王建華,王首萌,屈淑帆,喬雪陽,王曉,李廣領

（河南科技學院資源與環(huán)境學院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

即食性蔬菜是指采摘后通過簡單清洗可直接食用或采用調味（或不調味）工藝加工而成的蔬菜產品[1],例如瓜菜類的黃瓜、苦瓜、佛手瓜等,果菜類的茄子、西紅柿、甜椒等,葉菜類的生菜、卷心菜、苦苣等.這類蔬菜的突出特點是食用方便.此外,由于不經(jīng)過烹飪加工過程,即食性蔬菜能保持蔬菜原本口感,且營養(yǎng)成分不會被破壞.但因即食性蔬菜作物生長周期相對較短,其生長過程中為防控病蟲侵襲而施用的農藥就特別容易使蔬菜產品農藥殘留超標,且其產生的農藥殘留安全風險要遠高于生長周期較長的常規(guī)蔬菜產品.隨著人們食品安全意識不斷增強,農藥殘留風險更高的即食性蔬菜產品質量安全倍受關注.

氯蟲苯甲酰胺（Chorantraniliprole）是美國杜邦公司于2000 年研發(fā)的鄰甲酰氨基苯甲酰胺類殺蟲劑,作為昆蟲魚尼丁受體高效激活劑,對危害多種作物的重要鱗翅目和雙翅目害蟲防效優(yōu)異[2]；甲基硫菌靈（Thiophanate-methyl）是1969 年由日本曹達公司研發(fā)的苯并咪唑類廣普性殺菌劑,其植物代謝轉化產物多菌靈（Carbendazim）同樣具有廣普殺菌活性[3].氯蟲苯甲酰胺熔點為208 ℃~210 ℃、330 ℃（分解）,log Kow（pH 7.0,20 ℃）為2.86,pKa（20 ℃）為10.88,大鼠急性經(jīng)口LD50大于5 000 mg/kg；甲基硫菌靈熔點為172 ℃（分解）,log Kow（pH 7.0,20 ℃）為1.40,pKa（20 ℃）為7.2,堿性條件下易分解,大鼠急性經(jīng)口LD50為6 640~7 500 mg/kg；多菌靈熔點為307 ℃~312 ℃（分解）,log Kow（pH 7.0,20 ℃）為1.51（pH 7.0）,pKa（25 ℃）為4.48,堿性環(huán)境下不穩(wěn)定[4].其中多菌靈為甲基硫菌靈在植物體內的毒理學意義代謝物,大鼠急性經(jīng)口LD50大于15 000 mg/kg,2017 年JMPR 將用于植物產品中膳食風險評估的甲基硫菌靈殘留物定義為甲基硫菌靈及多菌靈之和,結果以多菌靈表達[5].我國現(xiàn)行食品安全標準[6]規(guī)定生菜、黃瓜和西紅柿中甲基硫菌靈最大允許殘留限量（MRLs）分別為5 mg/kg、2 mg/kg 和3 mg/kg；生菜、黃瓜和西紅柿中氯蟲苯甲酰胺的MRLs 分別為5 mg/kg、0.3 mg/kg 和0.6 mg/kg.目前報道的蔬菜中氯蟲苯甲酰胺、多菌靈和甲基硫菌靈殘留分析方法有分光光度法[7-9]、液相色譜法[10-14]、液質聯(lián)用法[15-18]和酶免疫測定法[19-22]等.分光光度法雖然儀器成本低、操作簡單,但易受樣品基質干擾且檢測靈敏度較低；氣相色譜法需經(jīng)過復雜的化學衍生化過程[23-24]；而酶免疫測定法存在著因樣品基質干擾造成假陽性檢測結果概率較高的問題.液相色譜法適宜于樣品中分子量大、極性范圍寬、高沸點及易熱分解的農藥殘留分析.另外,在儀器成本和對操作人員技術要求方面又較色譜質譜聯(lián)用技術具有優(yōu)勢,是農產品農藥殘留分析的常用儀器平臺.

