彭文怡，張明媚，易湘龍

1 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，烏魯木齊 830000；2 省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，可分為增殖期DR（Proliferative DR，PDR）和非增殖期DR（non-proliferative DR，NPDR）。糖尿病性黃斑水腫（diabetic macular edema，DME）指由于糖尿病引起的黃斑中心凹一個(gè)視盤直徑范圍內(nèi)的細(xì)胞外液積聚所致的視網(wǎng)膜增厚或硬性滲出沉積。黃斑水腫是DR 患者視力喪失的主要原因，在糖尿病患者中的發(fā)病率為6.8%～14.0%，且呈逐漸升高趨勢(shì)［1］。DR 是一種由炎癥介質(zhì)參與的慢性低度免疫炎癥性疾病。研究［2］發(fā)現(xiàn)，相比于健康體檢者，NPDR 患者房水或玻璃體中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）等炎癥介質(zhì)水平均升高。炎癥介質(zhì)是否參與了NPDR 黃斑水腫的發(fā)生發(fā)展，目前相關(guān)研究較少。我們觀察了有黃斑水腫的NPDR 患者房水及外周血中炎癥介質(zhì)水平變化，并進(jìn)一步分析其相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2021年10月至2022年8月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科就診的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者75 例，均根據(jù)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)和糖代謝狀態(tài)分類標(biāo)準(zhǔn)［3］明確診斷為糖尿病。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他眼部疾病，如PDR、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、黃斑變性、青光眼和葡萄膜炎等；患有肝功能不全、腎損傷、惡性腫瘤、精神疾病及自身免疫性疾病等；實(shí)驗(yàn)前6個(gè)月內(nèi)，接受眼底激光光凝治療；實(shí)驗(yàn)前12 個(gè)月內(nèi)，接受玻璃體內(nèi)抗VEGF及類固醇類藥物治療；進(jìn)行過其他任何類型的眼內(nèi)手術(shù)或眼部治療以及全身抗VEGF 和類固醇類藥物治療。75 例患者根據(jù)2002 年由美國(guó)眼科協(xié)會(huì)和國(guó)際眼病學(xué)會(huì)發(fā)布的《糖尿病視網(wǎng)膜病變的國(guó)際臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》和糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙谥委熝芯浚╰he Early Treatment Diabetic Retinopathy Study，ETDRS）［4］分為無視網(wǎng)膜病變者（NDR 組，確診為T2DM、無DR）25 例、無黃斑水腫者（NDME 組，確診為T2DM 和NPDR、無DME）20 例、黃斑水腫者（DME組，確診為T2DM、NPDR 和DME）30 例，NDR、NDME和DME 組患者使用胰島素比例分別為44%、80%和80%，DME 和NDME 組使用胰島素比例明顯高于NDR 組（P均＜0.05）。各組在年齡、性別、BMI、糖尿病病程、血糖以及NPDR 嚴(yán)重程度分級(jí)方面具有可比性（P均＞0.05）。所有患者在標(biāo)本采集之前簽署知情同意書。該研究得到新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（審批號(hào)：220120-06），嚴(yán)格按照批準(zhǔn)的方案執(zhí)行，并符合《赫爾辛基宣言》的倫理原則。

1.2 各組患者房水、血清炎癥介質(zhì)檢測(cè)

1.2.1 房水、血清樣本采集 ①房水標(biāo)本制備 在患者進(jìn)行玻璃體腔藥物注射或白內(nèi)障手術(shù)做眼球切口前，以1.0 mL 無菌空針于角膜緣后0.5 mm 平行于虹膜穿刺入前房抽取0.10～0.15 mL 房水，裝入已消毒的EP 管中，-80 ℃冰箱密封保存待測(cè)。所有手術(shù)操作均由同一名醫(yī)師完成。②血清標(biāo)本制備采集患者晨起空腹外周靜脈血5 mL，玻璃試管中室溫靜置30 min；常溫離心10 min （3 000 rpm/min），吸取上層血清放于離心管內(nèi)；常溫下再次離心5 min （400 rpm/min），吸取上層血清-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆??；颊邷y(cè)定的血清指標(biāo)均來自同一份血清標(biāo)本。

