陳 玉，李宇聰，劉 妍，付嚴(yán)松，繆有志，張瑞福,2*

（1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

木霉菌(Trichodermaspp.)是一類常見的土壤腐生絲狀真菌，能夠以死亡植物和其它真菌為食，廣泛分布于全世界幾乎所有環(huán)境中，包括農(nóng)田、森林、山丘、草地和沙漠等陸地生態(tài)系統(tǒng)以及淡水和海水等環(huán)境[1-2]。在分類上，已鑒定到的木霉屬物種數(shù)目從50 年前的9 種增加至目前的400 多種[3]。作為植物根際最重要的非共生益生真菌，木霉類似于菌根真菌，與宿主植物根系通過多種互作機(jī)制改善根系結(jié)構(gòu)和根際環(huán)境，增強(qiáng)植物對生物和非生物脅迫的耐受性，幫助植物抵御病原菌的侵害，促進(jìn)植物生長[2]。相關(guān)研究和專利申請數(shù)量近年呈指數(shù)級增長[2]，木霉屬菌株已被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)并表現(xiàn)出優(yōu)異的植物促生效果。目前已經(jīng)證明對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有益的木霉菌主要屬于深綠木霉(T.atroviride)、綠色木霉(T.viride)、棘孢木霉(T.asperellum)、類棘孢木霉(T.asperelloides)、哈茨木霉(T.harzianum)、貴州木霉(T.guizhounese)、綠木霉(T.virens)等，其中深綠木霉、哈茨木霉、貴州木霉和綠色木霉具有生防和植物促生功能，被用于生產(chǎn)生物農(nóng)藥和生物肥料[3-4]。木霉菌吸收養(yǎng)分、耐受活性氧，在根上生長的能力，以及與其他植物有益微生物的相容性，使它能夠在土壤、根表和根內(nèi)組織中定殖，有效的根際定殖是根際益生木菌發(fā)揮促生功能的重要前提[2]。木霉基因組中豐富的次級代謝產(chǎn)物基因簇也是其能夠促進(jìn)植物生長發(fā)育的另一重要因素，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有新結(jié)構(gòu)骨架的木霉天然活性產(chǎn)物種類較少。本文總結(jié)了近年來國內(nèi)外在木霉根際定殖、促生機(jī)制和天然活性物質(zhì)分離純化研究中取得的最新進(jìn)展，并對篩選和系統(tǒng)挖掘植物益生木霉?jié)撛谛滦突钚晕镔|(zhì)的策略提出展望。

1 植物益生木霉的定殖方式及其調(diào)控機(jī)制

木霉通過轉(zhuǎn)變營養(yǎng)習(xí)慣和生態(tài)角色，進(jìn)化出寄生(parasitism)、腐生(saprotropism) 和互惠共生(mutualism)等多樣化的營養(yǎng)方式[2]。在進(jìn)化過程中重塑自身基因組以提高其適應(yīng)新棲息地和競爭營養(yǎng)的能力，是由木霉和宿主基因型等因素共同作用實(shí)現(xiàn)的。在首次腐生進(jìn)化過程中，木霉通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得的多種碳水化合物水解酶編碼基因，為其吸收植物根源性營養(yǎng)物質(zhì)，擴(kuò)大寄生和腐生宿主范圍，與植物根系建立互惠共生關(guān)系奠定基礎(chǔ)[5](圖1)。

