劉醒然,牛夢竹,高 原,寇現(xiàn)娟,2*

1武漢體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)院;2武漢體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練監(jiān)控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430079;3廣西醫(yī)科大學(xué)體育與健康學(xué)院,南寧 530021

糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)主要的微血管并發(fā)癥之一,也是終末期腎病的主要病因。其主要特征是腎小球基底膜的增厚、系膜和腎小管間質(zhì)的基質(zhì)擴(kuò)張以及足細(xì)胞丟失,導(dǎo)致微量白蛋白尿的發(fā)展和腎功能下降[1]。隨著DKD的持續(xù)發(fā)展,腎臟組織的顯微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)持續(xù)炎癥及損傷,導(dǎo)致彌漫性間質(zhì)纖維化破壞正常腎臟顯微結(jié)構(gòu),最終發(fā)展成腎纖維化(renal fibrosis,RF)。而目前緩解DKD發(fā)展成RF的手段多集中于通過改善DKD來實(shí)現(xiàn)。但對(duì)于包括DKD在內(nèi)的多數(shù)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制仍未闡明,以至于DKD演變?yōu)镽F過程中的復(fù)雜機(jī)制也未清晰,導(dǎo)致DKD及RF的治療效果不盡人意[2]。因此探明DKD的發(fā)病機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)來抑制DKD的發(fā)展迫在眉睫。

二氫楊梅素(dihydromyricetin,DHM)是一種天然黃酮類化合物,具有多種藥理作用,包括抗炎、抗氧化、清除自由基、改善線粒體功能障礙、調(diào)節(jié)自噬等[3,4]。目前多項(xiàng)研究表明DHM在治療代謝性疾病方面具有巨大潛力,其不僅可以通過誘導(dǎo)自噬、改善氧化應(yīng)激、抑制炎癥、提高線粒體活性等途徑改善胰島素抵抗,降低血糖水平[5];同時(shí)對(duì)多種糖尿病并發(fā)癥具有良好的改善作用,如:糖尿病腦病[6]、糖尿病心肌病[7]等。但DHM改善糖尿病并發(fā)癥相關(guān)研究并不充分,相關(guān)藥理機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。此外,DHM是否能夠進(jìn)一步改善DKD所導(dǎo)致的RF研究較少,治療作用尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以在龐大的生物發(fā)生過程網(wǎng)絡(luò)背景下,基于中藥成分的結(jié)構(gòu),結(jié)合其生物效應(yīng),聯(lián)合疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)而構(gòu)建“藥物—成分—靶點(diǎn)—疾病”互作網(wǎng)絡(luò),是探索中藥有效成分、分子機(jī)制以及潛在靶點(diǎn)的有效手段。分子對(duì)接可以模擬分子和蛋白質(zhì)之間的相互作用,預(yù)測配體和受體的構(gòu)象,對(duì)親和力和結(jié)合模式進(jìn)行計(jì)算和預(yù)測以驗(yàn)證藥物成分對(duì)主要靶點(diǎn)的具體作用方式。因此,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方式,篩選并預(yù)測DHM作用于DKD以及RF的潛在靶點(diǎn),構(gòu)建“成分—靶點(diǎn)—疾病”互作網(wǎng)絡(luò),結(jié)合分子對(duì)接以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測的主要靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,探討二氫楊梅素改善db/db小鼠腎纖維化的分子機(jī)制,為DHM的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)雄性m/m小鼠10只,體重23±2 g,6周齡db/db小鼠20只,體重39±2 g,購買自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(蘇)(2016-0010)。飼養(yǎng)于濕度40%～55%、溫度22～26 ℃,自由飲食飲水,保持良好的通風(fēng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)期間均以普通飼料喂養(yǎng)。普通飼料均由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢體育學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審查批準(zhǔn)號(hào):0087-202010-1301)。

1.1.2 藥物與試劑

二氫楊梅素(純度98%,批號(hào)ALB-202106,美國ALB Technology Limited公司);小鼠尿微量白蛋白ELISA試劑盒(批號(hào)2M-KMLJM219762m,南京卡米洛生物工程有限公司);血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,Scr)試劑盒(批號(hào)分別為C013-2-1、C011-2-1,南京建成生物工程研究所);Notch1、Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain,NICD)抗體(批號(hào)分別為20687-1-AP、20687-1-AP,Proteintech公司);split多毛增強(qiáng)子1(hairy and enhancer of split1,Hes1)和發(fā)狀分裂增強(qiáng)子1(hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif 1,Hey1)抗體(批號(hào)分別為ab71559、ab154077,Abcam公司);第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、p-AKT抗體(批號(hào)分別為9188T、4691T、13038T,Cell Signaling Technology)。

