黃景濤，孫龍飛，鄭競(jìng)雄，米良，梁宗英

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，河北承德 067000

肺癌是全球范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤［1］。肺腺癌是肺癌的重要病理類(lèi)型之一，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)，且預(yù)后差［2］。組蛋白乙?；揎検腔蜣D(zhuǎn)錄的重要調(diào)控方式，該調(diào)節(jié)影響核小體的動(dòng)態(tài)過(guò)程，異常調(diào)控的乙?；桶┌Y的發(fā)展有關(guān)。賴(lài)氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶5［K（lysine） acetyltransferase，KAT5］屬于組蛋白乙?；窶YST家族，通過(guò)調(diào)節(jié)底物的穩(wěn)定性及活性參與組蛋白的乙?；揎棧瑓⑴c多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［3］。癌組織中高表達(dá)的KAT5 可進(jìn)一步促進(jìn)c-myc 表達(dá)，發(fā)揮促癌作用［4］。鼠雙微體2 （murine double minute 2， MDM2）是一個(gè)能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的癌基因，可以與P53結(jié)合，調(diào)節(jié)MDM2-P53 負(fù)反饋環(huán)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖凋亡相關(guān)信號(hào)通路［5］。最新研究［6］發(fā)現(xiàn)，KAT5 存在與MDM2特異性結(jié)合的泛素化結(jié)合位點(diǎn)，KAT5 受泛素—蛋白酶體途徑的調(diào)節(jié)，MDM2 可以蛋白酶體依賴(lài)的方式誘導(dǎo)KAT5 的降解。目前探討KAT5、MDM2 在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用相關(guān)研究較少，鑒于既往研究中KAT5、MDM2 的腫瘤促進(jìn)作用。2022 年10 月—2023 年5 月，我們觀察了肺腺癌組織中KAT5、MDM2的表達(dá)變化，探討其臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020 年9 月—2022 年3 月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科診治的，做過(guò)手術(shù)切除且經(jīng)過(guò)病理學(xué)診斷后確診肺腺癌患者60 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)前均未接受過(guò)任何放化療及免疫治療。②臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有嚴(yán)重感染、嚴(yán)重肝功能異常或嚴(yán)重腎功能異常者；②合并其他惡性腫瘤的患者或有其他惡性腫瘤史者；③腫瘤切除術(shù)后，術(shù)后輔助治療開(kāi)始前出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)進(jìn)展、死亡患者。60 例患者中男23 例、女37 例；≥60 歲38 例，＜60歲22 例；吸煙21 例，不吸煙39 例；按IASLC 第八版制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM 分期為Ⅰ期23 例，Ⅱ期24 例，Ⅲ期13 例；組織學(xué)分級(jí)為高分化8例，中分化41例，低分化11 例；出現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。60例患者均行腫瘤切除術(shù)，術(shù)中留取癌組織、癌旁肺組織（距癌組織邊緣＞6 cm，病理證實(shí)無(wú)癌組織）。本研究已經(jīng)得到承德醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 MDM2和KAT5抗體購(gòu)自于河北石家莊健菲生物科技有限公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自于廣州德詠信生物科技有限公司；山羊血清、DAB顯色試劑盒購(gòu)自于河北貝博實(shí)驗(yàn)用品有限公司。Alexa Fluor 488-conjugated 羊抗兔熒光抗體、ATTO 594-conjugated 羊抗鼠熒光抗體和抗熒光淬滅封片劑購(gòu)自河北貝博實(shí)驗(yàn)用品有限公司。

1.3 肺腺癌組織及癌旁組織MDM2、KAT5 蛋白檢測(cè)

1.3.1 肺腺癌組織及癌旁組織MDM2、KAT5 蛋白定位檢測(cè) 采用熒光免疫組織化學(xué)法（IF）。組織切片常規(guī)脫蠟水化，PBS 清洗后，抗原修復(fù)暴露抗原表位，5% 山羊血清封閉，甩去多余液體；加一抗（MDM2 1∶300，KAT5 1∶300），4 ℃過(guò)夜，室溫復(fù)溫；PBST 清洗；加熒光二抗（羊抗兔熒光抗體1∶200、羊抗鼠熒光抗體1∶200），孵育1 h，PNST 清洗；DAPI 染色5 min，PBST 清洗3次3 min；滴加抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下根據(jù)熒光的分布位置及強(qiáng)度，確定MDM2、KAT5 蛋白的定位。每張標(biāo)本隨機(jī)取5 個(gè)不重復(fù)高倍視野。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：明場(chǎng)視野下確定組織位置，DAPI 下確定細(xì)胞核，以定位在細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，綠色熒光信號(hào)確定KAT5 蛋白表達(dá)，紅色熒光信號(hào)確定MDM2蛋白表達(dá)。