圖1 益生木霉–植物根系互作機(jī)制Fig.1 Mechanism of beneficial Trichoderma-root interaction

1.1 木霉根際定殖

植物根源性營養(yǎng)物質(zhì)(如糖類、氨基酸、酶類等)創(chuàng)造了一個碳源豐富的根際土壤環(huán)境，并作為趨化信號吸引土壤微生物向植物根際遷移并在根際大量繁殖，在植物根系和土壤微生物之間建立動態(tài)的分子通信，為微生物的根際定殖提供條件[6-8]。木霉復(fù)雜的碳水化合物吸收和代謝機(jī)制，使其能順利定殖在各種富含纖維素和其它碳水化合物的環(huán)境中。在木霉與植物根系的互作中，大多數(shù)木霉能夠利用蔗糖為自身提供碳源和能源[9]，研究表明，綠色木霉能夠分泌蔗糖轉(zhuǎn)化酶(invertase，TvInv)，利用植物根際蔗糖進(jìn)行根際定殖和參與植物防御激活反應(yīng)[10]。蔗糖還能夠作為區(qū)分植物凋落物和植物活體根系的信號來調(diào)控木霉根際定殖，在蔗糖存在的情況下，綠色木霉能夠降低自身水解酶活性避免對宿主產(chǎn)生過度損傷[11-12]。不同木霉菌株蔗糖轉(zhuǎn)化酶的差異可能與菌株的進(jìn)化策略有關(guān)，使得木霉采用不同的代謝策略進(jìn)行根際定殖[5]。此外，木霉也能夠利用水楊酸調(diào)控其在植物根際的定殖。木霉到達(dá)植物根部后，植物內(nèi)源水楊酸(一種調(diào)控木霉早期定殖的關(guān)鍵植物激素)水平迅速提升，將木霉限制在根表皮和皮層的植外體空間內(nèi)[13]，然后木霉通過分泌一系列植外體效應(yīng)蛋白和代謝物(如木聚糖酶、賴氨酸蛋白、角蛋白–白蛋白、萜烯三苯和哈茨木霉酸 A)誘導(dǎo)根部活性氧(ROS)爆發(fā)[2]，而木霉對ROS 的耐受性使其能與植物根部建立一種長期的共生關(guān)系[14]。此外，結(jié)構(gòu)類物質(zhì)(如角鯊烯和麥角甾醇)的平衡對于維持真菌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性非常重要，能夠影響木霉在植物根際的定殖能力，并且在調(diào)節(jié)植物防御和生物防治中具有關(guān)鍵作用[15]。

1.2 木霉根內(nèi)定殖

植物根系表面并非穩(wěn)定的連續(xù)屏障，常出現(xiàn)裂縫或自然開口。木霉可通過損傷、組織擴(kuò)張或特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)入植物組織內(nèi)部并在其中定殖。哈茨木霉是報道最多的內(nèi)生木霉菌種，加勒比木霉(T.caribbaeum)、擬康寧木霉(T.koningiopsis)、里克菲爾德氏木霉(T.lieckfeldtiae)、稀孢木霉(T.paucisporum)、可可木霉(T.theobromicola)也曾有報道[2]。木霉生命周期中的內(nèi)生階段在生態(tài)學(xué)上具有重要意義，因為一旦植物組織死亡，根內(nèi)定殖則提供了相對于純腐生微生物的選擇優(yōu)勢[16-17]。木霉在植物根際定殖后能夠穿透根表進(jìn)入植物細(xì)胞，誘導(dǎo)植物局部和全身的免疫防御反應(yīng)。研究表明，在植物免疫系統(tǒng)的防御下，木霉菌絲通常不會到達(dá)根系木質(zhì)部，而是被限制在根皮層中[13,18]。組織分離實(shí)驗結(jié)果顯示，內(nèi)生木霉具有木質(zhì)部定殖偏好性[19]。作為腐生真菌，木霉具有復(fù)雜的蛋白酶系統(tǒng)，這些真菌蛋白酶對于木霉的內(nèi)生定殖十分重要[4]，已報道的參與木霉內(nèi)生定殖的蛋白酶包括纖維素酶、木聚糖酶、角蛋白、潤漲蛋白、多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶、疏水蛋白和蔗糖轉(zhuǎn)化酶[9,20]。水分及營養(yǎng)物質(zhì)的可用性、氧環(huán)境和復(fù)雜的植物根系結(jié)構(gòu)也是限制木霉根內(nèi)有效定殖的重要因素，植物不同部位營養(yǎng)物質(zhì)組成大不相同，一些組織隨著衰老產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)有利于木霉定殖[16]。對于影響根際益生木霉定殖方式的因素，以及該益生真菌如何逃避植物免疫系統(tǒng)成功定殖等問題仍然缺乏系統(tǒng)的研究。

2 植物益生木霉的促生信號物質(zhì)

定殖于根際的木霉能夠產(chǎn)生超過120 種不同類型的次級代謝產(chǎn)物(secondary metabolites，SMs)，其中以萜烯、吡喃酮、多酮和非核糖體肽最為常見[2]。目前，木霉菌中一些影響植物根系構(gòu)型、調(diào)節(jié)根系養(yǎng)分吸收的信號物質(zhì)已被鑒定，初步闡明了木霉SMs 調(diào)控植物生長發(fā)育的分子機(jī)制[6,21-27](圖1)。

