過度開發(fā)破壞,其自然資源幾乎枯竭。近年來隨著人工栽培技術(shù)推廣,大棚栽培(附生基質(zhì)為段木、粗沙石、粗木屑等)和林下仿野生栽培(附生基質(zhì)為林下石塊、樹木)[11]已成為石斛藥材主要栽培模式,對(duì)不同附生基質(zhì)金釵石斛研究表明附石品質(zhì)優(yōu)于附樹[12,13]。本課題組報(bào)道了兩種附生基質(zhì)金釵石斛代謝產(chǎn)物及抗氧化活性差異[14],附石栽培金釵石斛代謝產(chǎn)物數(shù)量和相對(duì)含量顯著高于附木栽培;附石栽培金釵石斛抗氧化能力高于附木栽培。但由于附生基質(zhì)與藥材品質(zhì)相關(guān)性研究不深入,且木質(zhì)基質(zhì)金釵石斛花、莖等外觀性狀較好,觀賞性強(qiáng), 致使大量“木斛”流通于市場(chǎng),影響臨床療效發(fā)揮。

微生物與中藥栽培、品質(zhì)等密切相關(guān)[15]。根際微生物是定殖于植物根部周圍的微生物群落,是植物與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的重要媒介[16],根際微生物的多樣性與植物生長(zhǎng)環(huán)境存在一定相關(guān)性。如北京無喙蘭所在種群的喬木多樣性與其根際微生物多樣性存在一定的相關(guān)性[17]。對(duì)毛唇芋蘭根際和根內(nèi)真菌的研究發(fā)現(xiàn),不同部位及不同區(qū)域之間真菌組成、結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度存在差異,與生長(zhǎng)環(huán)境如濕度、營(yíng)養(yǎng)條件等密切相關(guān)[18]。已有研究表明,蘭科根系微生物(根際微生物和菌根真菌)與蘭科植物生長(zhǎng)密切相關(guān)(如種子萌發(fā),成分積累、抗病和抗逆性等)[19,20]。對(duì)霍山石斛、鐵皮石斛、金釵石斛等中藥石斛品種的菌根真菌研究發(fā)現(xiàn)[21-23],其根中廣泛分布子囊菌門,擔(dān)子菌門真菌等;不同石斛屬植物菌根真菌的組成與宿主栽培環(huán)境存在一定的相關(guān)性[24]。對(duì)鐵皮石斛、金釵石斛等石斛屬藥用植物的內(nèi)生細(xì)菌研究表明[20,25],內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量和種類因生境而異,與菌根真菌的定植程度等密切相關(guān)。但尚未見到不同附生基質(zhì)金釵石斛根際微生物多樣性和差異性比較研究的報(bào)道,亦未見金釵石斛根際微生物與其菌根真菌相關(guān)性的研究報(bào)道。

本文運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)2類(石質(zhì)和木質(zhì))5種附生基質(zhì)金釵石斛的根際微生物多樣性和差異性進(jìn)行了比較研究,以明確不同附生基質(zhì)金釵石斛根際微生物的分布特點(diǎn),為金釵石斛為基質(zhì)-根際微生物-菌根真菌的相關(guān)性及其生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝產(chǎn)物積累規(guī)律研究奠定基礎(chǔ),為石斛“生石上者勝”、金釵石斛附生基質(zhì)的合理選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)以2年生金釵石斛的根際微生物為研究對(duì)象(選擇不同附生基質(zhì)上生長(zhǎng)正常且無病害的植株(見圖1),挖取根系,置于無菌管中,液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-20 ℃冰箱保存)。所有樣品均采集于貴州省遵義市赤水市天臺(tái)鎮(zhèn)赤水信天斛滿堂有限公司實(shí)驗(yàn)大棚,采集時(shí)間為2021年4月15日。方法為Z字形采樣,樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系嚴(yán)鑄云教授鑒定為金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.),樣品基本信息見表1。

表1 樣品信息表

圖1 不同栽培基質(zhì)金釵石斛Fig.1 D.nobile cultivated in different substrates 注:左:丹霞石塊栽培;右:段木栽培。Note:Left:Danxia stone cultivation;Right:Segment wood cultivation