1.3.2 肺腺癌組織及癌旁組織MDM2、KAT5 蛋白定量檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)（IHC）法。取肺腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本石蠟連續(xù)切片，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DAB 顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間。流水沖洗，蘇木素復(fù)染核，中性樹(shù)脂封片固定。以山羊血清替代一抗做陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性病例做陽(yáng)性對(duì)照。MDM2、KAT5 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，少量表達(dá)于細(xì)胞核，將細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黃色定為陽(yáng)性，每張切片在光學(xué)顯微鏡下連續(xù)觀察10 個(gè)高倍視野。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞染色定位在細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，呈淡黃色、棕褐色顆粒。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比進(jìn)行評(píng)分。首先根據(jù)染色強(qiáng)度打分：無(wú)色計(jì)0分、淡黃色計(jì)1 分、棕黃色計(jì)2 分、棕黑色計(jì)3 分 ，＞1 分的為陽(yáng)性細(xì)胞；再根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞率＜5%計(jì)0 分，5%～25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分； 2 項(xiàng)評(píng)分的乘積進(jìn)行表達(dá)定量分級(jí)：0～3 為陰性表達(dá)，＞3 為陽(yáng)性表達(dá)。測(cè)算肺腺癌組織及癌旁組織MDM2、KAT5細(xì)胞陽(yáng)性率，陽(yáng)性表達(dá)率為該組陽(yáng)性表達(dá)數(shù)占該組總數(shù)的比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布、方差齊時(shí)以-x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman 相關(guān)檢驗(yàn)法分析肺腺癌組織KAT5、MDM2 表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織及癌旁組織KAT5、MDM2 定位情況 癌旁組織KAT5、MDM2 多數(shù)熒光強(qiáng)度不明顯，肺腺癌組織中KAT5 與MDM2 均呈高表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，少量表達(dá)于細(xì)胞核。

2.2 肺腺癌組織及癌旁組織KAT5、MDM2 陽(yáng)性表達(dá)率比較 肺腺癌組織及癌旁組織KAT5 陽(yáng)性表達(dá)率分別為65.00%（39/60）、45.00%（27/60），二者比較，P＜0.05。 肺腺癌組織及癌旁組織；MDM2 陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.33%（47/60）、40.00%（24/60），二者比較，P＜0.05。

2.3 不同臨床病理參數(shù)肺腺癌患者癌組織KAT5、MDM2陽(yáng)性表達(dá)情況比較 不同臨床病理參數(shù)肺腺癌患者陽(yáng)性KAT5、MDM2 陽(yáng)性表達(dá)情況見(jiàn)表1。KAT5 陽(yáng)性表達(dá)與肺腺癌患者的性別、年齡和吸煙與否無(wú)關(guān)（χ2分別為0.280、2.300，0.587；P均＞0.05），與肺腺癌患者TNM 分期、腫瘤分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（χ2分別為14.336、6.507、4.319；P均＜0.05）；MDM2 高表達(dá)與肺腺癌患者TNM 分期、腫瘤分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（χ2分別為11.231、9.133、6.000；P均＜0.05），與肺腺癌患者患者性別、年齡和吸煙與否均無(wú)關(guān)（χ2分別為0.000、1.320、0.131；P均＞0.05）。

表1 不同臨床病理參數(shù)肺腺癌患者癌組織KAT5、MDM2陽(yáng)性表達(dá)情況（例）

2.4 KAT5 與MDM2 在肺腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 Spearman 相關(guān)分析顯示，肺腺癌組織中KAT5蛋白表達(dá)與MDM2 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.632，P＜0.05）。

3 討論

因肺癌發(fā)病隱匿且缺乏有效的早期篩查的分子標(biāo)記物，部分肺癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)處于中晚期，影響患者的總體生存率和預(yù)后［7］。

KAT5 屬于組蛋白乙酰化酶中的一員，在DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡和蛋白乙?；揎椫邪l(fā)揮著重要的作用。KAT5 可以作為乙?；D(zhuǎn)移酶通過(guò)乙?；揎椖[瘤相關(guān)蛋白質(zhì)，使其發(fā)生活性或功能改變，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、信息傳遞及對(duì)環(huán)境因素刺激的應(yīng)答反應(yīng)等［8］。VAN DEN 等［9］報(bào)告發(fā)現(xiàn)，KAT5在順鉑耐藥的人肺癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，KAT5 表達(dá)的下調(diào)使細(xì)胞對(duì)順鉑治療敏感，并發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和H4K5 和H4K8 的大量乙酰化以及H4K12 和H4K16 的乙?；瘻p少有關(guān)。HPATEL 等［10］研究發(fā)現(xiàn)KAT5 在體內(nèi)乙?；疌-MYC 參與C-MYC 激活，并確定KAT5通過(guò)乙?；岣逤-MYC蛋白穩(wěn)定性可能在肺癌的發(fā)生中起促進(jìn)作用。本研究結(jié)果表明，KAT5在肺腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，且KAT5 陽(yáng)性表達(dá)與肺腺癌TNM 分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這提示，KAT5 在肺腺癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起到促進(jìn)作用，可能通過(guò)乙酰化下游相關(guān)蛋白通過(guò)多種途徑參與了肺腺癌的惡性轉(zhuǎn)化。

