丁立人,楊一丁,邵云,萬(wàn)樂(lè)音,溫超,周巖民

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

為滿(mǎn)足我國(guó)不斷增長(zhǎng)的雞蛋消費(fèi)需求,蛋雞養(yǎng)殖通過(guò)提高飼養(yǎng)密度和飼料營(yíng)養(yǎng)水平來(lái)達(dá)到提高雞蛋高產(chǎn)目標(biāo),但高產(chǎn)、高密度和高營(yíng)養(yǎng)等因素使蛋雞機(jī)體長(zhǎng)期處于高負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)狀態(tài),機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高,抵抗力下降,腸道疾病頻發(fā)［1-2］。腸道疾病會(huì)引起蛋雞飼料利用效率及產(chǎn)蛋率下降、破蛋增多等現(xiàn)象,給蛋雞養(yǎng)殖造成極大損失。因此,腸道健康的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控始終是蛋雞養(yǎng)殖關(guān)注的重點(diǎn)。此外,為保證食品安全,蛋雞產(chǎn)蛋期飼料中禁止使用抗生素,若需使用抗生素治療腸道疾病時(shí),用藥期和休藥期所產(chǎn)雞蛋均需銷(xiāo)毀,這也給養(yǎng)殖戶(hù)造成了較大經(jīng)濟(jì)損失。因此,開(kāi)發(fā)安全、高效的蛋雞腸道保護(hù)產(chǎn)品尤為重要。

益生菌［3-4］和益生元［5-6］是具有抗生素替代潛力的綠色添加劑。但單一飼料添加劑功能存在局限性,采用多種添加劑產(chǎn)品組合可發(fā)揮協(xié)同作用而更為有效保護(hù)腸道［7］。合生元(synbiotic,Syn)是益生菌和益生元復(fù)配的混合型飼料添加劑,由生物有機(jī)成分構(gòu)成,各組分既可獨(dú)立發(fā)揮自身功能,又可協(xié)同保障腸道健康。蛋雞飼料中添加合生元可提高蛋雞生產(chǎn)性能和改善蛋殼品質(zhì)［8］、改善腸道形態(tài)［9］、增強(qiáng)蛋雞抗病力等［10］。改性凹凸棒石(modified attapulgite,Matp)是天然凹凸棒石經(jīng)酸、熱或表面修飾等方式處理得到,其功能比天然棒石更強(qiáng)［11］。改性凹凸棒石能夠提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力,提高腸道免疫性能,改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu),增強(qiáng)腸道屏障功能,保障腸道健康［12-13］,其在保護(hù)腸道方面的作用尤受關(guān)注。常規(guī)合生元和改性凹凸棒石對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能和腸道健康的調(diào)控報(bào)道較多,但兩者復(fù)配后在蛋雞生產(chǎn)上的應(yīng)用研究未見(jiàn)報(bào)道?；诤仙亩x、改性凹凸棒石的腸道保護(hù)功能和腸道屏障結(jié)構(gòu)特點(diǎn),對(duì)合生元定義進(jìn)行必要的擴(kuò)展,將改性凹凸棒石作為合生元的成分,形成由生物、有機(jī)、無(wú)機(jī)成分配制而成的新型合生元。本試驗(yàn)以420日齡海蘭褐蛋雞為研究對(duì)象進(jìn)行60 d的飼養(yǎng)試驗(yàn),研究新型合生元對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能、抗氧化能力、腸道功能和蛋品質(zhì)的影響,為合生元產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供參考,亦為蛋雞健康養(yǎng)殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所使用的合生元由低聚木糖、低聚殼聚糖、枯草芽胞桿菌和改性凹凸棒石按一定比例在實(shí)驗(yàn)室配制而成,添加量為1 000 mg·kg-1。其中,低聚木糖購(gòu)自江蘇康維生物有限公司,低聚木糖含量≥40%;低聚殼聚糖購(gòu)于嘉興科瑞生物科技有限公司,低聚殼聚糖含量≥90%,脫乙酰度>85%;枯草芽胞桿菌購(gòu)于江蘇奕農(nóng)生物股份有限公司,菌含量≥1011CFU·g-1;改性凹凸棒石購(gòu)自江蘇神力特生物科技股份有限公司,氧化鎂含量≥8%,吸藍(lán)量≥14 g·100 g-1。合生元的添加水平根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)篩選確定。本試驗(yàn)所有試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)在江蘇南京盤(pán)滁機(jī)械化蛋雞養(yǎng)殖基地進(jìn)行。試驗(yàn)選取192只420日齡(60 w)海蘭褐蛋雞,分為2個(gè)組,每組6重復(fù),每重復(fù)16只雞。對(duì)照組(Con)飼喂基礎(chǔ)日糧,試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加1 000 mg·kg-1合生元(合生元組,Syn),試驗(yàn)期60 d。添加的合生元先均勻混入預(yù)混料中,然后再加入飼糧中混合均勻。試驗(yàn)期間蛋雞自由飲水采食,每日光照黑暗時(shí)長(zhǎng)為16 h/8 h。基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Compositions and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 樣品采集