2.1 木霉調(diào)控根系發(fā)育

植物根系結(jié)構(gòu)(root system architecture, RSA)在養(yǎng)分和水分吸收、土壤錨固和根際微生物互作中扮演著不可或缺的角色[28-29]。RSA 的形成是一個復(fù)雜過程，受到多種生物和非生物因素的影響，如植物激素、光照、水分、鹽堿和營養(yǎng)脅迫[30-32]。木霉基因組中含有植物激素合成相關(guān)基因，調(diào)控生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、水楊酸和乙烯等的合成和分泌，參與激活植物內(nèi)源生長素的轉(zhuǎn)運(yùn)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)植物根系發(fā)育[21]。然而，植物根際木霉分泌的生長素過量積累會引起根際酸化，并通過生長素依賴的途徑反向抑制植物根系生長[33]。除上述激素外，目前鑒定的具有調(diào)控根系發(fā)育功能的木霉活性物質(zhì)(表1)有koninginins、6-pentyl-α-pyrone (6PP)、trichocaranes A-D、trichokonin VI、harzianopyridone、cyclonerodiol、harzianolide、harzianic acid[22]。6PP能夠調(diào)控擬南芥(Arabidopsisthaliana)生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和信號通路基因的表達(dá)，干擾植物內(nèi)源生長素通路和乙烯響應(yīng)調(diào)節(jié)子EIN2，誘導(dǎo)植物側(cè)根形成[23]。長枝木霉(T.longibrachiatum)胞外分泌的康寧霉素trichokonin VI 能夠改變根系結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)生長素局部生物合成和極性運(yùn)輸過程[47]。貴州木霉胞外分泌物cedrene 和TgSWO 均能促進(jìn)擬南芥?zhèn)雀l(fā)育[24,34-48]。目前研究結(jié)果顯示，木霉主要通過分泌信號物質(zhì)調(diào)控植物內(nèi)源生長素途徑來促進(jìn)植物根系發(fā)育，生長素轉(zhuǎn)運(yùn)或信號傳遞相關(guān)基因的突變(axu1、big、eir1、axr1)能夠降低木霉對植物生長和根系發(fā)育的促進(jìn)效果[10,36,49]。

揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds，VOCs) 在植物-微生物互作中發(fā)揮著重要的信號作用，除上述物質(zhì)外，木霉還能夠釋放多種VOCs 與植物互作并參與誘導(dǎo)側(cè)根起始[22,50-52]。深綠木霉能夠產(chǎn)生至少25 種VOCs，包括醇、酮、烷烴、呋喃、吡喃酮、單萜和倍半萜類物質(zhì)，氣態(tài)乙烯被認(rèn)為能夠作為信號分子在真菌-植物互作中發(fā)揮核心作用[50,53]。非接觸情況下，綠色木霉能夠釋放VOCs 提高擬南芥生物量，其中以倍半萜烯類(sesquiterpenes，SQTs)含量最高[54]。

2.2 木霉調(diào)控養(yǎng)分吸收

在土壤–根系界面，養(yǎng)分元素經(jīng)歷了復(fù)雜的溶解、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的動態(tài)過程，這種過程受根際微生物活動的影響[55-57]。植物益生菌能夠通過刺激根系生長、促進(jìn)營養(yǎng)元素遷移和活化根際養(yǎng)分等，幫助大多數(shù)植物改善其礦質(zhì)營養(yǎng)吸收[58-61]。土壤養(yǎng)分的吸收利用需要從根際轉(zhuǎn)移到根表，對于絲狀真菌定殖的根系而言，養(yǎng)分能夠通過絲狀真菌菌絲從根際土壤轉(zhuǎn)移至根表。木霉釋放的有機(jī)酸(如檸檬酸、草酸、酒石酸等，表1)能夠溶解含鉀礦物釋放鉀離子，提高植物根際鉀元素的有效性[4]。選用能夠溶解不同磷酸鹽的木霉菌可以提高植物根際磷的有效性，增強(qiáng)植物根系對磷養(yǎng)分的吸收，從而促進(jìn)植物生長[25]。鐵是微生物繁殖和植物生長的必需營養(yǎng)元素之一，但植物可利用性Fe3+在有氧條件下會與氧氣反應(yīng)形成不溶性的鐵氫氧化物，降低土壤中鐵的有效性[6]。木霉能夠產(chǎn)生鐵載體(coprogen、coprogen B、fusarinine C、ferricrocin、harzianic acid)螯合土壤鐵氫氧化物中的鐵離子，為植物提供鐵營養(yǎng)[12-13]。在缺鐵條件下，木霉能夠分泌多種類型的鐵載體，鐵載體的多樣性是非核糖體肽合成酶(NRPS)活性修飾的結(jié)果，而非NRPS 編碼基因差異所致[27]。目前，木霉SMs 促進(jìn)植物根際養(yǎng)分利用的研究主要集中在溶磷、鐵和解鉀方面，關(guān)于木霉SMs 調(diào)控植物養(yǎng)分吸收速率和植物胞內(nèi)養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)功能分子機(jī)制的研究鮮有報道。

