陳瑞鑫,康點點,詹琥珀,蔣桂華,3*,蔣運斌*

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點實驗室,成都 611137;2西南大學(xué)藥學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院,重慶 400000;3成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院,成都 611137

中藥獨一味(Lamiophlomis Herba,LH)為唇形科植物獨一味Lamiophlomisrotata(Benth.) Kudo的干燥地上部分,系藏族習(xí)用藥材,也常作中藥使用?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版載其具有活血止血、祛風(fēng)止痛的功效,可用于治療跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、黃水病[1]。其藏藥名“大巴”“打布巴”,先后記載于藏醫(yī)著作《月王藥診》《四部醫(yī)典》《晶珠本草》等,迄今已有1 200年的應(yīng)用歷史[2];《晶珠本草》中記載“獨一味,固精髓,引流黃水”[3],表明獨一味可應(yīng)用于“黃水病”的治療。而根據(jù)臨床表現(xiàn),藏醫(yī)記載的“黃水病”可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇,由“痹證”發(fā)展而來的“骨痹”、“歷節(jié)病”等與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中“類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)”臨床特征性表現(xiàn)更為貼近[4]。因此,獨一味具有治療RA的潛力[5],現(xiàn)有研究也表明了獨一味具有抗RA的藥效[6-8]。

RA是一種以慢性、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病,其病理特點表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞“腫瘤樣”增生以及血管翳的形成,其中成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是其主要的效應(yīng)細(xì)胞[9]。目前,RA的發(fā)病機(jī)制尚不明確,其發(fā)病率和致殘率均較高,且通常潛伏發(fā)病,疾病晚期可能導(dǎo)致不同程度無法逆轉(zhuǎn)的殘疾,屬世界衛(wèi)生組織規(guī)定的現(xiàn)代難治病[10]。臨床上常用于治療RA的化學(xué)藥物如非甾體抗炎藥、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和生物制劑,前3種化學(xué)藥物不良反應(yīng)明顯,而生物制劑昂貴的價格限制了其長期應(yīng)用[11]。故開發(fā)臨床新型低副作用且療效穩(wěn)定的抗RA藥物顯得尤為必要。

課題組前期首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對獨一味抗RA的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行了探討,發(fā)現(xiàn)獨一味對RA的治療作用與其23種成分相關(guān),其中黃酮類成分?jǐn)?shù)量占比接近40%,提示黃酮類成分在獨一味抗RA的過程中發(fā)揮了重要作用,尤其是木犀草素;并提出獨一味抗RA的主要機(jī)制可能是通過抑制PI3K-Akt信號通路誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡[12]。同時,通過大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型對獨一味抗RA的作用及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明獨一味總黃酮具有良好的抗RA作用[13]。獨一味總黃酮可能是其抗RA的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一,但獨一味總黃酮中抗RA的關(guān)鍵藥效成分還不明確,亟待進(jìn)一步研究。因此,本研究擬通過譜效關(guān)系和成分敲除技術(shù),對獨一味總黃酮中抗RA的關(guān)鍵成分進(jìn)行探討,旨在為臨床運用獨一味治療RA提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥材及樣品制備

13批不同產(chǎn)地獨一味藥材樣品信息見表1,所有樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蔣桂華教授鑒定為唇形科植物獨一味Lamiophlomisrotata(Benth.) Kudo的干燥地上部分。

表1 獨一味樣品信息

獨一味總黃酮樣品的制備:取獨一味藥材粉末100 g加入滲漉桶中,加入95%乙醇水沒過粉末,靜置24 h后開始提取。95%乙醇水適當(dāng)流速滲漉,收集滲漉液,于50 °C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑,待回收至約30 mL時將濃縮的滲漉提取液與預(yù)處理的聚酰胺粉拌勻,在50 °C水浴蒸干,上樣于已處理好的聚酰胺色譜柱,放置24 h。先以高純水(3倍柱體積)洗脫至無色,然后用70%乙醇水溶液(14倍柱體積)洗脫,并收集70%乙醇水洗脫液,減壓濃縮,即得獨一味總黃酮?；谠摲椒ㄕn題組制備得到的13批獨一味總黃酮純度范圍在55.82%～94.12%,純度平均值為80.62%。