當前農業(yè)生產實踐中,菜農在病蟲害防控藥劑品種選擇、用藥次數(shù)和施藥劑量等方面的不規(guī)范和不合理現(xiàn)象仍較普遍.另外,因菜農對安全間隔期的重視不夠,對一些生長周期內多次采摘的蔬菜,違反安全間隔期采摘、銷售的現(xiàn)象也很普遍.因此,因農藥的不科學和不合理使用帶來的農產品農藥殘留安全風險不容忽視.本研究在已報道的相關分析方法基礎上,擬建立當前蔬菜生產廣泛使用的殺蟲劑（氯蟲苯甲酰胺）和殺菌劑（甲基硫菌靈、多菌靈）在有廣泛代表性的瓜菜（黃瓜）、果菜（西紅柿）和葉菜（生菜）三種典型即食性蔬菜樣品中殘留的QuEChERS 簡易樣品前處理程序和符合農藥殘留分析要求的UPLC-PDA 分析方法,以期為農藥殘留檢測和監(jiān)測提供技術支持.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1 000 mg/L氯蟲苯甲酰胺標準溶液,天津阿爾塔科技有限公司；1 000 mg/L多菌靈標準溶液和1 000 mg/L甲基硫菌靈標準溶液,國家標準物質研究中心；HPLC 級乙腈,美國Mreda 公司；分析級氯化鈉、無水硫酸鎂和乙腈等,國藥集團化學試劑有限公司；PSA、C18、GCB 和NANO,天津博納艾杰爾科技有限公司.

UPLC-PDA 系統(tǒng)（配置真空脫氣機、自動進樣器、二元泵、柱溫箱和PDA 檢測器、Empower 3 數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)）,美國Waters 公司；VORTEX3 渦旋混合儀,德國IKA 公司；TDL-5000B 型大容量冷凍離心機,上海安亭科學儀器廠；GTR16-2 型高速冷凍離心機,北京時代北利離心機有限公司；HGBTWTS3型均質儀,美國Waring 公司；YP5002 電子天平,上海佑科儀器儀表有限公司.

試驗樣品源自實驗田培育生菜、黃瓜和西紅柿,兩年內以上三種農藥歷史,樣品經(jīng)均質化后用塑封袋密封裝.

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜分析條件優(yōu)化以ACQUITY UPLCRBEH C18色譜柱（2.1×100 mm,1.7 μm）為分離分析柱,設置30 ℃柱溫,以乙腈和水為色譜分析流動相,柱流速0.3 mL/min.在此基礎上,通過使用不同體積比的色譜流動相考察樣品基質中三種目標分析物的出峰情況,同時兼顧樣品分析時長,確定目標分析物與樣品基質獲得良好分離的色譜流動相；通過對三種目標分析物紫外全掃描（210 nm~400 nm）,兼顧檢測靈敏度和樣品基質干擾情況,確定最佳的PDA 檢測波長,以不同體積的三種目標分析物進樣分析,考察目標分析物峰形,結合儀器檢測靈敏度和最低定量校準水平,確定最佳進樣體積.最終獲得目標分析物出峰時間適中、峰形良好、無樣品基質干擾和靈敏度高的色譜分析條件.

1.2.2 分析樣品制備稱取10±0.1 g 均質化的黃瓜、西紅柿和生菜空白樣品放入50 mL 離心管,在樣品管中加入10 mL 樣品提取液（含0.1%乙酸的乙腈溶液）和2 g 氯化鈉,渦旋提取3 min,再在30 ℃水浴中超聲提取5 min；4 500 r/min 離心5 min,轉移1 mL 上清液至2 mL 凈化管（預裝100 mg 無水硫酸鎂、25 mg PSA、25 mg C18 和25 mg NANO）,渦旋1 min；10 000 r/min 離心5min.上清液通過0.22 μm 針頭過濾器轉移至進樣小瓶,待色譜分析.

