施擎宇，黃帆，王冬明

上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，上海 200032

骨肉瘤是骨科常見的惡性腫瘤之一，多發(fā)于股骨、脛骨、骨盆等部位，具有高度異質性［1-2］。目前臨床治療骨肉瘤主要方法有外科手術切除、放射治療、化學藥物治療、靶向分子治療等，但由于化療藥物的不良反應較多且嚴重，手術治療后患者肢體功能表現(xiàn)差異加大，故尋找不良反應低、安全有效的新型治療藥物和治療方法是目前的研究熱點［3-4］。茯苓酸（pachymic acid，PA）是中藥茯苓的主要活性成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗高血糖、抗病毒及鎮(zhèn)靜催眠等多種藥理作用［5］。PA 可抑制胃癌、肝癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤的增殖、遷移。但PA 對骨肉瘤細胞增殖、侵襲及遷移的影響目前尚未有研究報道。在腫瘤細胞快速生長過程中，缺氧、營養(yǎng)物質匱乏等進一步導致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質聚集于內質網中，形成內質網應激，并啟動未折疊蛋白反應（UPR）［6］。蛋白激酶R 樣內質網激酶（PERK）/CCAAT 增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/CHOP）信號通路在內質網應激中發(fā)揮重要作用，可通過上調CHOP、Bcl-2和其他細胞凋亡因子的表達誘導細胞凋亡［7-8］。PA 是否通過調控PERK/CHOP 信號通路影響骨肉瘤細胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡，目前尚未有相關研究報道。為此，我們觀察了PA 對骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人骨肉瘤細胞系MG-63購自中國科學院細胞庫。PA 購自上海晶都生物技術有限公司；PERK 抑制劑GSK2606414 購自湖南華騰制藥有限公司；胎牛血清、高糖DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher 公司；MTT 試劑購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell 小室購自Corning公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自德國Merck 公司；TRIzol 試劑、反轉錄試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Invitrogen 公司；RT-qPCR 試劑盒購自康為世紀生物科技股份有限公司；PERK、p-PERK、真核生物起始因子2α（eIF2α）、p-eIF2α、活化轉錄因子4（ATF4）、CHOP、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、BCL2相關X蛋白（Bax）、GAPDH一抗和相應二抗購自上海艾博抗貿易有限公司。

1.2 PA 受試濃度篩選 取對數(shù)生長期的MG-63細胞接種于96 孔板中（2×104個/孔），分為5 組，每組6個復孔，加入終濃度為0、5、10、20、40、80、160 μmol/L 的PA 處理48 h，每孔加入10 μL 的MTT溶液，孵育4 h，再加入100 μL DMSO溶液，用酶標儀測算各組570 nm 處吸光度值（OD570nm），測算各組細胞增殖活力（%）。結果顯示，與0 μmol/L 比較，40、80、160 μmol/L 的PA 可顯著降低MG-63 細胞的增殖活力（P均＜0.05），且160 μmol/L 的PA 對MG-63 細胞增殖活性的影響與80 μg/mL 的PA 接近。因此，最終選擇20、40、80 μmol/L 的PA 進行后續(xù)實驗。

1.3 MG-63細胞分組及PA 給予方法 取對數(shù)生長期MG-63 細胞，5×103/孔接種于96 孔板中，待細胞貼壁后隨機分為低濃度PA 組（PA-L 組）、中濃度PA組（PA-M 組）、高濃度PA 組（PA-H 組）、高濃度PA +PERK 抑制劑GSK2606414 組（PA-H + GSK2606414組）及對照組，每組6 個復孔。PA-L 組、PA-M 組、PA-H 組分別加入終濃度20、40、80 μmol/L 的PA［9］培養(yǎng)，PA-H + GSK2606414 組加入終濃度40 μmol/L 的PA + 5 μmol/L 的GSK2606414［10］培養(yǎng)，對照組用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 各組細胞增殖情況觀察 采用MTT 法。分別于培養(yǎng)24、48 及72 h 時取各組細胞，每孔加入10 μL 的5 g/L MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清，加入100 μL 的DMSO 溶液，振搖后培養(yǎng)10 min，待底部結晶完全溶解后，采用酶標儀測算570 nm 處的吸光度OD570nm值，以OD570nm代表細胞的增殖能力。實驗重復測算3 次，取平均值。