于試驗(yàn)第59天早晨從每組各重復(fù)中隨機(jī)選取3個(gè)雞蛋,測(cè)定雞蛋的相關(guān)指標(biāo)。于試驗(yàn)的第61天從每組各重復(fù)中隨機(jī)挑選1只體重接近平均體重、健康的蛋雞稱(chēng)重后進(jìn)行屠宰。使用10 mL的離心管收集血液并在4 ℃、3 600 r·min-1的條件下離心15 min,上清液即為血清;同時(shí)另收集靜脈血液于10 mL含抗凝劑的除熱源玻璃管中,4 ℃保溫。于3 000 r·min-1離心15 min,上清液即為血漿。將收集的血清和血漿分別分裝于0.5 mL離心管中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

確認(rèn)雞死亡后,剖開(kāi)腹腔分離出肝臟、空腸和回腸,剪取5 g左右的肝臟裝于凍存管中,于-80 ℃液氮中保存;分離空腸和回腸并剪取中端2 cm,生理鹽水沖洗凈后放入50 mL收集管中并加入40 mL左右4%多聚甲醛以固定。腸道切片樣品采集完成后,生理鹽水洗凈空腸和回腸腸段后縱向剪開(kāi),使用載玻片刮取腸道黏膜于無(wú)菌凍存管中,于-80 ℃液氮中保存,以待進(jìn)一步化驗(yàn)分析。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及測(cè)定方法

1.4.1 生產(chǎn)性能指標(biāo)試驗(yàn)期間記錄每個(gè)重復(fù)的產(chǎn)蛋數(shù)量和蛋重,每隔10 d統(tǒng)計(jì)一次每個(gè)重復(fù)的飼料消耗量。于試驗(yàn)第60天計(jì)算各重復(fù)的平均蛋重、產(chǎn)蛋率、平均日采食量和料蛋比。計(jì)算公式如下:

平均蛋重=產(chǎn)蛋總重/產(chǎn)蛋總數(shù);產(chǎn)蛋率=總產(chǎn)蛋數(shù)/產(chǎn)蛋雞總數(shù)×100%;平均日采食量=飼糧消耗量/蛋雞總數(shù)/試驗(yàn)天數(shù);料蛋比=飼糧消耗總量/產(chǎn)蛋總重。

1.4.2 蛋品質(zhì)采用蛋殼強(qiáng)度測(cè)定儀ETR-01(Orka,以色列)測(cè)定蛋殼強(qiáng)度;蛋重、哈氏單位、蛋白高度和蛋黃顏色采用多功能蛋品質(zhì)檢測(cè)儀(EMT-5200 Robotmation,日本)檢測(cè);采用螺旋測(cè)微器分別測(cè)定蛋殼銳端、中端、鈍端厚度并最終取三者的平均值計(jì)算蛋殼厚度。

1.4.3 血清生化指標(biāo)采用試劑盒法測(cè)定血清中白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TC)、總蛋白(TP)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。

1.4.4 抗氧化指標(biāo)采用試劑盒法測(cè)定血清和肝臟中的丙二醛(MDA)含量、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性。

