李萍，張?jiān)聲?，符皓，時(shí)軍利，李炳慶

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河北承德 067000；2 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科

結(jié)腸癌是全球范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。手術(shù)、手術(shù)聯(lián)合放化療治療結(jié)腸癌的效果不佳，治療后結(jié)腸癌患者的中位生存率仍然較低［1］。結(jié)腸癌的發(fā)病是一個(gè)包括癌癥相關(guān)基因或分子的變化等因素在內(nèi)的多因素、多步驟的過程。尋找有效的結(jié)腸癌分子治療基因靶點(diǎn)仍然是一個(gè)目前結(jié)腸癌研究的焦點(diǎn)［2］。微小RNA（microRNA， miRNA）可通過直接介導(dǎo)其靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、周期進(jìn)展和腫瘤轉(zhuǎn)移等癌細(xì)胞生物學(xué)過程，可能是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控靶點(diǎn)之一［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)，miR-144 在惡性腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)異常，可作為腫瘤抑制因子或癌基因，參與調(diào)控癌細(xì)胞的生物學(xué)表型。目前，miR-144 在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及具體機(jī)制尚不完全清楚。同源盒基因 A10（homeobox gene A10，HOXA10）是同源盒基因家族成員之一，HOXA10 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高且與患者的不良預(yù)后、5-FU 耐藥性有關(guān)［5-7］。miR-144 是否通過調(diào)控HOXA10 表達(dá)，調(diào)控結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，目前相關(guān)研究報(bào)道較少。為此，我們觀察了miR-144 對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖、侵襲及遷移的影響及結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-144 與HOXA10 的結(jié)合力，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、SW480、CL-11和永生化正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞株FHC 均購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司，置于含10%胎牛血清、100 μ/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中。RNA 抽取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR 熒光定量試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；陰性對(duì)照物NC-mimics、miR-144模擬物miR-144 mimics、過表達(dá)HOXA10質(zhì)粒載體（pcDNA3.1-HOXA10）、野生型及突變型HOXA10 熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒HOXA10-WT、HOXA10-MUT 購(gòu)自上海吉瑪制藥公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；Lipofectamine 2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；熒光素酶檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司，Transwell 小室購(gòu)自購(gòu)自美國(guó)Corning公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD 公司；一抗HOXA10 和GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；二抗IgG 購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司。

1.2 人結(jié)腸癌細(xì)胞株及FHC 細(xì)胞miR-144、HOXA10 mRNA檢測(cè) 采用qRT-PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116、SW480、CL-11 及FHC 細(xì)胞，使用RNA抽取試劑提取細(xì)胞總RNA，取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA 后，加入引物，按照qRT-PCR 熒光定量試劑盒說明書配置反應(yīng)體系后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。miR-144 引物序列：上游引物5′-GGGAGATCAGAAGGTGATT-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物序列：上游引物5′-CTGGCTTCGGCAGCACA- 3 ′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；HOXA10 引物序列：上游引物5′-TCACGGCAAAGAGTGGTC- 3 ′，下游引物5′-AGTTTCATC CTGCGGTTCTG-3′；GAPDH 引物序列：上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物5′-GA AGATGGTGATGGGATTTC-3′。以2-△△Ct代表miR-144 和HOXA10 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。觀察人結(jié)腸癌細(xì)胞和人結(jié)腸上皮細(xì)胞miR-144、HOXA10 mRNA 表達(dá)變化，選擇miR-144 表達(dá)量最低的結(jié)腸癌細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 miR-144 對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖、侵襲及遷移的影響觀察