1.5 各組細胞遷移情況觀察 采用劃痕實驗。培養(yǎng)24 h 時取各組細胞，用無菌20 μL 移液槍槍頭垂直畫出一道劃痕，之后用PBS 洗滌細胞3次，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用倒置顯微鏡觀察0、48 h 時各組細胞的遷移情況，并使用Image J 軟件進行分析測算各組細胞遷移率。細胞遷移率=（0 h寬度-48 h 寬度）/0 h 寬度×100%。實驗重復測算3 次，取平均值。

1.6 各組細胞侵襲情況觀察 采用Transwell 實驗。培養(yǎng)48 h 時取各組細胞，5×104/mL 加入150 μL細胞懸液到Transwell 小室上室（稀釋的Matrigel 基質膠包被）中。利用倒置光學顯微鏡觀察，每個小室隨機選取6個視野進行拍照，并進行侵襲細胞計數(shù)。實驗重復測算3次，取平均值。

1.7 各組細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術。培養(yǎng)48 h時取各組細胞，胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液后離心收集細胞，用PBS 洗滌2 次。加入100 μL 的 1×Binding Buffer 重懸細胞，之后分別加入5 μL 的 Annexin V-FITC 和5 μL PI 于室溫下避光反應20 min。采用流式細胞儀測算各組細胞凋亡率。實驗重復測算3次，取平均值。

1.8 各組細胞PERK mRNA、CHOP mRNA 檢測 采用RT-qPCR 法。培養(yǎng)48 h 時取各組細胞，加入TRIzol 試劑提取細胞總RNA。根據(jù)反轉錄試劑盒說明書，將總RNA 反轉錄為cDNA，并進行PCR 擴增。PCR 擴增反應條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40 次。引物序列設計如下：PREK 上游引物：5’-ACGATGAGACAGAGTTGCGAC-3’，下游引物：5’-ATCCAAGGCAGCAATTCTCCC-3’；CHOP上游引物：5’-CTTGACCCTGCTTCTCTGGCTT-3’，下游引物：5’-TTCCGTTTCCTGGTTCTCCCTT-3’；β-actin上游引物：5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物：5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3’。以β-actin 為內參，以2-ΔΔCt代表PERK mRNA、CHOP mRNA 的相對表達量。實驗重復測算3 次，取平均值。

1.9 各組胞PERK/CHOP 信號通路相關蛋白與凋亡相關蛋白檢測 采用WESTERN Blotting 法。培養(yǎng)48 h時取各組細胞，加入RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白。根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒操作說明測定總蛋白濃度。定量蛋白經10% SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜、脫脂奶粉封閉后將膜與p-PERK（1∶500）、PERK（1∶500）、p-eIF2α（1∶500）、eIF2α（1∶500）、ATF4（1∶200）、CHOP（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化物酶標記的IgG二抗（1∶5 000）在室溫下孵育2 h，加入ECL化學發(fā)光劑進行顯色。以GAPDH 作為內參，在凝膠成像儀下進行曝光，利用Image Lab 軟件測算目標蛋白的灰度值，以灰度值代表目的蛋白的相對表達量。實驗重復測算3 次，取平均值。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料通過Shapiro-Wilk 進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞OD570nm值比較 培養(yǎng)24、48、72 h 時各組細胞OD570nm值比較見表1。

表1 培養(yǎng)24、48、72 h時各組MG-63細胞OD570nm值比較（±s）

表1 培養(yǎng)24、48、72 h時各組MG-63細胞OD570nm值比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與PA-L組比較，#P＜0.05；與PA-M組比較，&P＜0.05；與PA-H組比較，△P＜0.05。

組別PA-L組PA-M組PA-H組PA-H + GSK2606414組對照組OD570nm值培養(yǎng)72 h 0.83 ± 0.08 0.66 ± 0.06*#0.43 ± 0.04*#&0.69 ± 0.07△0.87 ± 0.08培養(yǎng)24 h 0.27 ± 0.02 0.26 ± 0.03 0.25 ± 0.02 0.26 ± 0.02 0.28 ± 0.03培養(yǎng)48 h 0.59 ± 0.06 0.48 ± 0.04*#0.31 ± 0.03*#&0.52 ± 0.05△0.63 ± 0.06