1.2.2 房水、血清炎癥介質(zhì)檢測(cè) 通過基于流式細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)的多重蛋白定量檢測(cè)試劑盒（美國(guó)，Biolegend，740808）檢測(cè)各組患者房水、血清中13種與眼內(nèi)或全身炎癥性疾病有關(guān)的炎癥介質(zhì)［2，5］IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-18、IL-23、IL-33、MCP-1、IFN-γ、IFN-α2 和TNF-α。具體操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。所有指標(biāo)均重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料在分析之前均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用-x±s表示，各組比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 線性相關(guān)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)/四分位數(shù)間距表示，各組比較采用Kruskal-Wallis 和非參數(shù)Mann-Whitney 檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者房水炎癥介質(zhì)水平比較 各組患者房水中IL-1β、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-18、IL-23、IL-33、IFN-γ、IFN-α2 和TNF-α 水平大多數(shù)低于檢測(cè)值。NDR 組、NDME 組和DME 組患者房水IL-6 水平分別為114.06［6.43，221.69］、61.17［13.41，203.41］、113.02［38.06，817.96］pg/mL。NDR 組、NDME 組和DME 組患者房水MCP-1 水平分別為1 684.58［1 163.65，4 403.20］、2 003.36［1 287.48，3 520.41］、3 296.59［1 914.98，4 677.00］pg/mL，有逐漸升高趨勢(shì)。NDR 組、NDME組和DME組患者房水炎癥介質(zhì)水平比較，P均＞0.05。

2.2 各組患者血清炎癥介質(zhì)水平比較 結(jié)果見表1。

表1 各組患者血清炎癥介質(zhì)水平比較（pg/mL）

2.3 DME 患者房水及血清中MCP-1、IL-6 相關(guān)性 DME 患者房水MCP-1 和血清MCP-1、房水IL-6與血清IL-6 水平均無相關(guān)性（r分別為0.150、-0.358，P均＞0.05）。

3 討論

黃斑水腫是臨床上常見的糖尿病眼部并發(fā)癥，在病程超過20 年的糖尿病患者中約有28%合并黃斑水腫，如果不盡早進(jìn)行合理治療，約50%有黃斑水腫的NPDR 患者在2 年內(nèi)喪失2 行或以上視力，是糖尿病患者致盲的主要原因［6］。有黃斑水腫的NPDR 患者房水或玻璃體炎癥介質(zhì)水平的升高表明該疾病與慢性低度免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)［2］，而眼內(nèi)液標(biāo)本的采集和檢測(cè)比較復(fù)雜。因此，在疾病的早期階段尋找血清中潛在的致病因子對(duì)DME 患者的監(jiān)測(cè)、診斷和治療至關(guān)重要?；谘鍢?biāo)本采集和檢測(cè)的相對(duì)便利性，本研究探討了有黃斑水腫的NPDR 患者房水和血清炎癥介質(zhì)表達(dá)水平及其相關(guān)性，結(jié)果顯示，有黃斑水腫的NPDR 患者房水MCP-1 水平呈升高趨勢(shì)，血清IFN-γ 和IL-23 水平升高，有黃斑水腫的NPDR 患者房水與血清中MCP-1、IL-6 水平?jīng)]有相關(guān)性，提示局部和全身有不同的炎癥介質(zhì)在早期階段已經(jīng)參與DME 的發(fā)生發(fā)展。有黃斑水腫的NPDR 患者房水或玻璃體炎癥介質(zhì)水平可能發(fā)生變化，本研究進(jìn)一步明確了有黃斑水腫的NPDR 患者房水MCP-1 水平已經(jīng)高于NDR 組和NDME 組。研究［7］發(fā)現(xiàn)，抗VEGF 治療有效的DME 患者，房水基線MCP-1 水平低于抗VEGF 治療無效的患者，提示可參考房水炎癥介質(zhì)水平盡早采取治療措施。