1.1.3 儀器

DYY-6C型垂直電泳儀(北京市六一儀器廠);EPS-300型轉(zhuǎn)膜儀器(海天能科技有限公司);低溫高速離心機(jī)(5415R,Eppendorf);K3型酶標(biāo)儀(賽默飛);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY99-IIDN,寧波新芝生物科技股份有限公司);熒光及化學(xué)放光儀(ChemiScope 6300,上海勤翔);顯微鏡(IXplore SpinSR,Olympus corporation);數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4,金壇市友連儀器研究所)。

1.2 方法

1.2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.2.1.1 DHM作用靶點(diǎn)預(yù)測與疾病靶點(diǎn)獲取

通過TCMSP(https://tcmsp-e.com/)數(shù)據(jù)庫獲取DHM化學(xué)結(jié)構(gòu)的mol文件,并通過Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和Drugbank(https://go.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證后將所獲mol文件上傳至PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數(shù)據(jù)庫對(duì)DHM的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,通過uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫對(duì)所預(yù)測靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范化處理。以“diabetic nephropathy”“diabetic kidney disease”“renal fibrosis”為關(guān)鍵詞,采用DisGeNET(https://www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,分別獲取“DKD”“RF”的靶點(diǎn)。

1.2.1.2 “藥物—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將獲取的DHM、DKD以及RF的靶點(diǎn)上傳至微生信(https://www.bioinformatics.com.cn/)在線平臺(tái)進(jìn)行Venn圖繪制并獲取交集基因。而后將交集基因?qū)隒ytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建“藥物—靶點(diǎn)—疾病”可視化互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2.1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集基因?qū)隨tring(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析,并將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,采用插件cytoHubba對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析,并以度值(degree)為參考依據(jù)選取前10位基因進(jìn)行可視化處理,同時(shí)作為后期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因選取依據(jù)。

1.2.1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

采用David(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對(duì)交集基因進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,分別篩選KEGG富集分析和GO分析中的生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞成分(cellular component,CC)的前10條結(jié)果上傳至微生信平臺(tái)進(jìn)行可視化處理。

1.2.1.5 分子對(duì)接

選取PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值前5位的靶基因并結(jié)合我們前期研究基礎(chǔ)選取靶基因與DHM進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。通過查閱文獻(xiàn)報(bào)道和PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫獲取靶基因蛋白結(jié)構(gòu)的pdb文件。采用Pymol 2.5.5軟件對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取的DHM分子結(jié)構(gòu)去除水分子和小分子配體,采用AutoDock Tools 1.5.6對(duì)DHM結(jié)構(gòu)文件和靶基因蛋白結(jié)構(gòu)文件進(jìn)行加氫、定義受體和配體、分配扭轉(zhuǎn)鍵等構(gòu)象處理;采用autogrid4設(shè)置對(duì)接盒子,AutoDock4進(jìn)行分子對(duì)接并獲取最低結(jié)合能組合。最后使用Pymol進(jìn)行結(jié)果可視化處理。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.2.1 動(dòng)物分組與模型建立

實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將6周齡的m/m小鼠和db/db小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(NC組)、2型糖尿病腎病組(DKD組)、DHM藥物干預(yù)組(DHM組),每組各10只。NC組正常喂養(yǎng)不做干預(yù),DHM藥物干預(yù)組灌胃DHM(基于前期研究結(jié)果選擇DHM終劑量為100 mg/(kg·d))[8,9],DKD組灌胃等體積的生理鹽水,每周干預(yù)5 d,連續(xù)干預(yù)10周。

1.2.2.2 樣品制備與動(dòng)物處理

10周干預(yù)結(jié)束后,禁食測血糖,次日取材,摘眼球取血,分離血清用于生化指標(biāo)檢測,摘取雙側(cè)腎臟后,稱重,取一側(cè)腎臟于多聚甲醛固定,其余液氮凍存后轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存。