3 植物益生木霉活性物質(zhì)的挖掘策略

木霉的基因組中包含不同糖基水解酶、次級代謝物、抗生素、具有殺蟲特性的凝集素、具有生物修復(fù)潛力的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的合成基因簇，它們在植物生長、病原菌防控和土壤調(diào)理中起著重要作用[62-63]。盡管如此，目前分離鑒定得到的木霉新活性SMs 種類和數(shù)量依然非常少，新結(jié)構(gòu)、高活性木霉次級代謝產(chǎn)物的獲得，需要行之有效的高通量篩選手段，生物活性導(dǎo)向型篩選和基因組挖掘篩選是目前常用的兩種方法。近年來，一些新開發(fā)的分析工具和改進(jìn)的微生物培養(yǎng)方法也為木霉SMs 挖掘提供了新的技術(shù)手段[64]。

3.1 生物活性導(dǎo)向型篩選

傳統(tǒng)的生物活性導(dǎo)向分離策略主要包括發(fā)酵粗提物生產(chǎn)、生物活性檢測和化學(xué)性質(zhì)表征3 個階段。發(fā)酵基質(zhì)中溶質(zhì)的溶解性取決于溶劑與溶質(zhì)的極性，了解目標(biāo)化合物的極性對選擇萃取溶劑十分重要。有機(jī)溶劑萃取法具有簡單、實(shí)用、高性能、低成本和低設(shè)備要求等優(yōu)點(diǎn)，但存在致毒性、溶劑消耗大和潛在環(huán)境污染等缺點(diǎn)。此外，還需考慮提取方法、溶劑毒性、待提取化合物的穩(wěn)定性以及成本等因素[65]。生物活性導(dǎo)向分離天然產(chǎn)物的通用策略如下：1) 使用反相高效液相色譜法(reverse-phase HPLC)分析有機(jī)溶劑二氯甲烷或乙酸乙酯萃取粗提物；2) 使用自動餾分收集器將各分離餾分收集到96 孔板中；3)對所有餾分進(jìn)行生物活性測試確定有效餾分(可根據(jù)實(shí)際操作過程、粗提物復(fù)雜程度、目標(biāo)活性物質(zhì)穩(wěn)定程度等進(jìn)行多次分離純化)，用半制備高效液相色譜法(semi-prep-HPLC)對有效餾分進(jìn)行色譜分離，對所有餾分進(jìn)行生物活性測試以確認(rèn)活性部分，獲得具有生物活性的純物質(zhì)；4)將活性餾分注入超高效液相色譜四極飛行時間質(zhì)譜(UHPLCqTOF-MS)，利用MS/MS 數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫確認(rèn)活性部分的身份；5)利用UV、IR、MS 和NMR 等技術(shù)獲得活性化合物的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析并獲得生物學(xué)數(shù)據(jù)[66]。傳統(tǒng)的生物活性的分離過程耗時耗力，存在較大的局限性，例如當(dāng)木霉離開其自然棲息地在實(shí)驗室培養(yǎng)時，其基因組中一些生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters, BGCs)會選擇性沉默不表達(dá)；一些BGCs 合成的SMs 在本源菌中產(chǎn)量較低；一些已知的SMs 在篩選過程中會重復(fù)出現(xiàn)等[67]。因此，單純使用生物活性導(dǎo)向型篩選方法獲得結(jié)構(gòu)新穎的木霉SMs 的概率越來越低。