1.2.3 分析方法性能驗證用三種蔬菜的乙腈提取液稀釋氯蟲苯甲酰胺、甲基硫菌靈和多菌靈標準溶液,配制系列質量濃度的基質標準工作溶液,在優(yōu)化色譜條件下進樣分析,以質量濃度為橫坐標、對應的色譜響應值為縱坐標建立基質標準曲線,求得線性回歸方程和相關系數(shù)；再分別以10 倍信噪比測定并計算定量檢測限（LOQ）.

將1 mL 適宜質量濃度的三種目標分析物的混合標準溶液分別添加至盛裝10±0.5 g 均質化的黃瓜、西紅柿和生菜空白樣品的50 mL 離心管,渦旋混勻3 min 后靜置30 min,得添加水平分別為1 mg/kg、0.5 mg/kg 和0.1 mg/kg 的標樣添加樣品,空白對照樣品不加混合標樣而添加1 mL 乙腈；然后按1.2.2 所述的分析樣品制備程序進行樣品制備,采用1.2.1 確定的色譜分析條件進行樣品分析.根據(jù)建立的基質標準曲線進行外標法定量較準,根據(jù)分析結果計算回收率及各添加水平5 個平行樣品間的相對標準偏差（RSD）.

2 結果與分析

2.1 色譜分析條件

用UPLC-PDA 對三種目標分析物進行紫外全掃描得到相應的紫外吸收光譜（見圖1）.在色譜流動相優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn),以乙腈（B）和水（A）為梯度洗脫流動相,設置梯度洗脫程序（0~3 min,30%B；7.0 min,65%B；8.0 min,95%B；10.0 min,95%B；10.1 min,30%B；15.0 min,30%B）,在35 ℃柱溫、0.3 mL/min 流動相流速、3 μL 進樣體積和254 nm 紫外檢測波長下可獲得三種蔬菜中三種目標分析物穩(wěn)定良好的分離效果.

圖1 三種目標分析物的紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectras of the three target analytes

圖2 為三種目標分析物的典型色譜圖,圖3~5 分別為生菜、西紅柿和黃瓜空白樣品及標樣添加樣品色譜圖.

圖2 三種目標分析物的典型色譜圖Fig.2 Typical chromatograms of three target analytes

圖3 生菜空白樣品和標樣添加樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of lettuce blank samples and spiked samples

圖4 西紅柿空白樣品色譜圖和標樣添加樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of tomato blank samples and spiked samples

圖5 黃瓜空白樣品色譜圖和標樣添加樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of cucumber blank samples and spiked samples

2.2 分析方法的線性檢測范圍

在優(yōu)化的UPLC-PDA 色譜條件下,對0.01 mg/L~5 mg/L 系列質量濃度的氯蟲苯甲酰胺、甲基硫菌靈和多菌靈的基質標準溶液進行分析, 發(fā)現(xiàn)三種目標分析物的不同質量濃度與對應的色譜響應值均有良好線性響應.多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲苯甲酰胺的定量校準曲線方程分別為y=22 125x-608.4（R2=0.999 5）、y=25 994x-575.36（R2=1）和y=17 254x-55.564（R2=1）.

2.3 方法的準確度和精密度

用回收率和不同添加水平多次平行樣品間的標準偏差衡量分析方法的準確度和精密度.表1 至表3 為黃瓜、西紅柿和生菜空白樣品中多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲苯甲酰胺的回收率試驗結果.表1~3 顯示,三種蔬菜樣品中的多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲苯甲酰胺平均回收率為76%~115%,RSD 為1%~9%.通過在黃瓜、西紅柿和生菜空白樣品提取液中添加適當質量濃度的多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲苯甲酰胺標準溶液,測得黃瓜樣品中多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲苯甲酰胺中的LOQ 分別為0.017 mg/kg、0.034 mg/kg和0.032 mg/kg；西紅柿中LOQ 分別為0.026 mg/kg、0.041 mg/kg 和0.012 mg/kg；生菜中LOQ 分別為0.038 mg/kg、0.043 mg/kg 和0.035 mg/kg.

