杜晗笑,冉軍艦,孫俊良,鄧艷文,李瑞雪,龐帥

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhanmnosusGG）是兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌,具有耐酸、耐膽汁鹽、耐多種抗生素等生物學(xué)特點(diǎn)[1],可在人和動物腸道中定植,具有預(yù)防腹瀉、提高機(jī)體免疫力和保護(hù)胃黏膜等功能[2-4],被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品、干酪、果汁飲料和藥品等行業(yè)中[5].隨著國際組織對益生菌制劑的重視及市場需求的穩(wěn)定增加,生產(chǎn)高密度、高穩(wěn)定性的益生菌凍干菌粉已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn).但目前市場上凍干菌粉普遍存在的活菌含量低、貯藏穩(wěn)定性不佳等問題急需解決.

真空冷凍干燥是制備凍干菌粉最常見的方法之一,但在冷凍干燥過程中存在活細(xì)胞損傷嚴(yán)重、活菌含量低、活菌下降迅速等問題[6-7].凍干過程中選擇適合的凍干保護(hù)劑如糖、蛋白質(zhì)和氨基酸類等,可以減少細(xì)胞的物理化學(xué)損傷,保持細(xì)胞活性[8-10].目前,已有相關(guān)研究表明保護(hù)劑在防止低溫?fù)p傷、提高細(xì)菌凍干存活率方面的作用,但由于不同菌種間存在生物學(xué)差異,因此需針對特定菌株進(jìn)行評估和調(diào)整[11-14].另外,在市場應(yīng)用中,無法保證菌粉貯藏期間的細(xì)菌活性也是一大問題.因此,探究不同保護(hù)劑對鼠李糖乳桿菌保護(hù)效果,建立合理可行的菌粉制備工藝,對提高凍干菌粉的活菌數(shù)及貯藏穩(wěn)定性具有重要意義.

本研究從開菲爾粒中篩選一株高產(chǎn)細(xì)菌素的專利菌株鼠李糖乳桿菌zrx01,通過確定菌體離心條件,以凍干存活率為評定指標(biāo),在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上對7 種凍干保護(hù)劑進(jìn)行響應(yīng)面工藝優(yōu)化并測定菌粉活菌數(shù)與穩(wěn)定性,為活性高、穩(wěn)定性好的鼠李糖乳桿菌zrx01 凍干菌粉制備和研究提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosuszrx01,GenBank No.KY348290）,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號CGMCC No.15076,專利號CN201810181018.4.

1.1.2 試劑脫脂乳粉、海藻糖、乳糖、山梨醇、谷氨酸鈉、蔗糖、甘油,河南華瑞生物科技有限公司；MRS 培養(yǎng)基,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司.以上試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH 計(jì),上海盛磁儀器有限公司；SPX-250 型生化培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；ZQTY-70N振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-1D 單人單面垂直凈化工作臺,蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；湘儀H2050R 臺式高速冷凍離心機(jī),長沙湘儀離心機(jī)有限公司；Thermo 900 系列超低溫冰箱,鄭州金友寧儀器有限公司；CHRIST ALPHA 1-4 LSC 型冷凍干燥機(jī),德國CHRIST 公司.

1.3 鼠李糖乳桿菌菌種擴(kuò)大培養(yǎng)

將-80 ℃甘油保藏的鼠李糖乳桿菌用接種環(huán)取樣,接種到MRS 液體培養(yǎng)基中,在37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)24 h,活化2~3 次,得到活化菌種.將活化好的種子菌液按1%的接種量接種至MRS 液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、180 r/min 搖床中培養(yǎng)18 h 至對數(shù)期備用.