3.2 基因組挖掘篩選

基因組挖掘是以基因簇序列和生物合成途徑為導(dǎo)向的天然產(chǎn)物發(fā)掘新策略，它直接將天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與合成途徑關(guān)聯(lián)，進(jìn)行生物合成和組合生物合成研究，有助于微生物天然產(chǎn)物化學(xué)研究逐漸克服隨機(jī)性、盲目性和偶然性[68]。合成生物學(xué)技術(shù)、生物信息學(xué)分析工具(如anti-SMASH 和SMURF)能夠為木霉代謝產(chǎn)物BGCs 是否合成具有新化學(xué)支架的物質(zhì)提供線索[64]。方法如下：1) 對于基因組中明確的BGCs，在本源菌中將其敲除，通過HPLC-MS 手段比較分析突變株和野生株的次級代謝譜，確定可能是目標(biāo)BGCs 合成化合物的差異峰；2)對于在本源菌中不表達(dá)或表達(dá)量較低的BGCs，需要通過遺傳操作將其激活進(jìn)而發(fā)現(xiàn)其編碼的天然產(chǎn)物；3)對于基因組中未知的BGCs，其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)無法預(yù)測，可通過沉默未知BGCs 中負(fù)責(zé)產(chǎn)物合成的必需基因，結(jié)合突變株和野生株代謝產(chǎn)物的HPLC-MS 平行檢測，發(fā)現(xiàn)未知BGCs 所編碼的代謝產(chǎn)物[69]。劉天罡等將自動化高通量操作平臺(auto-HTP 工作站)引入天然產(chǎn)物挖掘領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)了絲狀真菌萜類物質(zhì)的巨大生產(chǎn)能力，實(shí)現(xiàn)了絲狀真菌萜類BGCs 的批量挖掘和相關(guān)次級代謝產(chǎn)物的高效合成[67]，該技術(shù)有效解決了絲狀真菌SMs 研究領(lǐng)域的“三低”(研究通量低、產(chǎn)物集中度低和物質(zhì)產(chǎn)量低)技術(shù)難題，顯著提升了新產(chǎn)物的發(fā)掘效率[54]。

4 展望

全球氣候變化、農(nóng)業(yè)高度集約化、植物病害以及化學(xué)肥料過量施用對土壤、空氣和水資源的污染，對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成了極大的危害。以木霉為代表的相關(guān)農(nóng)用微生物制劑，可以減少化學(xué)品的投入，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的綠色和可持續(xù)發(fā)展[70]。木霉生物制劑除了包含活菌的生物制品，還包含來源于木霉的天然活性化合物(如6PP、鐵載體、木霉源植物激素)制品，均可用以作物增產(chǎn)增收[71]。木霉天然活性化合物的研究、選擇和使用，對于研發(fā)新一代生物肥料、降低化肥的施用以及實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

植物根系作為吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，其發(fā)育受到復(fù)雜的生物和非生物因素調(diào)控。木霉作為植物根際含量豐富的益生真菌，闡明木霉促進(jìn)植物根系發(fā)育、養(yǎng)分利用的相關(guān)信號物質(zhì)和遺傳基礎(chǔ)，有助于合理使用益生木霉進(jìn)行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。盡管近年來對木霉–植物互作促生的理論和應(yīng)用研究均取得了長足進(jìn)步，但木霉在農(nóng)業(yè)綠色生產(chǎn)中的潛力仍未被充分挖掘，對木霉與植物根系互作的信號基礎(chǔ)、功能、機(jī)制等均缺乏深入系統(tǒng)的研究，對木霉誘導(dǎo)植物根系發(fā)育和養(yǎng)分高效利用機(jī)理方面的研究并不全面，木霉活性SMs 分離純化等進(jìn)展緩慢，限制了木霉-植物互作增效潛力的發(fā)揮。未來在益生木霉-植物根系互作研究中應(yīng)重點(diǎn)圍繞以下幾個方向：

1)可以結(jié)合合成生物學(xué)技術(shù)，通過多模塊基因序列分析，預(yù)測并分析其編碼的化合物結(jié)構(gòu)，指導(dǎo)生物合成基因簇編碼天然產(chǎn)物的定向分離和純化。

2)調(diào)控基因的研究和應(yīng)用，還應(yīng)當(dāng)充分借鑒轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀遺傳學(xué)等生命科學(xué)研究的最新成果，進(jìn)一步開發(fā)質(zhì)譜技術(shù)、微量核磁技術(shù)等分析手段，在新型天然化合物發(fā)掘上的應(yīng)用潛力。

3)系統(tǒng)闡明木霉天然活性產(chǎn)物調(diào)控根系發(fā)育的分子途徑，不僅僅局限于經(jīng)典生長素途徑。

4)根據(jù)不同作物對養(yǎng)分需求的差異性，探索綜合利用木霉不同天然活性產(chǎn)物組合調(diào)控根系養(yǎng)分高效吸收的技術(shù)體系。篩選出調(diào)控水稻、玉米和小麥等糧食作物根系發(fā)育，增強(qiáng)根系對不同外界環(huán)境變化適應(yīng)性的新型木霉天然次級代謝產(chǎn)物。