1.4.5 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察蛋雞腸道組織于4%多聚甲醛中固定48 h后,采用石蠟切片法制作切片:經(jīng)脫水、透明及浸蠟,持續(xù)將融化的石蠟倒入包埋模具中進(jìn)行包埋,冷卻使其迅速凝固成蠟塊,修整蠟塊,用切片機(jī)對(duì)蠟塊切片,切取厚度為5 μm左右。然后,根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用伊紅和蘇木精溶液對(duì)切片進(jìn)行HE染色并封片。待自然晾干后,使用尼康正置顯微鏡(ECLIPSE 80i,日本)測(cè)量并記錄空腸及回腸的絨毛高度(VH)、隱窩深度(CD)與肌層厚度,計(jì)算絨毛高度/隱窩深度比(VH/CD),每個(gè)腸道切片樣品隨機(jī)選取5根完整腸絨毛用于腸道形態(tài)的觀察。

1.4.6 腸道黏膜抗氧化指標(biāo)分別準(zhǔn)確稱(chēng)取0.4 g的空腸、回腸黏膜于5 mL磨樣管中,加入0.4 g左右鋯珠,向磨樣管中加入3.6 mL(9倍體積)4 ℃預(yù)冷的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH7.4),于DISRAD臺(tái)式分散勻漿機(jī)上勻漿,將混合勻漿液于4 ℃、4 000g離心15 min,取上清液分裝后保存于-20 ℃冰箱。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋雞腸道黏膜中T-SOD活性、CAT活性、T-AOC與MDA含量。

1.4.7 腸道免疫球蛋白與細(xì)胞因子含量測(cè)定前空腸和回腸黏膜勻漿液的制備同1.4.6節(jié)。采用ELISA試劑盒法測(cè)定蛋雞空腸、回腸黏膜中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、白介素1β(IL-1β)、干擾素γ(INF-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行初步處理,用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用獨(dú)立樣本t測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。每組數(shù)據(jù)均采用平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 合生元對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知,與對(duì)照組相比,合生元組蛋雞產(chǎn)蛋率顯著提高(P<0.05),提高了4.25%,但合生元對(duì)蛋雞平均蛋重、平均日采食量和料蛋比則無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表2 合生元對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effects of synbiotic on production performance in laying hens

2.2 合生元對(duì)蛋雞血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知,與對(duì)照組相比,合生元組蛋雞血清白蛋白和高密度脂蛋白膽固醇含量顯著提高(P<0.05),總膽固醇含量有提高的趨勢(shì)(P=0.051)。合生元對(duì)蛋雞血清甘油三酯、葡萄糖、極低密度脂蛋白膽固醇含量則無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表3 合生元對(duì)蛋雞血清生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of synbiotic on serum biochemical indices in laying hens

2.3 合生元對(duì)蛋雞血清和肝臟抗氧化功能的影響

由表4可知,與對(duì)照組相比,合生元組蛋雞血清T-AOC顯著提高(P<0.05),肝臟T-AOC和T-SOD活性亦顯著提高(P<0.05)。合生元對(duì)蛋雞血清和肝臟其他抗氧化指標(biāo)則無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表4 合生元對(duì)蛋雞血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of the synbiotic on serum and liver antioxidant indices in laying hens

2.4 合生元對(duì)蛋雞成腸道黏膜抗氧化功能的影響

由表5可知,與對(duì)照組相比,合生元組蛋雞空腸黏膜T-SOD活性顯著提高(P<0.05)。添加合生元對(duì)蛋雞腸黏膜MDA含量、T-AOC和CAT活性則無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表5 合生元對(duì)蛋雞腸道黏膜抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of the synbiotic on intestinal mucosa antioxidant indices in laying hens

2.5 合生元對(duì)蛋雞腸道黏膜免疫球蛋白和細(xì)胞因子含量的影響

由表6可知,與對(duì)照組相比,合生元組蛋雞空腸黏膜IgG和sIgA含量顯著提高(P<0.05),TNF-α含量顯著降低(P<0.05),INF-γ和IL-1β含量有降低的趨勢(shì);回腸黏膜IgM含量顯著提高(P<0.05),IgG含量有提高的趨勢(shì)。