1.4 鼠李糖乳桿菌離心條件的選擇

將30 mL 鼠李糖乳桿菌菌液置于50 mL 離心管中,離心溫度4 ℃,分別在離心轉(zhuǎn)速4 000、6 000、8 000 r/min 離心條件下離心10、15、20 min,棄上清液收集菌泥,生理鹽水洗滌2~3 次,加入等體積的生理鹽水充分混勻,采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌總數(shù),按式（1）計(jì)算離心收獲率

1.5 凍干菌懸液的制備及真空冷凍干燥

收集乳酸菌菌泥,按照原菌液體積的1/10 加入保護(hù)劑混合均勻,于-80 ℃預(yù)凍4 h 后進(jìn)行真空冷凍干燥.干燥條件為：冷阱溫度-70 ℃,干燥時間24 h,真空度1 Pa.凍干完成后加入等體積生理鹽水充分混勻,采用平板計(jì)數(shù)法測定凍干前后乳酸菌單位體積活菌數(shù),按式（2）計(jì)算凍干存活率

1.6 單因素試驗(yàn)

糖、蛋白質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)是最常見的低溫保護(hù)劑,確定合適的保護(hù)劑是提高細(xì)胞存活率的關(guān)鍵.通過查閱文獻(xiàn)并結(jié)合試驗(yàn)成本,選擇7 種常用的凍干保護(hù)劑脫脂乳粉、海藻糖、乳糖、山梨醇、谷氨酸鈉、蔗糖和甘油[15-21],以凍干存活率為評定指標(biāo),通過單因素試驗(yàn)研究不同保護(hù)劑對鼠李糖乳桿菌的凍干保護(hù)作用.

1.6.1 脫脂乳粉對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響收集離心菌泥,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、8%、12%、16%和20%的脫脂乳粉充分混勻,海藻糖、乳糖、山梨醇、谷氨酸鈉、蔗糖和甘油的添加量為0,以添加生理鹽水組為對照組進(jìn)行凍干,凍干完成后添加生理鹽水復(fù)溶30 min,計(jì)算活菌數(shù)及凍干存活率.

1.6.2 海藻糖對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響收集離心菌泥,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、8%、12%、16%和20%的海藻糖充分混勻,脫脂乳粉、乳糖、山梨醇、谷氨酸鈉、蔗糖和甘油的添加量為0,以添加生理鹽水組為對照組進(jìn)行凍干,凍干完成后添加生理鹽水復(fù)溶30 min,計(jì)算活菌數(shù)及凍干存活率.

1.6.3 乳糖對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響收集離心菌泥,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%、12%、18%、24%和30%的乳糖充分混勻,脫脂乳粉、海藻糖、山梨醇、谷氨酸鈉、蔗糖和甘油的添加量為0,以添加生理鹽水組為對照組進(jìn)行凍干,凍干完成后添加生理鹽水復(fù)溶30 min,計(jì)算活菌數(shù)及凍干存活率.

1.6.4 山梨醇對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響收集離心菌泥,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、5%、7%、9%和11%的山梨醇充分混勻,脫脂乳粉、海藻糖、乳糖、谷氨酸鈉、蔗糖和甘油的添加量為0,以添加生理鹽水組為對照組進(jìn)行凍干,凍干完成后添加生理鹽水復(fù)溶30 min,計(jì)算活菌數(shù)及凍干存活率.

1.6.5 谷氨酸鈉對鼠李唐乳桿菌凍干存活率的影響收集離心菌泥,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%和5%的谷氨酸鈉充分混勻,脫脂乳粉、海藻糖、乳糖、山梨醇、蔗糖和甘油的添加量為0,以添加生理鹽水組為對照組進(jìn)行凍干,凍干完成后添加生理鹽水復(fù)溶30 min,計(jì)算活菌數(shù)及凍干存活率.

1.6.6 蔗糖對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響收集離心菌泥,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%和5%的蔗糖充分混勻,脫脂乳粉、海藻糖、乳糖、山梨醇、谷氨酸鈉和甘油的添加量為0,以添加生理鹽水組為對照組進(jìn)行凍干,凍干完成后添加生理鹽水復(fù)溶30 min,計(jì)算活菌數(shù)及凍干存活率.

1.6.7 甘油對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響收集離心菌泥,分別加入體積分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%和10%的甘油充分混勻,脫脂乳粉、海藻糖、乳糖、山梨醇、谷氨酸鈉和蔗糖的添加量為0,以添加生理鹽水組為對照組進(jìn)行凍干,凍干完成后添加生理鹽水復(fù)溶30 min,計(jì)算活菌數(shù)及凍干存活率.