表1 多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲苯甲酰胺在黃瓜中不同添加水平的回收率Tab.1 Recoveries of chorantraniliprole,thiophanate-methyl and carbendazim at the different spiked levels in cucumber（n=5）

表2 多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲苯甲酰胺在西紅柿中不同添加水平的回收率Tab.2 Recoveries of chorantraniliprole,thiophanate-methyl and carbendazim at the different spiked levels in tomato（n=5）

表3 多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲苯甲酰胺在生菜中不同添加水平的回收率Tab.3 Recoveries of chorantraniliprole,thiophanate-methyl and carbendazim at the different spiked levels in lettuce（n=5）

從表1~3 中的回收率數(shù)據(jù)看,所開發(fā)的分析方法的準確度和精密度符合農藥多殘留分析要求,方法檢測限能滿足GB 2763-2021 中三種蔬菜中三種農藥殘留MRLs 標準[6].

3 結論與討論

本研究在色譜分析方法建立環(huán)節(jié)分別嘗試用不同體積比的乙腈和水為流動相,考察目標分析物和樣品基質的分離情況,發(fā)現(xiàn)以乙腈和水作流動相按設定程序梯度洗脫能保證多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲苯甲酰胺合適的色譜保留時間,且峰形端正、對稱性好、無樣品基質干擾.此外,為避免實驗室溫度變化對目標分析物色譜保留時間及分離效果的影響,設定35 ℃的色譜柱溫.另外,分別測試了2 μL、3 μL 和5 μL三種進樣體積下的色譜出峰效果,發(fā)現(xiàn)進樣量為5 μL 時多菌靈和甲基硫菌靈峰型較寬且有明顯拖尾現(xiàn)象,考慮到2 μL 的進樣量可能影響樣品中目標分析物的檢測靈敏度,因此,以3 μL 的進樣體積為優(yōu)化進樣量.在紫外檢測波長選擇方面,兼顧流動相紫外吸收截止波長和檢測靈敏度,選擇254 nm 為檢測波長.

在農藥殘留分析樣品制備程序中,C18 主要用于去除脂類疏水性雜質,GCB 主要用于去除色素類物質,PSA 主要用于去除脂肪酸等物質[25].NANO 作為一種新型碳納米凈化材料,其表面的去活處理,有效降低了對藥物分子的吸附性,而其作為傳統(tǒng)碳納米管的官能團修飾產物,又大大增加了對色素、脂肪酸等干擾物的吸附活性,相較于常規(guī)SPE 材料,NANO 去除樣品色素能力更強,目標分析物的回收率更理想,可廣泛用于農產品中農藥多殘留檢測[26].在分析樣品制備環(huán)節(jié)時,考慮到有機酸、葉綠素、脂質和糖類等多種樣品共提物可能對目標分析物定量分析造成干擾以及增加分析儀器維護頻率,從三種目標分析物在三種蔬菜空白樣品中2 mg/kg 的添加水平,考察了QuEChERS 常用C18、NANO、GCB 和PSA 等分散凈化材料的不同質量組合對樣品共提基質的凈化效果,發(fā)現(xiàn)適量的C18、PSA 和NANO 對三種目標分析物均無明顯吸附,且能達到理想凈化效果,而傳統(tǒng)的GCB 對目標分析物回收率均有一定影響,故在選用凈化劑時,在綜合考慮樣品凈化效果和目標分析物提取效率情況下,以50 mg PSA、25 mg C18 和25 mg NANO 作為基質分散凈化材料處理樣品提取液.

本研究所建立的即食性蔬菜中氯蟲苯甲酰胺、甲基硫菌靈和多菌靈殘留的QuEChER 前處理程序與常規(guī)樣品前處理方法相比大幅度降低了有機溶劑消耗,與傳統(tǒng)震蕩提取法相比顯著提高了分析樣品制備效率.同時,在UPLC-PDA 分析過程中,采用基質匹配標準曲線定量校準,有效降低了樣品基質對殘留檢測結果的影響.本研究所開發(fā)的殘留分析方法不僅可為三種即食性蔬菜中三種目標農藥的殘留檢測和監(jiān)測提供技術支持,還有廣泛的應用空間.