表6 合生元對(duì)蛋雞腸道黏膜免疫球蛋白和細(xì)胞因子水平的影響Table 6 Effects of the synbiotic on intestinal mucosalimmunoglobulin and cytokine levels in laying hens

2.6 合生元對(duì)蛋雞腸道形態(tài)的影響

由表7可知,與對(duì)照組相比,合生元組蛋雞空腸和回腸肌層厚度、絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)。

表7 合生元對(duì)蛋雞腸道形態(tài)指標(biāo)的影響Table 7 Effects of the synbiotic on intestinal morphology indices in laying hens

2.7 合生元對(duì)蛋品質(zhì)的影響

由表8可知,與對(duì)照組相比,合生元組雞蛋哈氏單位顯著提高(P<0.05),蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度有提高的趨勢(shì),而對(duì)蛋白高度和蛋黃顏色則影響不大(P>0.05)。

表8 合生元對(duì)蛋品質(zhì)的影響Table 8 Effects of synbiotic on egg quality of laying hens

3 討論

合生元對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能具有改善作用,但效果差異較大。Hoon等［8］報(bào)道,飼糧中添加合生元可顯著提高20～36周齡蛋雞的采食量和產(chǎn)蛋量,提高20～52周齡蛋雞的增重、料蛋比和蛋重。Mohammad等［14］研究顯示,合生元對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋率、蛋重和平均日采食量均無(wú)顯著影響。羅丹等［15］的研究顯示,蛋雞飼料中添加凹凸棒石可顯著提高蛋雞產(chǎn)蛋率,但對(duì)其他生產(chǎn)性能指標(biāo)則無(wú)影響。Song等［16］在蛋雞飼料中添加合生元-絲蘭提取物復(fù)合制劑發(fā)現(xiàn),該復(fù)合制劑顯著提高蛋雞產(chǎn)蛋率,對(duì)蛋重與料蛋比無(wú)顯著影響。本研究結(jié)果顯示,合生元可顯著提高蛋雞產(chǎn)蛋率,但對(duì)蛋重、平均日采食量和料蛋比雖在統(tǒng)計(jì)上無(wú)顯著影響,但總產(chǎn)蛋重高于對(duì)照組,料蛋比低于對(duì)照組,因此最終提高了生產(chǎn)性能。這可能與益生元提高蛋雞抗氧化能力和免疫力［5］,枯草芽胞桿菌提高飼料消化吸收率［4］以及改性凹凸棒石可吸附飼料和腸道中的霉菌毒素等有害物質(zhì)［15］有關(guān)。蛋雞生產(chǎn)性能與蛋雞日齡、品種、營(yíng)養(yǎng)水平和健康程度等息息相關(guān),同時(shí),復(fù)合制劑各組分添加量對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能也會(huì)產(chǎn)生重要影響［17］。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,合生元組蛋雞血清白蛋白含量顯著升高,說(shuō)明合生元組蛋雞對(duì)飼料中蛋白質(zhì)的消化吸收率提高,且肝臟的蛋白質(zhì)合成能力增強(qiáng)。白蛋白是機(jī)體蛋白質(zhì)合成中最有利的氨基酸來(lái)源［18］,這也為合生元組雞蛋的哈氏單位提高提供了有力證據(jù)。合生元組蛋雞高密度脂蛋白顯著提高,說(shuō)明復(fù)合制劑改善了蛋雞肝臟脂代謝［19］;膽固醇在血液中以脂蛋白形式存在［20］,合生元組蛋雞總膽固醇含量有升高的趨勢(shì),可能與高密度脂蛋白含量升高有關(guān)。