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

Bio-rad T100梯度PCR儀(美國(guó)BIO-Rad公司);NovaSeq 6000(美國(guó)Illumina 公司);CTAB,Nobleryder(北京諾博萊德科技有限公司);Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(M0531S,New England Biolabs,美國(guó));產(chǎn)物純化試劑盒Universal DNA(天根生化科技有限公司);建庫(kù)試劑盒NEB Next?Ultra DNA Library Prep Kit(北京NEB公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

使用無菌棉簽擦拭樣品表面,剪下棉簽部分,采用CTAB法提取樣品總DNA,脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取出的DNA純度和濃度(無準(zhǔn)確數(shù)值),隨后取適量DNA于離心管中,用無菌水稀釋至1 ng/μL,用于PCR擴(kuò)增并對(duì)產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣和純化。使用文庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建文庫(kù)進(jìn)行安捷倫5400檢測(cè)和Q-PCR定量,文庫(kù)合格后,使用NovaSeq 6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)Illumina NovaSeq測(cè)序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)(Raw PE)進(jìn)行拼接和質(zhì)控,得到Clean Tags,再進(jìn)行嵌合體過濾,得到用于分析的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。對(duì)所有樣本的Effective Tags,以97%的一致性(identity)進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類,然后對(duì)OTUs進(jìn)行物種注釋;并對(duì)OTUs進(jìn)行物種相對(duì)豐富、Alpha Diversity以及主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU分析結(jié)果

為研究各樣本的物種組成,對(duì)Illumina NovaSeq測(cè)序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)(Raw PE)進(jìn)行拼接和質(zhì)控,得到Clean Tags,再進(jìn)行嵌合體過濾,得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。對(duì)所有樣本的Effective Tags,以97%的一致性(identity)進(jìn)行OTU(operational taxonomic units)聚類,然后對(duì)OTUs的序列進(jìn)行物種注釋。不同附生基質(zhì)金釵石斛根系微生物“屬”水平物種分布見圖2、圖3。

圖2 細(xì)菌屬水平物種分布圖Fig.2 Distribution map of horizontal genus of bacteria

圖3 真菌屬水平物種分布圖Fig.3 Distribution map of horizontal genus of bacteria fungi注:一種顏色代表一個(gè)物種,色塊長(zhǎng)度表示物種所占相對(duì)豐度比例;為使視圖效果最佳,只顯示豐度水平前10的物種,其他物種合并為Others在圖中顯示,Unclassified前綴表示未分類注釋的物種。Note:A color represents a species,and the color block length represents the relative abundance ratio of the species;For the best view effect,only the species with the top 10 abundance levels are displayed,while other species are combined as Others and shown in the figure.The Unclassified prefix indicates species that are not classified and annotated.

由圖2可知,在屬水平,不同附生基質(zhì)金釵石斛細(xì)菌種類相同,總體豐度前十的細(xì)菌屬有鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、埃希菌屬(Escherichia)、根瘤菌屬(Rhizobium)、蔓生根瘤菌屬(Bradyrhizobium),變形菌屬(Proteobacteria)、顆粒菌屬(Granulicella)、毛螺菌屬(Lachnospira)、Acidipila菌屬以及unidentified_Chloroplast菌屬。其中,糞大腸桿菌在JMK中豐度最低,僅占0.56%,在DMZP中豐富最高,達(dá)到6.2%。CSS中前十細(xì)菌屬的相對(duì)豐度占比最低,DMZP與DXSK中前十細(xì)菌屬的相對(duì)豐度占比相近(DMZP:28.7%;DXSK:28.8%)。除JMK組外,其余各組均有1至3個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì)菌屬;與其余4組相比,CSS優(yōu)勢(shì)菌屬并未顯示出突出的優(yōu)勢(shì)。此外,各組內(nèi)前十細(xì)菌屬的相對(duì)豐度占比亦存在差異,可能為樣本采集誤差。