1.7 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇脫脂乳粉、海藻糖、乳糖和谷氨酸鈉四個因素,以鼠李糖乳桿菌凍干存活率為指標(biāo),通過Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn).

1.8 凍干菌粉貯藏穩(wěn)定性

將真空冷凍干燥后的凍干菌粉裝入經(jīng)滅菌處理的玻璃瓶中避光保存,分別在-20 ℃、4 ℃和25 ℃下貯藏0、30、60、90 d,與初始凍干菌粉比較,測定不同溫度條件下鼠李糖乳桿菌貯藏期間的存活率.貯藏期間的存活率按式（3）計(jì)算

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS24 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）,以P＜0.05 為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)；采用Design-Expert 8軟件進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)；采用Origin 2022 進(jìn)行圖形繪制；試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌離心條件的確定

不同離心條件下鼠李糖乳桿菌離心收獲率試驗(yàn)結(jié)果見表1.

表1 不同離心條件下離心收獲率Tab.1 Table of centrifugal harvest rate under different centrifugal conditions

由表1 可知,在離心轉(zhuǎn)速為4 000 和8 000 r/min 時,離心存活率較低,這是因?yàn)樵? 000 r/min 條件下離心作用力較小,上清液中的菌體無法完全沉積；當(dāng)離心轉(zhuǎn)速為8 000 r/min 時,離心作用強(qiáng),菌體在離心過程中受到嚴(yán)重的機(jī)械損傷,從而導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡.在離心轉(zhuǎn)速為6 000 r/min,時間為15 min 時離心收獲率最高達(dá)到了91.21%,與其它組別相比具有顯著性差異.因此確定離心轉(zhuǎn)速6 000 r/min,離心時間15 min 為鼠李糖乳桿菌的離心收集條件.

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 脫脂乳粉對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響脫脂乳粉是一種復(fù)雜的物質(zhì),由乳糖、蛋白質(zhì)和微量元素組成,其中牛乳蛋白能夠在細(xì)胞表面形成黏性的保護(hù)層,在冷凍干燥過程中減少細(xì)胞損傷[22].不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)脫脂乳粉對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響見圖1.

圖1 脫脂乳粉對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響Fig.1 Effects of skin milk powder on freeze-dried survival rate of Lactobacillus rhamnosus

由圖1 可知,隨著脫脂乳粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,鼠李糖乳桿菌凍干存活率呈先上升后下降的趨勢,當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時,菌體存活率最高為70.67%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)升高,凍干存活率開始下降.Latife 等[23]研究不同保護(hù)劑對曲拉氏乳桿菌N19 凍干的保護(hù)作用,結(jié)果表明脫脂乳粉對菌體凍干存活率影響最為顯著,與本研究結(jié)果基本一致.這是由于脫脂乳粉能夠在細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間形成粘性保護(hù)層,具有減少細(xì)胞凍干損傷的作用；但在保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)升高時會使環(huán)境滲透壓過高,導(dǎo)致部分細(xì)胞脫水死亡,使凍干存活率降低.綜上,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%脫脂乳粉對鼠李糖乳桿菌凍干的保護(hù)效果最佳.

圖2 海藻糖對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響Fig.2 Effects of trehalose on freeze-dried survival rate of Lactobacillus rhamnosus

由圖2 可知,隨著海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高,鼠李糖乳桿菌凍干存活率呈現(xiàn)先升高后緩慢下降趨勢.海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時,凍干存活率較低；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時,凍干存活率最高,為69.70%；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)升高,凍干存活率呈緩慢下降趨勢.李大鵬等[2]研究海藻糖對植物乳桿菌凍干存活率的影響,結(jié)果表明隨著海藻糖濃度升高,植物乳桿菌凍干存活率先升高后趨于平緩,最高達(dá)60%以上,與本研究結(jié)果基本一致,這可能是由于海藻糖能夠填充到細(xì)胞在凍干過程中因蛋白質(zhì)失水形成的空缺中,形成一個玻璃狀保護(hù)層,有效提高凍干菌存活率,但保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高則會導(dǎo)致細(xì)胞玻璃化結(jié)構(gòu)過強(qiáng),影響菌體自身結(jié)構(gòu),使存活率降低.綜上,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時海藻糖對鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)效果最佳.