1.2.2.3 小鼠體重、空腹血糖和腎功能指標(biāo)檢測

實(shí)驗(yàn)期間,小鼠禁食過夜,12 h后每周固定時(shí)間測小鼠體重和空腹血糖。10周干預(yù)結(jié)束后,眼球取血,靜置2 h后離心取適量血清備用。按照試劑盒提供的方法測定小鼠血清中尿素氮、肌酐、尿蛋白(urine protein,UP)表達(dá)水平。

1.2.2.4 腎臟組織病理學(xué)觀察

腎臟組織于4%的多聚甲醛固定后,石蠟切片厚度約5 μm,按照乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋,制備石蠟切片進(jìn)行HE、Masson與PAS染色,觀察各組小鼠腎組織病理學(xué)改變。

1.2.2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)

提取小鼠腎臟組織及細(xì)胞樣品的總蛋白,通過BCA法測定蛋白濃度后加熱變性后制備蛋白樣品。經(jīng)制膠、上樣、電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,TBST洗膜后,加入對(duì)應(yīng)的一抗,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜,二抗室溫孵育1 h,ECL發(fā)光液顯影,凝膠成像分析儀攝取圖像,計(jì)算目標(biāo)蛋白的灰度值。

1.2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,符合正態(tài)分布方差齊性,組間比較采用單因素方差分析;若不符合正態(tài)分布,則用非參數(shù)檢驗(yàn),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHM改善db/db小鼠病理表現(xiàn)

2.1.1 DHM降低db/db小鼠體重和空腹血糖

每周定時(shí)測定各組小鼠體重和空腹血糖,結(jié)果顯示與NC組相比,DKD組小鼠體重、血糖均明顯升高(P<0.001、P<0.001)。與DKD組小鼠相比,DHM組小鼠的體重和血糖值下降(P<0.01、P<0.01)(見表1、表2)。

表1 DHM對(duì)db/db小鼠體重的影響(ˉx ± s,n = 8)

表2 DHM對(duì)db/db小鼠空腹血糖的影響(ˉx ± s,n = 8)

2.1.2 DHM改善db/db小鼠的腎功能損傷

與NC組相比,DKD組小鼠血清中肌酐、尿素氮和尿蛋白均明顯升高(P<0.001、P<0.001、P<0.05)。與DKD組相比,DHM組小鼠的肌酐、尿素氮和尿蛋白均有不同程度的下降(P<0.01、P<0.001、P<0.01)(見圖1)。表明DHM可以穩(wěn)定db/db小鼠腎功能狀態(tài),緩解腎功能損傷。

圖1 DHM對(duì)db/db小鼠血清中肌酐、尿素氮和尿蛋白的影響(ˉx ± s,n = 4)Fig.1 The expression levels ofScr,BUN and UP in serum of mice in each group (ˉx ± s,n = 4).注:與NC組相比,#P<0.05,###P<0.001;與DKD組相比,**P<0.01,***P<0.001。 Note:Compared with NC,#P<0.05,###P < 0.001;Compared with DKD, **P<0.01,***P<0.001.

2.1.3 DHM減輕db/db小鼠腎病理損傷

為了探究DHM干預(yù)對(duì)db/db小鼠腎臟病理損傷的影響,各組小鼠病理切片行HE染色、 PAS染色。結(jié)果如圖2所示,NC組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)規(guī)則,腎小管結(jié)構(gòu)清晰,腎小管上皮細(xì)胞排列整齊,且基底膜完整;DKD組小鼠腎小球體積增大,腎小球系膜細(xì)胞增生,腎間質(zhì)可見腎小管腫脹且呈空泡樣變性;而DHM組小鼠腎小球體積減小,腎小球系膜細(xì)胞輕度增生且基底膜增厚改善,腎間質(zhì)腎小管腫脹減輕且呈空泡樣變性改善,腎病理損傷程度得到改善(見圖2)。

圖2 DHM對(duì)db/db小鼠腎臟組織病理學(xué)的影響(× 400)Fig.2 Effects of DHM on histopathology of mouse kidney (× 400)

2.1.4 DHM改善db/db小鼠腎纖維化

為了觀察DHM對(duì)db/db小鼠腎纖維化的影響,我們對(duì)腎臟組織切片行Masson和免疫熒光染色,可見與NC組相比,DKD組小鼠腎臟間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)和腎小管膠原纖維蛋白明顯增多,并且小鼠腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)中α-SMA、Fibronectin、CollagenI細(xì)胞熒光染色陽性信號(hào)顯著增強(qiáng)、亮度較強(qiáng);與DKD組比較,DHM組小鼠腎臟膠原蛋白沉積減少,并且腎臟中α-SMA、Fibronectin、CollagenI細(xì)胞熒光染色陽性信號(hào)減弱,提示DHM改善db/db小鼠腎纖維化(見圖3)。

