陳偉亮,張麗,張玲,劉文斌,李向飛

(南京農業(yè)大學動物科技學院江蘇省水產動物營養(yǎng)重點實驗室,江蘇 南京 210095)

糖類是重要的非蛋白能源物質,其不僅可為水產動物提供能量,還具有節(jié)約蛋白質和降低魚體氨氮排放的作用［1］。此外,部分糖類如淀粉等具有較強的黏結性,可以改善水產飼料的制粒效果和水穩(wěn)性［2］,并且飼料中添加適量糖類,可以改善水產動物生長性能,并降低餌料系數［3］。然而,與畜禽相比,水產動物對糖類的利用率相對較低。絕大多數魚類在葡萄糖負荷或攝食糖類后,常表現出持續(xù)的高血糖癥狀［4］,被認為是先天性的“糖尿病患者”［5］。此外,水產動物對糖類的利用率與其食性密切相關。通常,雜食性和草食性動物對糖類的耐受程度和利用能力均顯著高于肉食性動物［6］。除自身因素外,水產動物對糖類的利用率還受到糖類來源、種類、加工工藝及添加量等諸多營養(yǎng)因素的影響。因此,對魚體糖代謝機制及其營養(yǎng)調控技術的研究具有較大的現實及科學意義。

淀粉是配合飼料中的主要糖源,其來源及糊化程度均會顯著影響魚體生長性能和代謝機能［7］。研究表明,淀粉的物理特性,如一級結構、顆粒形狀、顆粒直徑和直鏈淀粉與支鏈淀粉比率等,均存在較大差異［8］,可顯著影響其營養(yǎng)價值和可利用率［9］。例如,黃鱸(Percaflavescens)適宜糖源為土豆淀粉和玉米淀粉,其攝食小麥淀粉后出現肝體比升高、肝臟脂肪沉積與肝細胞腫大等病理癥狀［10］。然而,在金頭鯛(Sparusaurata)中的研究發(fā)現,小麥淀粉組的生長性能和淀粉消化率顯著高于玉米淀粉,且升糖指數較低［11］。相較于生淀粉,預糊化淀粉可以顯著提高大口黑鱸(Micropterussalmoides)的增重率,降低餌料系數［12］。這表明不同物種的適宜糖源存在較大差異。此外,蒸煮和擠壓等處理方式均會改變淀粉的物理特性或復雜程度,繼而影響水產動物對其的利用率［13］。通常情況下,糊化可顯著增加淀粉的溶解度和吸水能力,使淀粉分子中的糖苷鍵充分暴露,進而增加淀粉與消化酶的接觸面積,并提高水產動物對其的消化率［14］。例如,糊化處理可顯著提高斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)對玉米淀粉的消化率［13］。然而,淀粉的糊化度并非越高越好。例如,完全使用糊化淀粉時,金頭鯛幼魚的生長性能和飼料利用率均明顯下降,而肝糖原含量顯著升高［15-16］。此外,日糧中添加35%的糊化淀粉,可顯著改善胡鲇(Clariasbatrachus)的生長性能并上調肌源性調節(jié)因子的表達,而45%的糊化淀粉可顯著促進脂肪生成并抑制魚體生長［17］。由此可見,淀粉來源及其糊化程度均會對水產動物生長性能與飼料利用率造成較大影響,且這種影響存在較大物種差異性。然而,相關研究大多僅局限于生長性能、養(yǎng)分利用率和消化酶活性等表觀指標,對魚體糖脂代謝機制的研究尚較缺乏。