1.1.2 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司);KQ-500VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XSP-37XB倒置生物顯微鏡(上海民儀電子有限公司);SYNERGY H1BioTek多功能微孔板檢測儀(安捷倫科技有限公司);ZF-90紫外分析儀(溫州奧利生物醫(yī)學(xué)儀器廠)。

1.1.3 試劑與試藥

色譜純乙腈(美國TEDIA公司);色譜純甲酸(成都市科隆化學(xué)品有限公司);超純水;分析純甲苯、甲酸乙酯、甲酸、三氯化鋁(成都市科隆化學(xué)品有限公司);二甲基亞砜(河北品科研生物科技有限公司);Fetal Bovine Serum血清(天杭生物有限公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(武漢塞維爾生物科技有限公司)。

對照品木犀草苷(批號MUST-21111817)、木犀草素(批號:MUST-21072311)、綠原酸(批號:MUST-21070910)購自成都曼思特生物科技有限公司;CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 實驗細(xì)胞

人滑膜組織由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科肖游君副主任醫(yī)師提供,其取自正在接受膝關(guān)節(jié)滑膜切除術(shù)或全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的活動期RA患者(患者年齡在35～68歲之間);中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)了本研究中涉及的所有研究方案(No.[2017]-049)。

將取自RA患者的滑膜組織精細(xì)切成小片,用膠原酶(1 mg/mL)在37 ℃消化3 h,終止消化后,分離FLS細(xì)胞,將其置于10% FBS(胎牛血清)的DMEM高糖培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 獨一味總黃酮指紋圖譜的建立

1.2.1.1 色譜條件

Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流動相A為乙腈,流動相B為0.2%甲酸水溶液,梯度洗脫(0～15 min,8%→13% A;15～25 min,13% A;25～35 min,13%→17% A;35～55 min,17% A;55～70 min,17%→38% A;70～80 min,38% A);檢測波長為245 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫為29 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.1.2 供試品溶液的制備

取13批獨一味總黃酮樣品各0.1 g,精密稱定,置于25 mL容量瓶中,加甲醇超聲溶解,定容,混勻,過濾,取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜即得。

1.2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱定木犀草苷、木犀草素、綠原酸對照品3 mg,置于10 mL容量瓶中,加甲醇配置成0.3 mg/mL的對照品溶液,搖勻過0.22 μm濾膜,即得。

1.2.1.4 方法學(xué)考察

精密度考察:取獨一味總黃酮樣品(S1),按“1.2.1.2”項下方法制備供試品溶液,按“1.2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,并記錄HPLC圖譜。

重復(fù)性試驗:取獨一味總黃酮樣品(S1)6份,按“1.2.1.2”項下方法制備供試品溶液,按“1.2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析,并記錄HPLC圖譜,考察該方法的重復(fù)性。

穩(wěn)定性試驗:取獨一味總黃酮樣品(S1),按“1.2.1.2”項下供試品溶液制備方法,分別于制樣后0、2、4、8、12、24 h按“1.2.1.1”項下色譜條件記錄HPLC圖譜,考察樣品穩(wěn)定性。

1.2.2 獨一味總黃酮對RA-FLS細(xì)胞活力的影響

1.2.2.1 樣品的制備

取不同批次獨一味總黃酮樣品,使用前溶解于DMSO中,再配制成所需濃度的含藥細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

RA-FLS細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定參照已有研究方法[14,15],設(shè)不含細(xì)胞和藥物的空白組、含細(xì)胞不含藥物的對照組和不同批次獨一味總黃酮給藥組(64 μg/mL),采用顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài),將生長良好的FLS細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),并采用DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL,將懸浮好的細(xì)胞,以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。給藥組加入對應(yīng)濃度的獨一味總黃酮,空白組和對照組加入等體積的含DMSO培養(yǎng)液。