2.2.3 乳糖對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響在冷凍干燥過程中,乳糖可以顯著提高細(xì)胞玻璃化相變溫度,從而減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用[25-26].不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乳糖對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響見圖3.

圖3 乳糖對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響Fig.3 Effects of lactose on freeze-dried survival rate of Lactobacillus rhamnosus

由圖3 可知,當(dāng)乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在6%~18%時,隨乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大,鼠李糖乳桿菌凍干存活率顯著提升,最高達(dá)71.64%；當(dāng)乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于18%時,鼠李糖乳桿菌凍干存活率反而下降.Cui 等[27]研究表明乳糖顯著提高了短乳桿菌173-1-2 凍干存活率,最高可達(dá)70%,與本研究結(jié)果一致.這是由于乳糖作為小分子半透溶質(zhì),可以在不進(jìn)入細(xì)胞膜的情況下滲透細(xì)胞壁,保護(hù)該空間膜穩(wěn)定性,防止因冰晶形成而造成的細(xì)胞損傷；但保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高可能會導(dǎo)致細(xì)胞失水死亡,使凍干存活率降低.綜上,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時,乳糖對鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)效果最佳.

2.2.4 山梨醇對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響山梨醇具有多個羥基,在凍干過程中可與菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)結(jié)合形成氫鍵,穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[28].不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)山梨醇對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響見圖4.

圖4 山梨醇對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響Fig.4 Effects of sorbitol on freeze-dried survival rate of Lactobacillus rhamnosus

由圖4 可知,隨著山梨醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高,鼠李糖乳桿菌凍干存活率呈先升高后下降的趨勢,在7%時存活率最高,為50.18%；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于7%時,凍干存活率極速下降.這是由于山梨醇作為多元醇類化合物,具有保護(hù)菌體免受失水損傷和維持細(xì)胞活力的作用[29],而高滲透壓環(huán)境則不利于細(xì)胞存活,使細(xì)胞失水損傷,從而影響凍干存活率.綜上,在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時山梨醇對鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)效果最佳.

2.2.5 谷氨酸鈉對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響谷氨酸鈉具有抗氧化作用,可以抑制三酰甘油的氧化作用和自由基的形成,保護(hù)細(xì)胞膜受到不可逆的損傷[3].不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)谷氨酸鈉對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響見圖5.

圖5 谷氨酸鈉對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響Fig.5 Effects of sodium glutamate on freeze-dried survival rate of Lactobacillus rhamnosus

由圖5 可知,隨谷氨酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高,鼠李糖乳桿菌凍干存活率呈先上升后下降趨勢,在2%時達(dá)到最高,凍干存活率為70.67%；當(dāng)保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%時,存活率開始下降.周佳豪等[30]研究谷氨酸鈉對干酪乳桿菌凍干存活率的影響,結(jié)果表明當(dāng)谷氨酸鈉濃度為1.5%時存活率最高,濃度大于1.5%時呈下降趨勢,與本研究結(jié)果基本一致.這可能是由于谷氨酸鈉能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),起到減緩冰晶生長和防止細(xì)胞損傷的作用；當(dāng)溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高時,進(jìn)入胞內(nèi)谷氨酸鈉含量也偏高,導(dǎo)致部分活性物質(zhì)失活,反而不利于保持細(xì)胞保存.綜上,2%谷氨酸鈉對鼠李糖乳桿菌保護(hù)作用最佳.

2.2.6 蔗糖對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響蔗糖在凍干時可以抑制細(xì)胞膜發(fā)生相變使細(xì)胞保持液晶態(tài)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[31].不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蔗糖對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響見圖6.