IFN-γ 是Th1 型細(xì)胞因子反應(yīng)的經(jīng)典組成部分，主要來源于T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，可激活M1型巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和B 細(xì)胞分泌炎癥因子。TSI 等［8］發(fā)現(xiàn)，DR 患者玻璃體液中IFN-γ 呈現(xiàn)高表達(dá)，而DR 和有黃斑水腫的NPDR 患者血清IFN-γ 表達(dá)情況尚未見報(bào)道。有學(xué)者認(rèn)為，在DR 不同階段IFN-γ 表達(dá)水平不同，DR 早期血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管基底膜受損，IFN-γ 水平升高，通過促進(jìn)NO 產(chǎn)生而誘導(dǎo)免疫抑制；當(dāng)DR 處于增殖期時(shí)機(jī)體的免疫力下降，免疫抑制作用減弱致使IFN-γ 對(duì)VEGF 等因子的拮抗作用失衡［9］，本研究證實(shí)，NPDR 患者患者血清IFN-γ 高表達(dá)，高于NDR 組。IL-23 作為IL-12家族的新成員，來源于活化的單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，在自身免疫性疾病、腫瘤以及眼部新生血管疾病中具有重要作用［10］。IL-23 負(fù)責(zé)Th17 細(xì)胞的存活和擴(kuò)增，經(jīng)過炎癥因子初步誘導(dǎo)后，在Th17細(xì)胞分化晚期發(fā)揮作用。相關(guān)研究表明PDR 患者血清IL-17 水平顯著升高［11］，但尚未報(bào)道DME 患者血清IL-23 高表達(dá)，且高于沒有黃斑水腫的NPDR患者，同時(shí)，IL-23 表達(dá)水平升高要早于IL-17。因此，血清IFN-γ 和IL-23 可能成為早期階段糖尿病眼病的監(jiān)測(cè)、診斷和治療指標(biāo)，關(guān)于它們?cè)贒ME 發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制，有待于進(jìn)一步深入研究。IL-8 是一種有效的化學(xué)誘導(dǎo)劑，通過激活中性粒細(xì)胞和T 細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)及新生血管形成。相關(guān)研究表明，IL-8 與胰島素抵抗和代謝疾病有關(guān)，在T2DM 患者血清中呈現(xiàn)高表達(dá)，它的升高通常標(biāo)志著更加嚴(yán)重的炎癥狀態(tài)以及較差的代謝控制情況［12］。目前，關(guān)于DME 和DR 患者血清IL-8 水平的報(bào)道較少，本研究結(jié)果顯示，NPDR 及有黃斑水腫的NPDR 患者患者血清IL-8 水平高于NDR 組。IL-33 可由胰島間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在糖尿病發(fā)生早期，胰島細(xì)胞被破壞導(dǎo)致IL-33 表達(dá)增加，促進(jìn)Th2型抗炎細(xì)胞因子分泌，通過免疫反應(yīng)應(yīng)對(duì)細(xì)胞損傷，隨后Th1/Th2 平衡偏移誘導(dǎo)Th1 型促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加，加重了糖尿病嚴(yán)重程度［13］。IL-33 與眼部疾病關(guān)系的研究主要集中于Behcet’s 病［5］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DME 組和NDME 組患者血清IL-33 水平低于NDR，可能與其在糖尿病早期階段發(fā)揮作用有關(guān)，因此持續(xù)高水平的IL-33 可能對(duì)糖尿病眼病發(fā)生具有抑制作用。

患者房水和血清MCP-1、IL-6 水平之間沒有相關(guān)性，DME 組患者房水MCP-1 和IL-6 濃度升高，而在血清中并未見到類似現(xiàn)象，說明房水MCP-1 和IL-6 水平升高不是通過破壞的血-視網(wǎng)膜屏障從血漿滲漏而來，而是由眼局部產(chǎn)生。另有研究發(fā)現(xiàn)，DR 患者眼內(nèi)液中MCP-1 和IL-6 水平高于血清［14］。以上研究結(jié)果均說明MCP-1 和IL-6 是由局部視網(wǎng)膜生成的。因此，NPDR 患者黃斑水腫發(fā)生涉及不同的房水和血清炎癥介質(zhì)，它們?cè)诰植亢腿韺?duì)DME 的形成發(fā)揮不同作用，血清炎癥介質(zhì)水平升高可能會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞瘀滯和血細(xì)胞滲出，將單核細(xì)胞募集到視網(wǎng)膜和血管外空間，進(jìn)而引起眼內(nèi)炎癥介質(zhì)水平升高，破壞血-視網(wǎng)膜屏障并導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫和黃斑功能障礙［15］。在疾病發(fā)展的早期階段可以通過改善患者全身炎癥狀態(tài)，改善NPDR 患者黃斑水腫。

綜上所述，有黃斑水腫的NPDR 患者房水MCP-1 水平呈升高趨勢(shì)，血清IFN-γ 和IL-23 水平顯著升高。有黃斑水腫的NPDR 患者房水及血清中炎癥介質(zhì)水平變化提示局部和全身不同的炎癥介質(zhì)在不同階段已經(jīng)參與NPDR 患者黃斑水腫的發(fā)生發(fā)展。但外周血炎癥介質(zhì)水平容易受到多種因素影響，且本研究尚未探討炎癥介質(zhì)在NPDR 黃斑水腫發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制，今后尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。