由圖3可知,在屬水平,不同附生基質(zhì)金釵石斛的真菌種類存在差異,總體相對(duì)豐度前十的真菌屬為粉褶菌屬(Entoloma)、枝孢屬(Cladosporium)、枝頂孢屬(Acremonium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、子囊菌屬(Ascomycetes),以及unidentified_Cantharellales_sp菌屬、unidentified_Sebacinales_sp菌屬、Sistotrema菌屬、Stereocaulon菌屬、Zasmidium菌屬。其中,unidentified_Cantharellales_sp菌屬(擔(dān)子菌門)在五種不同栽培基質(zhì)上相對(duì)豐度占比均是最高的,為最顯著的優(yōu)勢(shì)菌屬。除DXSK、CSS組外,其余三組均有除unidentified_Cantharellales_sp菌屬的1至2個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬;DXSK、CSS組除unidentified_Cantharellales_sp菌屬外各菌屬相對(duì)豐度占比較平衡。SPK組中粉褶菌屬相對(duì)豐度占比達(dá)15.9%,其余四組相對(duì)豐度占比極低。DXSK組中,unidentified_Cantharellales_sp菌屬(擔(dān)子菌門)相對(duì)豐度占比達(dá)64.4%,較其余菌屬為極顯著的優(yōu)勢(shì)菌屬(總相對(duì)豐度占比為2.7%)。各組內(nèi)前十真菌屬的相對(duì)豐度占比亦存在差異,考慮個(gè)體差異所致。

2.2 Alpha多樣性分析結(jié)果

五組樣品的Alpha多樣性(Alpha diversity)指數(shù)如表2所示。Alpha多樣性分析可以反映樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性。由表2和表3可知,五組樣品的真菌與細(xì)菌的OUT覆蓋率均在0.992以上,表明本次測(cè)序結(jié)果能較準(zhǔn)確地反映樣本中微生物的真實(shí)情況。以Chao1指數(shù)評(píng)估物種豐富度,各組物種豐富度大小順序?yàn)?DXSK>SPK>DMZP>CSS>JMX(細(xì)菌);SPK >JMX>CSS>DMZP>DXSK(真菌)。以ACE指數(shù)評(píng)價(jià)物種豐富度,各組物種豐富度大小順序?yàn)?DXSK>SPK>DMZP>CSS>JMX(細(xì)菌);JMX>SPK>DMZP>CSS>DXSK(真菌)。綜合上述兩個(gè)指標(biāo),細(xì)菌物種類型豐富度在DXSK、SPK、DMZP基質(zhì)中較高;真菌物種類型豐富度在JMX和SPK基質(zhì)中較高;DXSK基質(zhì)中細(xì)菌物種豐富度最高而真菌物種豐富度最低。

表2 細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)表

表3 真菌Alpha多樣性指數(shù)表

以Simpson指數(shù)為指標(biāo)評(píng)價(jià)物種多樣性,各組的多樣性大小順序?yàn)?CSS>SPK>DXSK>DMZP= JMX(細(xì)菌);DMZP>SPK>CSS>JMX>DXSK(真菌)。以Shannon指數(shù)為指標(biāo),各組的多樣性大小順序?yàn)?SPK>CSS>DXSK>DMZP>JMX(細(xì)菌);DMZP>SPK>JMX>CSS>DXSK(真菌)。綜合Simpson和Shannon兩個(gè)指標(biāo),SPK、CSS細(xì)菌多樣性較大;DMZP、SPK真菌多樣性較大。DXSK基質(zhì)真菌物種多樣性較差,即物種均一性較差,說明DXSK基質(zhì)上優(yōu)勢(shì)菌群更為突出。不同基質(zhì)細(xì)菌物種多樣性較好,物種均一性較好,說明不同附生基質(zhì)金釵石斛根系細(xì)菌趨向一種相互制約平衡的狀態(tài), 這與真菌形成顯著優(yōu)勢(shì)菌群的情況存在差異。

2.3 主成分分析結(jié)果

應(yīng)用主成分分析(principal component analysis,PCA)方法基于不同樣品OTU水平的PCA分析結(jié)果見圖4。由細(xì)菌的主成分分析圖(見圖4A)可知,兩大主成分之和大于30%,PC1和PC2分別解釋不同細(xì)菌群落16.35%和14.25%的信息,占比相似?；趦纱笾鞒煞值慕Y(jié)果,不同附生基質(zhì)金釵石斛樣品可分為四類:DMZP為一類,SPK為一類,CSS和DXSK為一類,JMX為一類。

圖4 細(xì)菌和真菌的主成分分析圖Fig.4 The PCA plot of bacteria and fungi 注:每種顏色代表一組樣品,點(diǎn)代表各個(gè)樣品。橫、縱坐標(biāo)分別表示第一主成分、第二主成分,百分比表示對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值;左:細(xì)菌;右:真菌。Note:Each color represents a set of samples,and dots represent each sample.The horizontal and vertical coordinates represent the first principal component and the second principal component,respectively,and the percentage represents the contribution value to the sample difference;Left:Bacteria;Right:Fungi.