2.2 各組細胞遷移率比較 PA-L 組、PA-M 組、PA-H 組、PA-H + GSK2606414 組及對照組細胞遷移率分別為51.07% ± 4.96%、40.27% ± 4.25%、26.28% ± 2.91%、45.34% ± 4.66%^、54.20% ±5.89%，與對照組比較，PA-M 組、PA-H 組細胞的細胞遷移率低（P 均＜0.05）；與PA-L 組比較，PA-M 組、PA-H 組細胞遷移率低（P均＜0.05）；與PA-M 組比較，PA-H 組細胞遷移率低（P＜0.05）；與PA-H 組比較，PA-H + GSK2606414 組細胞遷移率高（P＜0.05）。

2.3 各組細胞侵襲數(shù)比較 PA-L 組、PA-M 組、PA-H 組、PA-H + GSK2606414 組及對照組細胞侵襲數(shù)分別為（104.35 ± 7.54）、（83.81 ± 6.38）、（59.92 ± 5.33）、（87.64 ± 6.89^）、（112.59 ± 8.20）個/視野。與對照組比較，PA-M 組、PA-H 組細胞侵襲數(shù)目少（P均＜0.05），PA-L 組無顯著性差異（P＞0.05）；與PA-L 組比較，PA-M 組、PA-H 組細胞的細胞侵襲數(shù)少（P均＜0.05）；與PA-M組比較，PA-H組細胞的細胞侵襲數(shù)少（P＜0.05）；與PA-H組比較，PA-H+ GSK2606414組細胞的細胞侵襲數(shù)多（P＜0.05）。

2.4 各組細胞凋亡率比較 PA-L 組、PA-M 組及PA-H 組、PA-H + GSK2606414 組及對照組細胞遷移率分別為6.21% ± 0.69%、13.54% ± 0.95%、22.36% ± 1.47%、12.04% ± 0.85%△、4.67% ±0.63%，與對照組比較，PA-M 組、PA-H 組細胞凋亡率高（P均＜0.05）；與PA-L 組比較，PA-M 組、PA-H組細胞凋亡率高（P均＜0.05）；與PA-M組比較，PA-H組細胞凋亡率高（P＜0.05）；與PA-H 組比較，PA-H +GSK2606414組細胞凋亡率低（P＜0.05）。

2.5 各組細胞PERK mRNA、CHOP mRNA 相對表達量比較 各組細胞PERK mRNA、CHOP mRNA 相對表達量比較見表2。

表2 各組細胞PERK mRNA、CHOP mRNA相對表達量比較（±s）

表2 各組細胞PERK mRNA、CHOP mRNA相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與PA-L 組比較，#P＜0.05；與PA-M組比較，&P＜0.05；與PA-H組比較，△P＜0.05。

CHOP mRNA 1.05 ± 0.09 1.53 ± 0.15*#1.92 ± 0.19*#&1.50 ± 0.15△1.00 ± 0.00組別PA-L組PA-M組PA-H組PA-H + GSK2606414組對照組PERK mRNA 1.08 ± 0.08 1.42 ± 0.14*#1.87 ± 0.19*#&1.38 ± 0.14△1.00 ± 0.00

2.6 各組細胞PERK/CHOP 信號通路與凋亡相關蛋白表達比較 各組細胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量比較見表3。

表3 各組細胞PERK/CHOP信號通路與凋亡相關蛋白相對表達量比較（±s）

表3 各組細胞PERK/CHOP信號通路與凋亡相關蛋白相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與PA-L組比較，#P＜0.05；與PA-M組比較，&P＜0.05；與PA-H組比較，△P＜0.05。