1.2.2.3 獨一味總黃酮對RA-FLS細(xì)胞活力的影響

待細(xì)胞生長貼壁,棄去培養(yǎng)基,用0.1% DMSO溶解獨一味總黃酮,使其在加入細(xì)胞培養(yǎng)孔后的濃度為64 μg/mL,每孔100 μL,孵育48 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中2 h。使用多功能微孔板檢測儀在450 nm波長測定吸光度,按照公式(1)計算細(xì)胞活力。

細(xì)胞抑制率=

(A對照-A試驗)/(A對照-A空白)× 100%

(1)

其中,A對照為細(xì)胞未經(jīng)藥物處理組的吸光度值,A試驗為細(xì)胞經(jīng)藥物處理組的吸光度值,A空白為空白組,即無細(xì)胞、無藥物組的吸光度值。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,服從正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA),組間比較采用LSD,當(dāng)P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.3 獨一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎譜效關(guān)系的建立

將獨一味總黃酮指紋圖譜共有峰峰面積和對應(yīng)FLS細(xì)胞活力抑制率數(shù)據(jù)組成原始數(shù)據(jù)矩陣,進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析和偏最小二乘回歸分析,建立獨一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的譜效關(guān)系。

1.2.4 基于成分敲除研究獨一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵成分

在基因敲除模式的影響下,成分敲除技術(shù)被逐漸引入到中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究中,該技術(shù)具有明顯的中醫(yī)藥特色,可將中醫(yī)藥理論的整體觀、系統(tǒng)觀運用于實際,并突顯中醫(yī)藥多成分協(xié)同拮抗的豐富內(nèi)涵[16]。木犀草素為木犀草苷的糖苷元,可能是由于天然黃酮類成分常以苷類形式存在[17],獨一味總黃酮HPLC圖譜中木犀草苷含量明顯高于木犀草素?；诖?本研究擬采用薄層敲除法對獨一味總黃酮中木犀草苷成分進(jìn)行成分敲除,考察木犀草苷是否為獨一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵成分。

1.2.4.1 對照品溶液的制備

取木犀草苷對照品0.4 mg,精密稱定,以70%乙醇水制備成含木犀草苷0.04 mg/mL的對照品備用溶液。

1.2.4.2 供試品溶液的制備

取獨一味總黃酮0.04 g,置于10 mL容量瓶中,加70%乙醇水溶解,搖勻,作為供試品溶液。

1.2.4.3 薄層色譜條件

展開劑選用甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸(2∶4∶1),顯色劑應(yīng)用5%的三氯化鋁乙醇溶液,在紫外光燈(365 nm)下對木犀草苷予以鑒定。

1.2.4.4 敲除樣品的制備

用注射器吸取適量供試品溶液畫線于活化的硅膠板,另用毛細(xì)管吸取供試品溶液和對照品溶液分別點于畫線條帶的兩端。將硅膠板放入已用展開劑飽和的層析缸中,展開,取出,晾干。將畫線條帶部分以玻璃板覆蓋,于硅膠板兩端部位噴以顯色劑,加熱1 min后置紫外燈下檢視。

挖取未噴顯色劑的目標(biāo)成分色帶部分(與木犀草苷對照品顯相同斑點的色帶部分)并合并其他色帶部分得目標(biāo)成分和目標(biāo)陰性成分的硅膠混合物,如圖1。另取硅膠板點樣,展開后刮取全部硅膠,得獨一味總黃酮的硅膠混合物。

圖1 敲除樣品制備圖Fig.1 Knockout sample preparation chart注:樣品S1及木犀草苷對照品(左);去除目標(biāo)成分條帶(中);目標(biāo)陰性成分(右)。Note:Sample S1 and luteoloside reference substance (left);Stripes for removing target components (middle);Target negative component (right).