由真菌的主成分分析圖(見圖4B)可知,兩大主成分之和大于33%,PC1和PC2分別解釋不同真菌20.21%和13.25%的信息。根據(jù)分析結(jié)果,可將不同樣品分為3組:CSS為一組,JMX為一組,DXSK、SPK、DMZP為一組。

2.4 細(xì)菌群落分布特征

通過16S rRNA高通量測(cè)序得到序列數(shù)據(jù), 運(yùn)用OUT分析、Alpha多樣性分析與主成分分析可知細(xì)菌在不同附生基質(zhì)中的分布規(guī)律?；贠UTs分析結(jié)果,共得到56個(gè)門,112個(gè)綱,275個(gè)目,377個(gè)科,621個(gè)屬。在門水平,主要為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、放線菌門(Actinobacteriota),占金釵石斛根系細(xì)菌50%以上。在屬水平,細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬為鞘氨醇單胞菌屬、糞桿菌屬,分別為DXSK、DMZP與SPK、DXSK、DMZP的優(yōu)勢(shì)菌屬;以及各組相對(duì)占比較高的unidentified_Chloroplast菌屬。由于優(yōu)勢(shì)菌屬的制約,導(dǎo)致DXSK、DMZP、SPK中雖物種豐富度較高,但均一性相對(duì)較差。

2.5 真菌群落分布特征

通過ITS高通量測(cè)序得到序列數(shù)據(jù), 結(jié)合OUT分析、Alpha多樣性分析與主成分分析結(jié)果,共得到13個(gè)門,47個(gè)綱,123個(gè)目,273個(gè)科,503個(gè)屬。在門水平,主要為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota),相對(duì)豐度占比70%以上。在屬水平,各組unidentified_Cantharellales_sp菌屬相對(duì)占比較高;粉褶菌屬、枝孢菌屬分別為SPK、CSS中的優(yōu)勢(shì)菌屬。unidentified_Cantharellales_sp菌屬為DXSK中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬,這可能與DXSK為石質(zhì)基質(zhì),真菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)含量少,生存條件惡劣導(dǎo)致抗逆性強(qiáng)的真菌相對(duì)豐度逐漸增加,成為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌屬。優(yōu)勢(shì)菌屬的制約,導(dǎo)致真菌物種均一性較差,與細(xì)菌物種趨向一種相互制約平衡的狀態(tài)存在差異。

2.6 細(xì)菌及真菌功能預(yù)測(cè)分析

使用FAPROTAX和FunGuild軟件分別推測(cè)細(xì)菌和真菌的功能。并對(duì)5組不同附生基質(zhì)金釵石斛樣本中豐度排名前25的子功能注釋構(gòu)建聚類熱圖,結(jié)果見圖5。5組樣本功能注釋結(jié)果類似,但相對(duì)豐度存在差異。細(xì)菌方面主要為化學(xué)異養(yǎng)型、參與硝酸鹽呼吸、亞硝酸鹽呼吸等;真菌方面主要為動(dòng)植物病原體、腐生生物和寄生或共生真菌等。在細(xì)菌方面木質(zhì)基質(zhì)(SPK、JMX、DMZP)中,化學(xué)異養(yǎng)型及參與硝酸鹽呼吸、亞硝酸鹽呼吸的相對(duì)豐度較高;而在石質(zhì)基質(zhì)(CSS、DXSK)中光能自養(yǎng)型的相對(duì)豐度較高。在真菌方面,木質(zhì)基質(zhì)中腐生生物、動(dòng)植物病原體的相對(duì)豐度較高,而石質(zhì)基質(zhì)中的寄生或共生真菌相對(duì)豐度較高。