唐朝有和尚，號圓澤，與朋友李源善（一稱李源）外出，見一孕婦在河邊汲水，圓澤對李說：這婦人懷孕已三年，只待我去投胎，我一直避著，現(xiàn)在遇見沒有辦法了。三天之后，你到她家去看，如嬰孩對你笑一笑，就是我了；再過13年（一稱12年）中秋月夜，我將在杭州天竺寺等你。說罷那夜國澤圓寂，孕婦生一男孩，第三天李去探看，嬰兒果然對地笑了一笑。13年后中秋夜，李源善到天竺寺，見一牧童坐在牛背上唱歌道：“三生石上舊精魂，賞月吟風(fēng)不要論，慚愧情人遠(yuǎn)相訪，此身雖異性常存。”李聽了嘆道國澤與這牧童真是有三生的緣分啊。

圖6 蔗糖對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響Fig.6 Effects of sucrose on freeze-dried survival rate of Lactobacillus rhamnosus

由圖6 可知,在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%~3%時,鼠李糖乳桿菌凍干存活率呈上升趨勢,在3%時達(dá)到最高,為49.21%,而后開始降低.這可能是由于蔗糖能夠形成保護(hù)層,具有保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用,但保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高會加速細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的聚合,形成過強(qiáng)的玻璃化結(jié)構(gòu),反而不利于細(xì)胞保存.綜上,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%蔗糖對菌體凍干保護(hù)作用最佳.

2.2.7 甘油對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響不同體積分?jǐn)?shù)甘油對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響見圖7.

由圖7 可知,不同甘油體積分?jǐn)?shù)條件下鼠李糖乳桿菌凍干存活率在6%~8%之間,與對照組凍干存活率7.39%相比無顯著差異.景安琪等[32]研究不同保護(hù)劑對乳酸乳球菌凍干存活率的影響,結(jié)果表明脫脂乳、海藻糖和谷氨酸鈉凍干保護(hù)效果最好,甘油、菊粉和谷胱甘肽凍干保護(hù)效果較差.譚莎莎等[33]研究不同類型保護(hù)劑對羅伊氏乳桿菌138-1 凍干存活率的影響, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)可滲透進(jìn)細(xì)胞壁的保護(hù)劑如糖、醇類物質(zhì)凍干保護(hù)效果最佳,可滲透進(jìn)入細(xì)胞膜的保護(hù)劑如甘油、赤蘚糖醇保護(hù)效果不佳,與本研究結(jié)果一致,說明單獨(dú)使用甘油對菌體的保護(hù)作用有限.然而也有研究表明甘油單獨(dú)使用時也具有良好的凍干保護(hù)效果,與本研究結(jié)果相反,這可能是由于不同菌株間的生物學(xué)差異造成的.

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知,脫脂乳粉、海藻糖、乳糖和谷氨酸鈉凍干保護(hù)效果顯著優(yōu)于山梨醇、谷氨酸鈉和甘油,因此選擇脫脂乳粉、海藻糖、乳糖和谷氨酸鈉四種因素為自變量,以凍干存活率為響應(yīng)值,采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn),試驗(yàn)因素水平見表2.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Tab.2 Response surface test factor level table%

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)劑配方,響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3.以A、B、C、D 四個因素為自變量,鼠李糖乳桿菌凍干存活率（Y）為因變量,進(jìn)行四因素三水平的中心組合試驗(yàn),采用Design-Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面擬合.得到二次多項(xiàng)回歸方程如下：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Response surface experimental design and results

（續(xù)表3）

式（3）中Y為鼠李糖乳桿菌凍干存活率,A、B、C、D 分別代表脫脂乳粉、谷氨酸鈉、乳糖、海藻糖.

通過聯(lián)合假設(shè)檢驗(yàn)（F檢驗(yàn)）分析回歸模型并進(jìn)行方差分析,方差分析結(jié)果見表4.

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析Tab.4 Response surface experimental results and analysis of variance

由表4 可知,模型F值為21.30,P＜0.000 1,檢驗(yàn)結(jié)果顯著,失擬項(xiàng)F值為1.32,P=0.469 2,失擬項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果不顯著,說明該回歸方程擬合程度良好.模型決定系數(shù)R2=0.955 2,可用于鼠李糖乳桿菌凍干存活率的理論預(yù)測和分析.由Radj=0.910 3 可知,此回歸方程具有較好的擬合程度.模型的二次多項(xiàng)回歸方程的回歸系數(shù)差異性分析結(jié)果為：模型一次項(xiàng)系數(shù)A（脫脂乳粉）、B（谷氨酸鈉）、D（海藻糖）極顯著,C（乳糖）高度顯著,AC、BC、BD 和CD 交互作用顯著（P＜0.05）,AB 和AD 交互作用不顯著.由F 值可知,各因素對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響程度由大到小為：B（谷氨酸鈉）＞D（海藻糖）＞A（脫脂乳粉）＞C（乳糖）.