圖3 DHM對(duì)db/db小鼠腎臟組織病理學(xué)的影響(× 400)Fig.3 Effects of DHM on renal pathology in db/db mice (× 400)

2.2 DHM改善db/db小鼠腎纖維化的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.2.1 DHM、DKD與RF的靶點(diǎn)獲取與“藥物—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫共獲取DHM相關(guān)靶點(diǎn)379個(gè),分別從DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取DKD、RF相關(guān)靶點(diǎn)1 189、570個(gè)。將DHM、DKD和RF靶點(diǎn)取交集后得到37個(gè)交集靶點(diǎn)(見圖4),并進(jìn)一步導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖5)。

圖4 DHM、DKD與RF靶點(diǎn)Venn圖Fig.4 Venn diagram of intersection targets of DHM,DKD and RF

圖5 藥物—靶點(diǎn)—疾病網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Drug-target-disease network

2.2.2 DHM、DKD與RF交集靶點(diǎn)相互作用的蛋白-蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將37個(gè)交集基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示該網(wǎng)絡(luò)共包含37個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù),邊數(shù)為241,平均節(jié)點(diǎn)度為13,聚類系數(shù)為0.768(見圖6)。在Cytoscape軟件中使用cytoHubba插件分析并根據(jù)度值(degree)獲取前10的靶點(diǎn),分別為蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)、血清中白蛋白(albumin,ALB)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cystein-asparate protease-3,CASP3)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP9)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARG)、激酶插入?yún)^(qū)受體(kinase insert domain receptor,KDR)、MMP2、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)。隨后將前10位基因進(jìn)一步可視化(見圖7)。

圖6 DHM、DKD與RF靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 PPI network diagram of targets of DHM,DKD,and RF

圖7 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 PPI network diagram of core target protein

2.2.3 DHM、DKD與RF交集靶點(diǎn)的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將37個(gè)交集基因上傳至David數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能分析和KEGG富集分析,結(jié)果顯示DHM與DKD、RF的聯(lián)系涉及GO功能分析中BP 223項(xiàng)、CC 25項(xiàng)以及MF 52項(xiàng)。BP主要涉及凋亡的負(fù)調(diào)控與正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)以及對(duì)缺氧反應(yīng)等過程(見圖8);CC主要涉及胞外區(qū)、受體復(fù)合物以及細(xì)胞外空間等細(xì)胞成分(見圖9);MF則主要集中在鋅離子結(jié)合、酶結(jié)合和RNA聚合酶II的調(diào)節(jié)等功能(見圖10)。KEGG通路富集結(jié)果顯示DHM對(duì)DKD、RF的作用通路可能涉及糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE)及其糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)信號(hào)通路、糖尿病心肌病以及叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞族(forkhead transcription factor of the O class,FoxO)信號(hào)通路等(見圖11)。

圖8 交集靶點(diǎn)GO功能分析(BP)Fig.8 Intersection target GO function analysis (BP)

圖9 交集靶點(diǎn)GO功能分析(CC)Fig.9 Intersection target GO function analysis (CC)

圖10 交集靶點(diǎn)GO功能分析(MF)Fig.10 Intersection target GO function analysis (MF)

圖11 KEGG通路富集分析Fig.11 Intersection target KEGG pathway enrichment analysis

2.2.4 DHM與靶基因蛋白分子對(duì)接結(jié)果

將DHM與PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值前5位的核心靶點(diǎn)(AKT1、ALB、CASP3、EGFR、MMP9)以及結(jié)合我們前期研究基礎(chǔ)所選AKT1上游靶點(diǎn)Notch1和PTEN進(jìn)行分子對(duì)接(見圖12)。結(jié)果顯示DHM與各靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能均小于0 kcal/mol(表3),表示DHM與所選取靶點(diǎn)蛋白均能良好結(jié)合,意味著DHM可以通過所對(duì)接靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而改善db/db小鼠DKD。