1.2.4.5 敲除樣品的成分表征

在薄層板上挖取并合并足夠量的吸附有目標(biāo)成分、目標(biāo)陰性成分和獨一味總黃酮全成分樣品的硅膠,分別置于具塞錐形瓶中,加入5倍量甲醇,超聲提取3次,每次1 h,合并提取液。將提取液于8 000 r/min離心5 min,合并上清液,濃縮,以甲醇定容至2 mL,過0.22 μm微孔濾膜兩次,即得目標(biāo)成分、目標(biāo)陰性成分和獨一味總黃酮全成分的樣品溶液。采用HPLC對目標(biāo)成分、目標(biāo)陰性成分和獨一味總黃酮全成分樣品溶液中的成分進(jìn)行表征。HPLC色譜條件同指紋圖譜研究條件,進(jìn)樣量為60 μL。

1.2.4.6 敲除樣品的細(xì)胞藥效學(xué)研究

RA-FLS細(xì)胞藥效學(xué)實驗方法同“1.2.2”。

1.2.5 等摩爾量木犀草苷和木犀草素對FLS細(xì)胞活力的影響

基于譜效關(guān)系結(jié)論,通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[18],本研究擬對比20 μmol/L的木犀草苷與20 μmol/L木犀草素對FLS細(xì)胞活力影響的差異,以更好地闡明獨一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.2.5.1 樣品制備

取木犀草苷或木犀草素適量,精密稱定,用0.1% DMSO溶解,使其在加入細(xì)胞培養(yǎng)孔后的濃度為20 μmol/L。

1.2.5.2 細(xì)胞藥效學(xué)研究

基于CCK-8法考察20μmol/L木犀草苷和20 μmol/L木犀草素成分對FLS細(xì)胞活力的影響,實驗步驟同“1.2.2”。

2 實驗結(jié)果

2.1 獨一味總黃酮指紋圖譜的建立

2.1.1 方法學(xué)考察結(jié)果

方法學(xué)考察結(jié)果顯示重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度RSD均小于3.0%,表明該方法良好,可用于獨一味總黃酮指紋圖譜的研究。

2.1.2 指紋圖譜的建立

將13批獨一味總黃酮的HPLC色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.130723》,設(shè)置S3號樣品為參照圖譜,以中位數(shù)為對照指紋圖譜生成方法,時間窗口寬度為0.1 min,通過多點校正和自動匹配生成了指紋圖譜對照圖譜,確定了8個共有峰,13批獨一味總黃酮色譜疊加圖見圖2,樣品圖和對照品圖見圖3。

圖3 混合對照品及獨一味總黃酮樣品的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed reference substance and total flavonoid sample from LH注:A:混合對照品;B:獨一味總黃酮樣品;1:綠原酸;4:木犀草苷;8:木犀草素。Note:A:Mixed reference solution;B:Total flavonoid sample of LH;1:Chlorogenic acid;4:Luteoloside;8:Luteolin

2.1.3 相似度評價

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.130723》對13批獨一味總黃酮HPLC指紋圖譜與對照指紋圖譜進(jìn)行相似度評價,相似度計算結(jié)果依次為:0.999、0.996、0.997、0.986、0.998、0.980、0.909、0.974、0.991、0.983、0.988、0.990、0.969,均大于0.9,表明各批次指紋圖譜與對照指紋圖譜有較好的相似性。

2.2 獨一味總黃酮對RA-FLS細(xì)胞活力的影響

統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果,與對照組比較,各批次獨一味總黃酮均能顯著抑制FLS細(xì)胞的活力,不同批次獨一味總黃酮細(xì)胞活力抑制率見表2。

表2 不同批次獨一味總黃酮對FLS細(xì)胞的抑制率(ˉx ± s, n = 3)

2.3 獨一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎譜效關(guān)系的建立

2.3.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析

將13批獨一味總黃酮共有峰峰面積及對應(yīng)FLS細(xì)胞活力抑制率數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSSPRO在線分析平臺中,以13批獨一味總黃酮8個共有峰峰面積為母因素,FLS細(xì)胞活力抑制率為子因素,數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方式選擇標(biāo)準(zhǔn)化,分辨系數(shù)取0.5,計算獨一味總黃酮共有峰峰面積和FLS細(xì)胞活力抑制率的灰色關(guān)聯(lián)度[19],結(jié)果見表3。