1.3.1 HCT116 細(xì)胞分組及miR-144 mimics、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116 細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，等待細(xì)胞融合度70%～80%時(shí)，將細(xì)胞分為3 組：3 組、2 組、1 組用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 說明書分別轉(zhuǎn)染NC-mimics、miR-144 mimics、miR-144 mimics + pcDNA3.1-HOXA10（上調(diào)HCT116 細(xì)胞HOXA10 表達(dá)，逆轉(zhuǎn)miR-144 對(duì)靶基因HOXA10表達(dá)的抑制作用），轉(zhuǎn)染24 h時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 各組細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK-8法，轉(zhuǎn)染24 h時(shí)取各組細(xì)胞，接種于96孔板，細(xì)胞密度：1×103/孔，每組4 個(gè)復(fù)孔，分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h 時(shí)每孔加入10 μL的 CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，在酶標(biāo)儀下測(cè)算450 nm 處的光密度OD 值。以O(shè)D 值代表各組細(xì)胞的增殖活力，重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.3.3 各組細(xì)胞侵襲、遷移情況觀察 采用Transwell 侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染24 h 時(shí)取各組細(xì)胞，侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)首先用無血清培養(yǎng)液稀釋的Matrigel 膠均勻涂抹至Transwell 小室上室的濾膜面，再在Transwell 小室上室內(nèi)加入無血清培養(yǎng)液重懸的200 μL HCT116 單細(xì)胞懸液，下室加入600 μL 含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除Transwell小室上室濾膜面未能穿過濾膜的細(xì)胞，固定、染色。在高倍倒置顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，Transwell 小室上室的濾膜面不涂抹Matrigel 膠，其余操作同侵襲實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.3.4 各組細(xì)胞miR-144 及HOXA10 蛋白檢測(cè) 轉(zhuǎn)染24 h 時(shí)取各組細(xì)胞，采用qRT-PCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞miR-144，所有操作均同“1.2”。轉(zhuǎn)染24 h時(shí)采用Western Blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞HOXA10蛋白。收集細(xì)胞并提取總蛋白，取40 μg 蛋白樣品制備電泳凝膠，電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶封閉，分別加入一抗HOXA10（1：1 000）和GAPDH（1：1 000），4 ℃孵育過夜，洗膜3 遍后，加入二抗（1：1 000），室溫孵育1 h 后，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影。采用Image J 軟件測(cè)定目的蛋白的條帶灰度值，以目的蛋白的條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH 灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.4 HCT116 細(xì)胞中miR-144 及HOXA10 蛋白的靶向關(guān)系驗(yàn)證 采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116 細(xì)胞，待細(xì)胞融合度70%～80%時(shí)將細(xì)胞分為4 組：A 組先后加入HOXA10-WT、miR-144 mimics 轉(zhuǎn)染，B 組先后加入HOXA10-WT 、NC-mimics 轉(zhuǎn)染，C 組先后加入HOXA10-MUT、miR-144 mimics 轉(zhuǎn)染，D 組先后加入HOXA10-MUT 、NC-mimics 轉(zhuǎn)染，所有操作均嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000 說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染24 h 時(shí)后收集細(xì)胞，應(yīng)用熒光素酶檢測(cè)試劑測(cè)算各組細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3 次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以-x± s 表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人結(jié)腸癌細(xì)胞株及FHC 細(xì)胞miR-144、HOXA10 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 HCT116、SW480、CL-11及FHC細(xì)胞中miR-144相對(duì)表達(dá)量分別為0.33 ± 0.09、0.57 ± 0.07、0.46 ± 0.10、1.03 ±0.05，與FHC 比較，HCT116、SW480、CL-11 細(xì)胞miR-144 相對(duì)表達(dá)量低（P均＜0.05）。HCT116、SW480、CL-11 及FHC 細(xì)胞中HOXA10 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.87 ± 0.13、1.58 ± 0.10、1.55 ±0.09、0.99 ± 0.06，與FHC 比較，HCT116、SW480 及CL-11 細(xì)胞HOXA10 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高（P均＜0.05）。