抗氧化性能是評(píng)價(jià)蛋雞健康程度的重要指標(biāo)［21］。T-AOC是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能的綜合指標(biāo)［22］。SOD是細(xì)胞內(nèi)的主要抗氧化酶之一,其活力高低間接反映了機(jī)體清除自由基的能力［23］。Min等［24］研究發(fā)現(xiàn),日糧中補(bǔ)充含低聚木糖合生元可提高肉雞血清T-SOD活性。Tao等［6］在日糧中添加低聚殼聚糖后發(fā)現(xiàn)蛋雞T-AOC和T-SOD活性均顯著提高。Chen等［23］研究顯示,飼糧中添加枯草芽胞桿菌可增加腸黏膜T-SOD活性。簡(jiǎn)誼龍等［12］發(fā)現(xiàn),改性凹凸棒石可有效提高60日齡蛋雞谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和T-SOD活性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,日糧中加入合生元后,蛋雞血清T-AOC活性顯著提高,肝臟T-AOC和T-SOD活性顯著提高,空腸黏膜T-SOD活性顯著提高。肝臟T-AOC活性提高表明肝臟整體功能得到改善,T-SOD活性提高表明肝細(xì)胞消除自由基能力增強(qiáng)。因此,本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明合生元具有提高蛋雞抗氧化能力的作用,同時(shí)與改善蛋雞肝臟相關(guān)的蛋白質(zhì)代謝和脂代謝有關(guān)。

腸道形態(tài)通常用來(lái)評(píng)估腸道營(yíng)養(yǎng)消化吸收能力,腸道絨毛高度與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收呈正相關(guān)［29-30］。Nieto-Dominguez等［31］研究表明,飼糧中添加低聚木糖可降低蛋雞十二指腸隱窩深度。Deng等［32］報(bào)道,在飼糧中添加低聚殼聚糖顯著增加肉雞回腸絨毛的高度。Qiao等［33］和簡(jiǎn)誼龍等［12］研究顯示,飼糧中添加改性凹凸棒石可顯著提高蛋雞空腸和回腸絨毛高度并提高絨毛高度/隱窩深度值。本研究結(jié)果顯示,合生元組蛋雞絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值有一定的提高,但未達(dá)到顯著水平,這可能與復(fù)合制劑中各組分添加量差異有關(guān)。

蛋殼是抵御物理?yè)p傷和病原微生物滲透的重要防線(xiàn)［9］。哈氏單位是衡量雞蛋新鮮程度的重要指標(biāo),哈氏單位值越大,雞蛋越新鮮［34］。雞蛋形成于蛋雞輸卵管中,輸卵管分為漏斗部、膨大部、峽部、子宮部和陰道部5部分。其中,膨大部是蛋清形成的部位,膨大部攝取血液中的氨基酸合成蛋白質(zhì)并分泌形成蛋清,且蛋清形成速率與氨基酸攝取速率呈正相關(guān)［35］。子宮主要分泌鈣和色素,是蛋殼形成的部位［36］。本試驗(yàn)結(jié)果中,合生元組蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度有提高的趨勢(shì);蛋白高度提高了12.71%,哈氏單位顯著提高。鈣、磷和維生素D3是影響蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度的關(guān)鍵因素［37］。Li等［38］和Ding等［39］的研究發(fā)現(xiàn),低聚木糖可提高蛋雞對(duì)鈣的吸收,且提高蛋雞血漿中1,25-二羥維生素D3的含量?？莶菅堪麠U菌可分泌α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等消化酶促進(jìn)腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收［40］,低聚殼聚糖具有較強(qiáng)的自由基清除和炎癥緩解能力［41］,改性凹凸棒石具有較強(qiáng)的吸附能力,可以有效降低霉菌毒素(尤其是玉米赤霉烯酮)等有害物質(zhì)對(duì)蛋雞生殖系統(tǒng)的侵襲［15,42］。因此,從本試驗(yàn)結(jié)果可以推斷,蛋雞蛋殼和蛋清形成相關(guān)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝得到提高,輸卵管各部功能得到改善,這可能是合生元中各組分共同作用的結(jié)果。與此同時(shí),蛋雞抗氧化能力和免疫功能的增強(qiáng),改善蛋雞的健康狀況也是蛋品質(zhì)得到改善的重要因素。綜上,本試驗(yàn)所用合生元可以提高蛋雞抗氧化能力和腸道免疫力,提高蛋雞生產(chǎn)性能并改善蛋品質(zhì)。