表3 共有峰峰面積與細(xì)胞活力抑制率灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果

獨一味總黃酮共有峰峰面積與FLS細(xì)胞活力抑制率關(guān)聯(lián)度值越大,表明該成分對于獨一味總黃酮發(fā)揮治療RA的藥效越重要。由表可知,8個共有峰與RA-FLS細(xì)胞活力抑制率的關(guān)聯(lián)度均在0.6以上,表明獨一味總黃酮抗RA活性是多種成分共同作用的結(jié)果,各共有峰對FLS細(xì)胞活力抑制率的貢獻(xiàn)程度為4號峰>6號峰>1號峰>3號峰>5號峰>7號峰>2號峰>8號峰,其中4號峰為木犀草苷,8號峰為木犀草素。

2.3.2 偏最小二乘回歸分析

以標(biāo)準(zhǔn)化處理后的8個共有峰(記為X1～X8)峰面積為自變量,標(biāo)準(zhǔn)化處理后的不同批次獨一味總黃酮細(xì)胞活力抑制率為因變量,導(dǎo)入SIMCA 14.1作偏最小二乘回歸分析(PLS)。變量投影重要性(VIP)值和偏回歸系數(shù)分別見圖4和5。

圖4 各共有峰峰面積和細(xì)胞活力抑制率VIP值Fig.4 VIP value of common peak area and cell activity inhibition rate

圖5 各共有峰峰面積和細(xì)胞活力抑制率偏回歸系數(shù)Fig.5 Partial regression coefficient of common peak area and cell activity inhibition rate

由圖可知,獨一味總黃酮指紋圖譜中峰3、4、8與FLS細(xì)胞活力抑制率呈正相關(guān);同時VIP值越大(VIP>1),表示自變量對因變量的解釋能力越強(qiáng),以FLS細(xì)胞活力抑制率為指標(biāo),VIP值從大到小的峰號為峰4、7、8、5、3、2、1、6,其中峰4、7、8VIP值均大于1;根據(jù)PLS分析,4號峰和8號峰為獨一味總黃酮中與FLS細(xì)胞活力抑制率關(guān)聯(lián)較大的化學(xué)成分。

2.3.3 譜效關(guān)系的建立

通過建立獨一味總黃酮指紋圖譜,運用CCK-8法檢測獨一味總黃酮對RA-FLS細(xì)胞活力的影響,并結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析和PLS回歸分析建立了獨一味總黃酮抗RA的譜效關(guān)系,揭示了獨一味總黃酮中的化學(xué)成分與抗RA藥效之間的關(guān)系,結(jié)果表明獨一味總黃酮中的木犀草苷和木犀草素成分在其抗RA藥效中發(fā)揮了主要作用。

2.4 基于成分敲除研究獨一味總黃酮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵成分

2.4.1 敲除樣品的成分表征

目標(biāo)成分、目標(biāo)陰性成分和獨一味總黃酮樣品的HPLC色譜圖見圖6。

圖6 敲除樣品的HPLC圖Fig.6 HPLC chromatogram of knockout samples注:A:木犀草苷對照品;B:目標(biāo)成分樣品;C:目標(biāo)陰性成分樣品;D:薄層制備獨一味總黃酮全成分樣品。Note:A:Luteoloside reference substance;B:Target component sample;C:Target negative component sample;D:Thin layer preparation of the total flavone sample of LH.

由圖中可知,目標(biāo)陰性成分與獨一味總黃酮樣品相比,木犀草苷峰面積明顯降低,且除木犀草苷外其他峰均保留較好,表明該方法對獨一味總黃酮中木犀草苷成分進(jìn)行了有效敲除。目標(biāo)成分、目標(biāo)陰性成分和獨一味總黃酮樣品中木犀草苷的峰面積分別為:15.633 6、3.657 0和20.497 0,計算得到木犀草苷敲除率為76.27%,回收率為94.11%。

2.4.2 敲除樣品的細(xì)胞藥效學(xué)研究

細(xì)胞藥效學(xué)實驗結(jié)果見表4。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),與對照組比較,獨一味總黃酮全成分組、目標(biāo)成分組均能顯著抑制FLS細(xì)胞活力(P<0.01),而目標(biāo)陰性成分組與對照組之間無顯著抑制效果。表明木犀草苷在獨一味總黃酮發(fā)揮治療RA藥效的過程中起到了關(guān)鍵作用。