2.2 各組HCT116細(xì)胞OD 值比較 培養(yǎng)0、24、48、72 h時(shí)各組HCT116細(xì)胞OD值比較見表1。

表1 培養(yǎng)不同時(shí)間各組HCT116細(xì)胞OD值比較（±s）

表1 培養(yǎng)不同時(shí)間各組HCT116細(xì)胞OD值比較（±s）

注：與3組比較，＊P＜0.05；與2組比較，＃P＜0.05。

組別1組2組3組OD值培養(yǎng)72 h 2.79 ± 0.20＊＃1.87 ± 0.26＊3.47 ± 0.24培養(yǎng)0 h 0.49 ± 0.05＊＃0.35 ± 0.07＊0.67 ± 0.11培養(yǎng)24 h 0.93 ± 0.13＊＃0.72 ± 0.11＊1.24 ± 0.15培養(yǎng)48 h 1.71 ± 0.21＊＃1.04 ± 0.18＊2.00 ± 0.19

2.3 各組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較 轉(zhuǎn)染24 h 時(shí)各組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較見表2。

表2 各組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)，±s）

表2 各組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)，±s）

注：與3組比較，＊P＜0.05；與2組比較，＃P＜0.05。

組別1組2組3組侵襲細(xì)胞數(shù)49 ± 11＊＃26 ± 10＊68 ± 17遷移細(xì)胞數(shù)52 ± 10＊＃31 ± 12＊73 ± 19

2.4 各組細(xì)胞miR-144 和HOXA10 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 1、2、3 組細(xì)胞miR-144 相對(duì)表達(dá)量分別為3.99 ± 0.24、4.09 ± 0.28、1.01 ± 0.05。與3 組比較，1、2 組細(xì)胞miR-144 相對(duì)表達(dá)量高（P均＜0.05）。3 組、2 組和1 組細(xì)胞HOXA10 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.49 ± 0.10、0.21 ± 0.07、0.92 ± 0.12。與3 組比較，2 組HOXA10 蛋白表相對(duì)表達(dá)量低（P均＜0.05）；與2 組比較，1 組HCT116 細(xì)胞HOXA10 蛋白相對(duì)表達(dá)量高（P＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性比較 A 組、B組、C 組、D 組HCT116 細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性分別為0.54 ± 0.09、1.01 ± 0.04、0.99 ± 0.07、1.03 ±0.05。與B 組比較，A 組HCT116 細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性低（P＜0.05）。

3 討論

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在全球癌癥發(fā)病率和死亡率排名中，結(jié)腸癌分別位居第三和第四位。男性結(jié)腸癌患者多于女性， 結(jié)腸癌通常發(fā)生在直腸和乙狀結(jié)腸的交界處。盡管近年來人們對(duì)癌癥的診斷和治療進(jìn)行了更深入的研究，但由于人們生活方式和飲食的改變，結(jié)腸癌患者的數(shù)量仍在增加，并且雖然近年結(jié)腸癌的治療方法有了一定的進(jìn)步，但結(jié)腸癌患者的中位生存率仍然很低［8］。因此，探索結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)因素，從而有效的預(yù)防治療結(jié)腸癌具有積極的意義。

惡性腫瘤細(xì)胞的無限增殖、凋亡受限以及侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)miRNA 通過直接介導(dǎo)其靶基因的表達(dá)水平，與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生進(jìn)展等各種生物學(xué)過程密切相關(guān)。近年來，由于miRNA 對(duì)關(guān)鍵癌基因和抑癌基因表達(dá)的控制，miRNA 已被證明在癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。因此篩選腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵特異性miRNA 對(duì)腫瘤的特異性靶向治療具有重要的作用。在結(jié)腸癌細(xì)胞和組織中存在很多miRNA 的差異表達(dá)，并且發(fā)揮著促癌基因或抑癌基因的作用。結(jié)腸癌患者血液中miRNA 表達(dá)水平的變化，可能作為特異性的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于結(jié)腸癌的早期篩查及診斷。逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞中異常表達(dá)的miRNA，可能為結(jié)腸癌的治療提供新的思路。CHEN 等［10］通過qRT-PCR 檢測(cè)了164 例結(jié)腸癌患者血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者血清中miR-19-5p 水平顯著降低，與患者臨床分析及預(yù)后有關(guān)，可能作為結(jié)腸癌患者早期診斷和判斷預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。有研究［11］報(bào)道，miR-876-3p能夠抑制結(jié)腸癌的進(jìn)展，并且與患者預(yù)后有關(guān)。ZHU 等［12］報(bào)道m(xù)iR-3653 通過調(diào)控Zeb2抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移及EMT。