團頭魴(Megalobramaamblycephala)又名武昌魚,是我國特有的淡水名優(yōu)經濟魚類。與雜食性和肉食性魚類相比,其對糖類的耐受能力相對較高。因此,飼料中往往添加較多糖類以節(jié)約蛋白質用量,進而降低飼料成本。實際生產中,淀粉是其飼料中的主要糖源,但不同淀粉來源及其糊化程度對魚體生長性能和糖脂代謝的影響尚不明確?；诖?本試驗旨在探討不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴生長性能、養(yǎng)分消化率和糖脂代謝的影響,為魚類糖代謝機制研究提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗飼料中的蛋白質由魚粉、豆粕、菜粕和棉粕等提供,脂肪由等量的豆油和魚油提供,糖類主要由純小麥淀粉和純玉米淀粉提供。試驗所用小麥淀粉與玉米淀粉均購自南京華牧動物科技研究所有限公司,純度≥99%。糊化淀粉的生產工藝為擠壓法,2種淀粉糊化程度相同。根據淀粉來源及其糊化程度的不同,將試驗飼料分為生小麥淀粉組(raw wheat starch,RW)、糊化小麥淀粉組(gelatinized wheat starch,GW)、生玉米淀粉組(raw corn starch,RC)和糊化玉米淀粉組(gelatinized corn starch,GC),分別添加20%相應淀粉。飼料原料粉碎后經60 mm篩網過濾。將飼料原料與外源指示劑-氧化釔(Macklin,純度≥99.9%)逐級混合均勻,噴灑適量的水,使用實驗室制粒機(MUZL 180,江蘇揚州牧揚集團有限公司)制粒。試驗飼料干燥后置于-20 ℃冰箱中冷藏備用。飼料配方及其概略養(yǎng)分含量如表1所示。

表1 飼料配方及其概略養(yǎng)分含量(風干基礎)Table 1 Formulation and proximate composition of the experimental feeds(air-dry basis) %

1.2 養(yǎng)殖試驗

試驗魚購自湖北鄂州團頭魴原種場。試驗前,用商品料(32%蛋白質和5%脂肪)飼喂2周,使其適應養(yǎng)殖條件。馴化后,選取初始體重為(19.95±0.14)g的團頭魴320尾,隨機分為4組,每組5重復,每個水箱16尾魚。養(yǎng)殖試驗在南京農業(yè)大學水產教學科研基地室內循環(huán)系統(tǒng)中進行,為期10周。期間,每日飽食投喂3次(07:00、12:00和17:00),并在投喂0.5 h后檢查殘餌剩余情況,進而對餌料系數進行校正。自來水養(yǎng)殖,全程微流水循環(huán)(2 L·min-1),水溫保持在(28±1)℃,溶解氧為5.0 mg·L-1,pH值7.0～7.5,總氨氮和亞硝酸鹽含量分別為0.2和0.01 mg·L-1,全天24 h充氧。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結束后,將魚禁食24 h以排空腸道內容物。使用濃度為100 mg·L-1的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(Sigma,美國)將魚麻醉,稱取每個水箱魚的質量并記錄尾數。每箱隨機取5尾魚(即每個處理25尾魚),尾靜脈采集血液置于肝素抗凝管中,離心(4 ℃,3 000g)10 min,吸取上清液轉移至離心管,保存于-20 ℃冰箱。此外,采集肝臟保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4 生長指標計算

生長性能計算公式如下:

存活率(survival rate,SR)=試驗結束時魚的尾數/初始魚的尾數×100%

(1)

增重率(weight gain rate,WGR)=(Wt-W0)/W0×100%

(2)

特定生長率(specific growth rate,SGR)=(lnWt-lnW0)/T×100%

(3)

采食量(feed intake,FI)=總采食量/魚的尾數

(4)

相對攝食率(relative feed intake,RFI,)=總采食量×2/［(W0+Wt)×T］×100%

(5)

餌料系數(feed conversion ratio,FCR)=總采食量/總增重

(6)

蛋白效率比(protein efficiency ratio,PER)=增重/蛋白攝入量

(7)

式中:W0為魚體初重(g);Wt為魚體末重(g);T表示試驗時間(d)。

1.5 飼料概略養(yǎng)分分析

飼料稱重后置于105 ℃烘箱中烘至恒重,計算水分含量;采用凱式定氮儀(FOSS KT260,瑞士)測定飼料中氮含量,并將其乘以6.25換算成粗蛋白含量;采用索氏抽提器于60～75 ℃水浴條件下使乙醚冷凝回流約12 h,測得粗脂肪含量;將飼料置于坩堝中灰化后,轉移至馬弗爐中550～600 ℃灼燒6 h,得出灰分含量;將樣品進行酸堿處理后,采用粗纖維分析儀(ANKOM A2000i,美國)測得飼料粗纖維含量;采用全自動量熱儀(PARR 1281,美國)測定飼料總能。