圖12 DHM與核心靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接結(jié)果模式圖Fig.12 Molecular docking result pattern of DHM and core target protein

表3 DHM與核心靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接結(jié)果

2.3 DHM改善db/db小鼠腎纖維化分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為進(jìn)一步探討DHM改善db/db小鼠腎纖維化的分子機(jī)制,基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接結(jié)果,結(jié)合前期研究基礎(chǔ),我們對(duì)DHM干預(yù)的db/db小鼠腎臟中Notch/PTEN/AKT通路相關(guān)蛋白的變化進(jìn)行研究。Western Blot結(jié)果顯示,與NC組相比,DKD組小鼠腎組織中的Notch通路出現(xiàn)過度激活,表現(xiàn)為Notch1、NICD、Hes1、Hey1蛋白明顯上調(diào)(P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.01)并抑制PTEN的表達(dá)(P<0.01),同時(shí)促進(jìn)AKT的磷酸化,即p-AKT上調(diào)(P<0.01)。而DHM干預(yù)則可逆轉(zhuǎn)上述變化, DHM組Notch通路受到抑制,相關(guān)蛋白NICD、Hes1、Hey1以及p-AKT的表達(dá)均出現(xiàn)下降(P<0.05、P<0.01、P<0.05、P<0.01),而PTEN的表達(dá)上調(diào)(P<0.001)(見圖13)。提示DHM可能通過調(diào)控Notch/PTEN/AKT通路改善db/db小鼠腎纖維化。

圖13 DHM對(duì)db/db小鼠腎臟Notch/PTEN/AKT通路的影響(ˉx ± s,n = 4)Fig.13 Effect of DHM on the Notch/PTEN/AKT pathway in the kidneys of db/db mice(ˉx ± s,n = 4)注:與NC組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P < 0.001;與DKD組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Note:Compared with NC,#P<0.05,##P<0.01,###P < 0.001;Compared with DKD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

3 討論與結(jié)論

目前糖尿病普遍的治療手段主要依靠血糖的控制,而作為糖尿病最嚴(yán)重并發(fā)癥之一的DKD并無有效治療策略[10,11]。因此深入了解DKD的發(fā)病機(jī)制以及尋找有效治療策略來抑制DKD向腎纖維化發(fā)展的趨勢非常重要。天然藥物已被證實(shí)具有較少的副作用以及多靶點(diǎn)療效的獨(dú)特優(yōu)勢,是近年來研發(fā)慢性疾病新型藥物的重要來源。對(duì)DHM進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),DHM在改善代謝性疾病方面顯示出巨大的治療潛力。因此,本研究在DHM改善db/db小鼠的腎纖維化的基礎(chǔ)上,結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接技術(shù)深入探討DHM改善db/db小鼠腎纖維化的潛在治療靶點(diǎn)以及分子機(jī)制,并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

首先我們觀察發(fā)現(xiàn)10周的DHM干預(yù)可以使db/db小鼠血糖、體重、肌酐、尿素氮、尿蛋白及腎臟的病理表現(xiàn)出現(xiàn)有效緩解,意味著DHM可減輕db/db小鼠腎功能損傷,減緩DKD的發(fā)展。在對(duì)DHM、DKD以及RF的37個(gè)交集靶點(diǎn)分析篩選發(fā)現(xiàn)AKT1、ALB、CASP3、EGFR、MMP9、IGF1、PPARG、KDR、MMP2、ACE等10個(gè)靶點(diǎn)可能是DHM改善DKD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中AKT1、CASP3、EGFR、MMP9、IGF1、MMP2、ACE已被證實(shí)在糖尿病環(huán)境中被激活,而通過特異性抑制后可改善DKD的受損狀態(tài),減緩纖維化發(fā)展的趨勢[12-16]。PPARG、KDR則在糖尿病生理環(huán)境下受到抑制,激活后則起到腎臟保護(hù)作用[17]。ALB是觀察DKD是糖尿病發(fā)展過程中重要的觀察腎臟損傷程度的生化指標(biāo),通常表現(xiàn)為隨著DKD的發(fā)生而升高,DKD改善后出現(xiàn)下降[18]。意味著我們所篩選出10個(gè)關(guān)鍵基因不僅可以作為DKD潛在的生物標(biāo)志物,也可能是進(jìn)一步探討DKD發(fā)病機(jī)制以及治療手段的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示DHM對(duì)DKD的改善作用可能涉及AGE-RAGE信號(hào)通路、糖尿病心肌病以及FoxO信號(hào)通路。其中AGE-RAGE信號(hào)通路與FoxO信號(hào)通路在DKD發(fā)展過程中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)AGEs在DKD患者的內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管和系膜細(xì)胞以及足細(xì)胞等細(xì)胞出現(xiàn)特異性激活,并與RAGE相互作用增強(qiáng),進(jìn)一步加劇腎臟中的氧化應(yīng)激和炎癥,導(dǎo)致DKD的惡化[19]。另外,活化的FoxO3a則可以抑制糖尿病大鼠腎臟中的氧化應(yīng)激水平,改善炎癥,進(jìn)而抑制DKD的發(fā)生[20]。表明特異性調(diào)控AGE-RAGE信號(hào)通路或FoxO信號(hào)通路可能對(duì)防治DKD具有重要意義。