miR-144 是一種高度保守的非編碼RNA，是腫瘤相關(guān)miRNA 家族成員之一，其基因定位于人染色體17q11.2 上，最早其被發(fā)現(xiàn)為紅細(xì)胞譜系存活和成熟過程必不可少的基因。MUSHTAQ 等［13］報(bào)道m(xù)iR-144 在胃癌細(xì)胞表達(dá)異常下降，能夠通過下調(diào)激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白4 抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。在肺癌［14］、前列腺癌［15］、乳腺癌［16］、骨肉瘤［17］等多數(shù)惡性腫瘤組織和細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)miR-144 表達(dá)異常降低，發(fā)揮著類似抑癌基因的作用。但在食管癌［18］和鼻咽癌［19］等少部分惡性腫瘤組織和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-144 異常升高，發(fā)揮著癌基因的作用，提示miR-144 具有明顯的異質(zhì)性，在不同的腫瘤中通過不同的分子通路發(fā)揮著不同的作用。至今，miR-144 在結(jié)腸癌發(fā)病中的作用的研究較少，并且具體作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過qRTPCR檢測(cè)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、SW480、CL-11和永生化正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞株FHC中miR-144的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，HCT116、SW480、CL-11 細(xì)胞中miR-144表達(dá)明顯低于FHC，提示miR-144在結(jié)腸癌中可能起著抑癌基因的作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-144在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用，我們選擇miR-144 表達(dá)水平最低的HCT116 細(xì)胞作為后續(xù)研究對(duì)象，上調(diào)HCT116 細(xì)胞中miR-144 的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)HCT116 細(xì)胞的增殖活性、遷移及侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯降低，提示miR-144 能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性、遷移及侵襲能力從而參與其發(fā)生進(jìn)展，起著抑癌基因的作用。

一項(xiàng)肺腺癌研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，miR-144 能夠靶向調(diào)控HOXA10 基因表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因作用。HOXA10 是一種高度保守的基因，屬于同源盒基因家族成員。HOXA10基因與人類多種腫瘤的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)，在多種腫瘤細(xì)胞和組織中表達(dá)異常升高，作為癌基因發(fā)揮作用。HOXA10 通過調(diào)節(jié)TGFB2/Smad/METTL3信號(hào)通路，介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［20］。在食管癌的相關(guān)研究［21］中發(fā)現(xiàn)，HOXA10 通過激活p38/ERK 信號(hào)通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。已有研究報(bào)道結(jié)腸癌組織中HOXA10表達(dá)異常升高［5，22］，但HOXA10在結(jié)腸癌中作用的上下游機(jī)制機(jī)制尚不清楚。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)，miR-144 可以與HOXA10基因的3′UTR區(qū)特異性結(jié)合從而使其熒光素酶活性明顯降低，并且上調(diào)miR-144 的HCT116 中HOXA10蛋白的表達(dá)水平顯著降低，提示miR-144 能夠靶向調(diào)控HOXA10 基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染過表達(dá)HOXA10 質(zhì)粒載體至高表達(dá)miR-144 的HCT116 細(xì)胞后，伴隨著細(xì)胞中HOXA10表達(dá)水平的增高，腫瘤細(xì)胞的增殖活性、遷移和侵襲能力也明顯升高，提示過表達(dá)HOXA10 能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-144 對(duì)HCT116細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲能力的抑制作用，證實(shí)miR-144 在結(jié)腸癌發(fā)生進(jìn)展中的抑制作用，與其對(duì)靶基因HOXA10的靶向調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-144 低表達(dá)、HOXA10 mRNA 高表達(dá)。miR-144 可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。miR-144 可能通過靶向抑制細(xì)胞HOXA10表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)表型。miR-144 可能作為結(jié)腸癌的分子靶向治療靶點(diǎn)，但其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制今后尚有待于進(jìn)一步研究。