組別PA-L組PA-M組PA-H組PA-H + GSK2606414組對照組Bcl-2 0.74 ± 0.07 0.47 ± 0.05*#0.26 ± 0.03*#&0.56 ± 0.05△0.78 ± 0.07 p-PERK/PERK 0.28 ± 0.03 0.48 ± 0.04*#0.79 ± 0.07*#&0.43 ± 0.04△0.24 ± 0.02 p-eIF2α/eIF2α 0.25 ± 0.02 0.53 ± 0.05*#0.83 ± 0.08*#&0.49 ± 0.05△0.21 ± 0.02 ATF4 0.29 ± 0.03 0.55 ± 0.05*#0.81 ± 0.08*#&0.51 ± 0.05△0.26 ± 0.03 CHOP 0.35 ± 0.03 0.59 ± 0.06*#0.92 ± 0.09*#&0.54 ± 0.05△0.32 ± 0.03 Bax 0.30 ± 0.03 0.61 ± 0.06*#0.88 ± 0.08*#&0.57 ± 0.06△0.28 ± 0.03

3 討論

骨肉瘤屬于原發(fā)性的惡性腫瘤，常發(fā)于兒童或青少年人群，且骨肉瘤的復發(fā)率與轉移率較高，手術切除治療骨肉瘤的預后不佳［11］。

PA 是茯苓中提取的主要活性成分，其抗腫瘤作用受到廣泛關注。樊燕青等［12］研究發(fā)現(xiàn)PA 能通過抑制CXCR4 表達降低舌鱗狀細胞癌CAL-27 細胞增殖，并誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡。JIANG 等［13］研究發(fā)現(xiàn)PA 抑制了肝癌細胞HepG2 和Huh7 的生長與遷移。本研究結果發(fā)現(xiàn)，40、80 μmol/L 的PA處理可對照組比較降低MG-63 細胞增殖活力、細胞遷移率、細胞侵襲數(shù)目以及細胞Bcl-2 蛋白表達，升高細胞凋亡率和細胞Bax 蛋白表達；這些結果均說明PA 對骨肉瘤MG-63 細胞的增殖、遷移、侵襲具有抑制作用，并可誘導其凋亡，表明PA 可能作為治療骨肉瘤的潛在藥物。

在內質網應激反應早期階段，為了維持細胞正常功能，細胞將阻止未折疊蛋白合成或促進正確的蛋白折疊；當適應性反應不足以克服內質網應激時，細胞凋亡途徑將被啟動，并激活CHOP、Bcl-2 的表達，即激活PERK/CHOP 信號通路促進細胞凋亡［14］。當PERK/CHOP 信號通路啟動時，激活的PERK 會引發(fā)UPR 相關促凋亡信號的啟動，提高磷酸化eIF2α 水平，激活ATF4 并啟動適應性信號通路，抑制蛋白質合成和翻譯；CHOP 過表達可以下調Bcl-2蛋白表達，上調Bax 蛋白表達，誘導細胞凋亡［15］。YANG 等［16］研究發(fā)現(xiàn)PA 能通過誘導內質網應激，抑制宮頸癌細胞增殖、遷移，并誘導其凋亡，起到抗宮頸癌作用，表明PA可通過調控內質網應激發(fā)揮抗癌活性。在本研究中，40、80 μmol/L 的PA 處理可上調MG-63 細胞中比較PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白表達和eIF2α磷酸化水平，降低Bcl-2蛋白表達，說明PA 對骨肉瘤細胞MG-63 細胞惡性生物學行為的抑制作用可能與激活PERK/CHOP 信號通路有關。本研究在80 μmol/L的PA 處理的基礎上使用PERK 抑制劑GSK2606414 干預MG-63 細胞，結果顯示，GSK2606414 減弱了80 μmol/L 的PA 對MG-63 細胞增殖、侵襲和凋亡的作用；提示PA 可能通過激活PERK/CHOP 信號通路抑制骨肉瘤細胞MG-63 細胞增殖和侵襲，并誘導細胞凋亡。

綜上所述，PA 可抑制可能通過激活PERK/CHOP 信號通路表達，抑制MG-63 細胞增殖、侵襲和遷移，促進細胞的凋亡。然而，本研究只在細胞水平上初步探究了PA 的抗骨肉瘤作用及PERK/CHOP信號通路在其中的作用，后續(xù)還需進一步深入研究。