分子對(duì)接結(jié)果顯示DHM與所選排名前5的靶點(diǎn)均能表現(xiàn)出良好的結(jié)合性,意味著DHM治療DKD的有效性在分子層面得到驗(yàn)證。此外我們注意到所篩選排名第一的關(guān)鍵靶基因AKT1與KEGG通路富集分析得到AGE-RAGE信號(hào)通路和FoxO信號(hào)通路在DKD發(fā)展中密切相關(guān)。其中AGE-RAGE信號(hào)通路可協(xié)同PI3K/Akt信號(hào)通路誘發(fā)腎臟內(nèi)的氧化應(yīng)激和慢性炎癥,進(jìn)而導(dǎo)致腎臟疾病[21]。而PI3K/Akt/FoxO3a通路的激活則可以改善糖尿病環(huán)境下腎臟的生理功能[22]。因此,我們進(jìn)一步嘗試探究AKT1上游的Notch通路與DHM的相互作用并進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。分子對(duì)接結(jié)果顯示DHM與Notch1、PTEN均表現(xiàn)出了良好的結(jié)合性。

既往研究表明,在DKD發(fā)展過程中Notch通路出現(xiàn)過度激活,表現(xiàn)為Notch1、NICD、Hes1和Hey1的表達(dá)上升[23]。Notch1的抑制劑則可以通過降低Hes1的活化來激活PTEN,進(jìn)而改善自噬障礙,減緩RF的發(fā)生[24]。此外,另有研究發(fā)現(xiàn)PTEN的激活也可以通過抑制PI3K/AKT通路來緩解DKD的進(jìn)展[25,26]?；谝陨辖Y(jié)果,我們推測DHM可以通過調(diào)控Notch/PTEN/AKT通路改善DKD。Western blot結(jié)果顯示db/db小鼠腎臟中Notch通路活化程度異常升高,PTEN表達(dá)降低以及AKT的磷酸化增加。而DHM攝入可以抑制Notch通路的活化,激活PTEN并抑制AKT的磷酸化。盡管Notch/PTEN/AKT信號(hào)軸作為整體路徑在糖尿病環(huán)境下的腎臟保護(hù)作用研究較少,但我們的研究一定程度上完善了相關(guān)研究,并豐富了DHM通過多靶點(diǎn)發(fā)揮其生物學(xué)保護(hù)作用的分子機(jī)制。

綜上所述,本研究以觀察DHM改善DKD病理表現(xiàn)的結(jié)果為基礎(chǔ),結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)初步論證了DHM改善DKD進(jìn)展的作用可能通過AKT1、ALB、CASP3、EGFR、MMP9、IGF1、PPARG、KDR、MMP2、ACE等關(guān)鍵靶點(diǎn)來實(shí)現(xiàn),并對(duì)相關(guān)通路進(jìn)行了分析。最后結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)DHM潛在的AKT靶點(diǎn)進(jìn)行了初步驗(yàn)證及分析,發(fā)現(xiàn)DHM可能通過調(diào)控Notch/PTEN/AKT通路起到防治DKD的作用(見圖14)。但目前關(guān)于DHM對(duì)T2DM的并發(fā)癥研究相對(duì)較少,其治療潛力仍待進(jìn)一步研究。

圖14 DHM通過調(diào)控Notch/PTEN/AKT通路改善db/db小鼠腎纖維化Fig.14 DHM improves renal fibrosis in db/db mice by regulating Notch/PTEN/AKT signaling pathway