圖5 細(xì)菌(A)和真菌(B)的功能預(yù)測(cè)分析圖Fig.5 Functional prediction analysis diagram of bacteria (A) and fungi (B)

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn),不同附生基質(zhì)根際微生物群落組成不同,說明附生基質(zhì)是影響金釵石斛根際微生物物種多樣性和相對(duì)豐度的因素。在門水平,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門;優(yōu)勢(shì)真菌主要為擔(dān)子菌門和子囊菌門,這與李和劉等[21,22]菌根真菌的研究結(jié)果一致,說明擔(dān)子菌門和子囊菌門與石斛屬植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。在屬水平,石質(zhì)基質(zhì)真菌優(yōu)勢(shì)菌屬為unidentified_Cantharellales_sp菌屬,細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬為鞘氨醇單胞菌屬、糞桿菌屬、unidentified_Chloroplast菌屬;木質(zhì)基質(zhì)真菌優(yōu)勢(shì)菌屬為unidentified_Cantha-rellales_sp菌屬、粉褶菌屬,細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬為糞桿菌屬。

本研究首次報(bào)道金釵石斛根際真菌在石質(zhì)基質(zhì)(CSS、DXSK)上優(yōu)勢(shì)菌屬更為明顯,這可能與環(huán)境脅迫有關(guān)。附生基質(zhì)是附生植物根系吸收營(yíng)養(yǎng)和水分的重要介質(zhì),其生長(zhǎng)發(fā)育受附生基質(zhì)理化性質(zhì)如營(yíng)養(yǎng)條件、水分、pH等影響[26];石質(zhì)基質(zhì)較木質(zhì)基質(zhì)在營(yíng)養(yǎng)條件、水分等更為惡劣,導(dǎo)致石質(zhì)基質(zhì)上抗逆性強(qiáng)或能光能自養(yǎng)或能與寄主共生的菌屬相對(duì)豐度逐漸增加,形成優(yōu)勢(shì)菌屬。植物生長(zhǎng)環(huán)境與微生物組成相關(guān),如在干旱環(huán)境下的沙漠玫瑰、醉蝶花、蘆薈等3種植物的根際微生物組成表現(xiàn)出高度的一致性[27],與本文研究結(jié)果相似;對(duì)水稻的根際、根表面和根內(nèi)部的微生物組研究發(fā)現(xiàn)在根際未定殖的微生物在根內(nèi)部也未定殖[28];表明根際微生物組成會(huì)影響植物內(nèi)生菌的種類和豐度。不同附生基質(zhì)根際真菌差異可能會(huì)影響其菌根真菌的形成,進(jìn)而影響金釵石斛生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝產(chǎn)物的積累,導(dǎo)致金釵石斛品質(zhì)差異,但三者之間的關(guān)聯(lián)性有待進(jìn)一步研究。功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明,不同附生基質(zhì)細(xì)菌和真菌功能基因相對(duì)豐度存在差異,木質(zhì)基質(zhì)上富集了更多對(duì)植物有害的致病及寄生功能基因,石質(zhì)基質(zhì)則富集了更多光能自養(yǎng)和共生功能基因。表明附生基質(zhì)是影響金釵石斛根際微生物群落功能的關(guān)鍵因素。研究結(jié)果表明,附生基質(zhì)對(duì)根際真菌的影響更為明顯。

本研究基于高通量測(cè)序技術(shù),比較了不同附生基質(zhì)的金釵石斛根際微生物的組成、分布等特點(diǎn),從菌根真菌以外的一個(gè)方面來研究不同附生基質(zhì)金釵石斛品質(zhì)存在差異的原因,證明了根際真菌在不同附生基質(zhì)上相對(duì)豐度存在差異,填補(bǔ)了金釵石斛根際微生物研究的空白,為本草所載石斛“生石上者勝”、進(jìn)一步研究根際真菌與菌根真菌的關(guān)聯(lián)性奠定基礎(chǔ),為金釵石斛品質(zhì)差異形成機(jī)制研究以及實(shí)際生產(chǎn)中附生基質(zhì)的合理選擇提供依據(jù)。