2.4 響應(yīng)曲面各因素交互作用分析

響應(yīng)曲面平緩與陡峭以及等高線的稀疏和密集很大程度上反應(yīng)了鼠李糖乳桿菌凍干存活率對各因素的敏感性,若響應(yīng)面陡峭,則表明保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響較為顯著,反之則不敏感[34].各因素交互作用對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響見圖8.

圖8 為各個因素兩兩交互的三維空間響應(yīng)面圖與等高線圖,代表當(dāng)兩組因素水平為零時,另外兩組因素的交互作用對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響.由圖8 可知,圖8-b、8-d、8-e 和圖8-f 響應(yīng)曲面變化較為明顯,等高線圖呈橢圓形,說明AC、BC、BD 和CD 交互作用顯著,且與其它因素相比,沿谷氨酸鈉方向響應(yīng)曲面變化更陡峭,等高線更密集,說明谷氨酸鈉對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響最顯著；圖8-a 和圖8-c 響應(yīng)面曲面變化較緩,等高線密集程度無明顯差異,說明AB、AD 之間交互作用不顯著,與方差分析結(jié)果一致.

2.5 最佳試驗(yàn)條件預(yù)測及驗(yàn)證

經(jīng)模型預(yù)測得鼠李糖乳桿菌最優(yōu)凍干保護(hù)劑配方為：脫脂乳粉16.00%、谷氨酸鈉2.69%、乳糖15.12%、海藻糖9.56%,凍干存活率預(yù)測值為90.97%.在考慮實(shí)際情況和操作方便的條件下,選擇保護(hù)劑在脫脂乳粉16.00%、谷氨酸鈉2.70%、乳糖15.10%和海藻糖9.60%的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),重復(fù)三次最終得到鼠李糖乳桿菌的凍干存活率為（90.12±1.04）%,與模型理論預(yù)測值的誤差為0.93%,測得菌粉含菌量為（1.20±0.07）×1011CFU/g.結(jié)果表明經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化的鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)劑配方合理可行.

2.6 貯藏條件對鼠李糖乳桿菌凍干菌粉存活率的影響

本研究分析不同貯藏溫度和時間對凍干菌粉存活率的影響,試驗(yàn)結(jié)果見圖9.

圖9 貯藏條件對鼠李糖乳桿菌凍干菌粉存活率的影響Fig.9 Effects of storage conditions on survival rate of lyophilized Lactobacillus rhamnosus powder

由圖9 可知,隨著貯藏時間延長,凍干菌粉存活率呈下降趨勢.在-20 ℃貯藏的菌粉的存活率略高于4 ℃,顯著高于25 ℃（P＜0.05）,在-20 ℃、4 ℃和25 ℃貯藏90 d 凍干菌粉存活率分別為82.22%、76.39%和65.00%,存活率達(dá)到65%及其以上,表明該菌種具有良好的貯藏穩(wěn)定性,可在一定程度上提高凍干菌粉品質(zhì),延長產(chǎn)品貨架期.

3 結(jié)論

本研究確定鼠李糖乳桿菌zrx01 的最佳離心條件為離心轉(zhuǎn)速6 000 r/min、離心時間15 min,在此條件下,離心收獲率達(dá)到91.21%；在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上對凍干保護(hù)劑配方進(jìn)行響應(yīng)面工藝優(yōu)化最佳配比為脫脂乳粉16.00%、谷氨酸鈉2.69%、乳糖15.12%、海藻糖9.56%,凍干菌粉的存活率為（90.12±1.04）%,菌粉含菌量為（1.20±0.07）×1011CFU/g；菌粉在-20 ℃、4 ℃和25 ℃貯藏90 d 存活率分別為82.22%、76.39%和65.00%.