MDM2 是腫瘤抑制因子p53 的負(fù)調(diào)節(jié)因子，轉(zhuǎn)錄因子p53 通過(guò)參與DNA 修復(fù)、細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞衰老、細(xì)胞死亡、細(xì)胞分化和代謝來(lái)充當(dāng)關(guān)鍵的腫瘤抑制因子［11］。MDM2 基因編碼的E3 泛素連接酶可通過(guò)誘導(dǎo)下調(diào)促凋亡蛋白BAX 和上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 以及抑制一些腫瘤抑制因子（包括p53、PTEN、p14ARF、GKN1和JWA）來(lái)抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生［12］。MDM2基因擴(kuò)增或MDM2蛋白表達(dá)改變是許多腫瘤的特征［13］。MDM2在多種腫瘤中呈高表達(dá)，且高表達(dá)與多種腫瘤的增殖、侵襲和遷移相關(guān)。ENDO 等［14］發(fā)現(xiàn)MDM2 抑制劑nutlin-3 與順鉑或5-氟尿嘧啶聯(lián)合使用時(shí)具有抗腫瘤作用，并引發(fā)協(xié)同細(xì)胞毒性作用。NING 等［15］證實(shí)在肺癌順鉑耐藥性的研究中ZCCHC10 可以減弱MDM2 介導(dǎo)的P53 泛素化降解抑制腫瘤進(jìn)展。本研究結(jié)果表明，MDM2 在肺腺癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)；MDM2 陽(yáng)性表達(dá)與肺腺癌的TNM 分期、腫瘤分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；MDM2 在腫瘤有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中表達(dá)明顯升高，提示其可能促進(jìn)了肺腺癌細(xì)胞自身的增殖、侵襲和遷移能力，進(jìn)而使肺腺癌的惡性程度增強(qiáng)，導(dǎo)致其容易通過(guò)淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移。

MDM2 存在與KAT5 特異性結(jié)合的泛素化結(jié)合位點(diǎn)，可以通過(guò)泛素—蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)KAT5 的降解［8］。DOHMESEN 等［16］研究證實(shí)，MDM2與KAT5存在相互作用，KAT5 可以作為MDM2 介導(dǎo)的DNA損傷的特異性抑制物，但不能阻止MDM2 介導(dǎo)的泛素化。 DENG 等［17］發(fā)現(xiàn)Hp 感染誘導(dǎo)的MDM2 mRNA 的ac4C乙?；?，穩(wěn)定MDM2 mRNA，導(dǎo)致MDM2 上調(diào)和p53 降解，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生，提示MDM2基因存在乙?；稽c(diǎn)。有研究表明乙酰轉(zhuǎn)移酶p300/CBP 相關(guān)因子（PACF）可以調(diào)控MDM2的蛋白水平來(lái)控制P53 蛋白的穩(wěn)定性和活性，在能量缺乏時(shí)，增強(qiáng)了PACF的E3泛素連接酶活性，用于結(jié)合并降解MDM2 蛋白，穩(wěn)定P53誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，KAT5與MDM2在肺腺癌中同時(shí)呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，二者主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。通過(guò)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析KAT5 與MDM2 的相關(guān)性，結(jié)果提示在肺腺癌組織中KAT5 與MDM2 的陽(yáng)性表達(dá)具有相關(guān)性，且呈正相關(guān)性，說(shuō)明二者在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起到相互促進(jìn)作用。進(jìn)一步推測(cè)，二者相互作用的可能的途徑：一是KAT5 通過(guò)介導(dǎo)MDM2 的乙?；瘉?lái)增強(qiáng)表達(dá)，通過(guò)依賴(lài)或非依賴(lài)P53 途徑發(fā)揮促癌作用；二是通過(guò)MDM2 介導(dǎo)KAT5的泛素化過(guò)程，參與腫瘤調(diào)控。KAT5存在與MDM2特異性結(jié)合的泛素化結(jié)合位點(diǎn)，二者同時(shí)高表達(dá)于肺腺癌組織，可能二者存在特異性調(diào)節(jié)失常并導(dǎo)致KAT5 無(wú)法被MDM2 正常泛素化降解，使KAT5 蛋白表達(dá)水平上升導(dǎo)致乙?；Ш猓M(jìn)而參與肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，肺癌組織中KAT5 與MDM2 呈高表達(dá)。KAT5 與MDM2 陽(yáng)性表達(dá)與肺腺癌患者的TNM分期、腫瘤分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，二者可能協(xié)同促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。但KAT5 與MDM2 在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體分子生物學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究，以便為肺腺癌的基因靶向治療提供新的理論依據(jù)。