表4 各組樣品對FLS細(xì)胞的抑制率(ˉx ± s, n = 3)

2.5 等摩爾量木犀草苷和木犀草素對FLS細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞藥效學(xué)實驗結(jié)果見表5。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示,與對照組比較,木犀草苷組和木犀草素組均能顯著抑制FLS細(xì)胞活力(P<0.01);木犀草苷組和木犀草素組比較對FLS細(xì)胞活力的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但木犀草素抑制率數(shù)值有明顯升高趨勢。

表5 木犀草苷和木犀草素對FLS細(xì)胞的抑制率(ˉx ± s, n = 3)

3 討論與結(jié)論

基于高效液相色譜-二級線性陣列檢測器法(high performance liquid chromatography with diode array detector,HPLC-DAD)完成了獨一味總黃酮指紋圖譜的初步研究,各批次獨一味總黃酮樣品指紋圖譜與建立的對照指紋圖譜相似度均大于0.9,表明不同批次獨一味總黃酮樣品中含有的化學(xué)成分具有一致性。課題組前期考察了獨一味總黃酮不同給藥濃度和不同給藥時間對FLS細(xì)胞活力的影響,基于此采用CCK-8法在64 μg/mL給藥濃度處理FLS細(xì)胞48 h條件下,考察了不同批次獨一味總黃酮樣品對FLS細(xì)胞活力的影響,結(jié)果表明13批獨一味總黃酮樣品均能顯著抑制FLS細(xì)胞活力?；讵氁晃犊傸S酮指紋圖譜和細(xì)胞藥效實驗結(jié)果,采用灰色關(guān)聯(lián)度和偏最小二乘(PLS)回歸分析建立獨一味總黃酮抗RA的譜效關(guān)系,結(jié)果表明獨一味總黃酮中的木犀草苷和木犀草素成分在其抗RA藥效中發(fā)揮了主要作用?；诒由V法對獨一味總黃酮中含量較高的木犀草苷成分進(jìn)行有效敲除,并結(jié)合CCK-8法測定各樣品對FLS細(xì)胞活力的影響,結(jié)果表明全成分和目標(biāo)成分樣品能夠顯著抑制FLS細(xì)胞活力,目標(biāo)陰性成分樣品對FLS細(xì)胞活力無顯著抑制效果。同時比較了等摩爾量木犀草苷和木犀草素成分對RA-FLS細(xì)胞活力的影響,結(jié)果表明木犀草苷和木犀草素均能顯著抑制FLS細(xì)胞活力,但木犀草素組與木犀草苷組之間無顯著差異。

綜上,本研究結(jié)果表明木犀草苷和木犀草素成分在獨一味總黃酮抗RA的藥效中發(fā)揮了主要作用,結(jié)合獨一味總黃酮指紋圖譜研究中木犀草苷的含量明顯高于木犀草素,表明木犀草苷(C21H20O11)為獨一味總黃酮抗RA的關(guān)鍵成分。能夠為臨床運用獨一味總黃酮治療RA提供一定的科學(xué)依據(jù)。木犀草苷廣泛存在于多種藥用植物中,在抗炎、抗氧化、抗癌、降血糖等方面作用明顯,且毒副作用較小[20]。雖然木犀草苷成分較為常見,但目前關(guān)于木犀草苷抗RA的相關(guān)文獻(xiàn)較為匱乏,本研究采用CCK-8法考察了木犀草苷對RA-FLS細(xì)胞活力的影響,明確說明了木犀草苷具有抑制FLS細(xì)胞活力的作用,后續(xù)可進(jìn)一步通過建立大鼠關(guān)節(jié)炎模型進(jìn)行體內(nèi)藥效驗證,并對其作用通路進(jìn)行闡釋,為臨床運用獨一味總黃酮治療RA提供更多的參考和依據(jù)。