1.6 血漿生化指標測定

血漿葡萄糖(GLU)和甘油三酯(TG)含量測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,編號分別為A154-1-1與A110-1-1。其中,血糖測定采用葡萄糖氧化酶法［18］,甘油三酯測定參照McNamara等［19］的方法。

1.7 糞便收集及養(yǎng)分消化率測定

養(yǎng)殖試驗結束前7 d,進行收糞試驗。投喂結束1 h后,用尼龍網收集新鮮、成型且完整的糞便,將糞便自然風干后,置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。飼料和糞便中概略養(yǎng)分含量參照1.5節(jié)所示方法測定,Y2O3含量參考《稀土金屬及其氧化物中稀土雜質化學分析方法第1部分:鑭中鈰、鐠、釹、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、镥和釔量的測定:GB/T 18115.1—2020》的方法并采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(Thermo iCAP 7000,美國)測定。養(yǎng)分消化率計算公式如下:

干物質的表觀消化率=(1-Dy/Fy)×100%

(8)

營養(yǎng)物質的表觀消化率=［1-(Dy/Fy)/(F/D)］×100%

(9)

式中:Dy為飼料中Y2O3的含量(%);Fy為糞便中Y2O3的含量(%);D為飼料中營養(yǎng)物質的含量(%);F為糞便中營養(yǎng)物質的含量(%)。

1.8 肝臟糖原和脂肪含量測定

肝糖原含量參照Keppler［20］的方法測定,肝脂含量采用Folch等［21］的方法測定。

1.9 基因表達相關檢測方法

稱取肝臟樣品,按照Plus RNA Purification Kit(Invitrogen,美國)操作說明提取樣品中總RNA,并用吸光度法分別在260和280 nm處測定所提取RNA的純度和含量。

采用RT-PCR試劑盒(TaKaRa,日本)按照SYBR?Prime ScriptTM的操作說明將總RNA反轉錄。反轉錄后,對cDNA進行稀釋,用SYBR Green Ⅱ熒光試劑盒(TaKaRa,日本)進行RT-PCR擴增。使用QuantStudio7 Flex熒光定量PCR儀(Thermo Fisher,美國)測定糖脂代謝相關基因的轉錄水平。最后,用內參基因ef1α對目的基因的CT值進行均一化處理［22］,并使用2-ΔΔCT方法計算樣品中各基因的mRNA相對表達量。引物由上海Invitrogen公司合成,序列見表2。

表2 RT-PCR引物序列Table 2 Nucleotide sequences of the primers used by real-time PCR

1.10 數據統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴生長性能的影響

如表3所示,淀粉來源對存活率、終末體重、增重率、特定生長率、采食量、相對采食量、餌料系數和蛋白效率比等均無顯著影響(P>0.05),而糊化程度顯著影響除餌料系數和蛋白效率比外的其他指標(P<0.05)。其中,生淀粉組的增重率、特定生長率和采食量均顯著高于糊化淀粉組(P<0.05)。此外,二者交互作用顯著影響增重率、特定生長率和采食量(P<0.05),且三者均以生玉米淀粉組最高。

2.2 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴養(yǎng)分消化率的影響

如表4所示,淀粉來源對各養(yǎng)分表觀消化率均無顯著影響(P>0.05),而糊化程度顯著影響干物質消化率(P<0.05)。其中,生淀粉組干物質消化率顯著低于糊化淀粉組(P<0.05)。此外,二者的交互作用顯著影響干物質消化率(P<0.05),且生小麥淀粉組干物質消化率最低。

表4 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴養(yǎng)分消化率的影響Table 4 Effects of different starch sources and gelatinization degrees on the nutrients digestibility of blunt snout bream

2.3 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴血漿生化指標的影響

如表5所示,淀粉來源對血漿葡萄糖和甘油三酯含量均無顯著影響(P>0.05),而糊化程度顯著影響血糖含量(P<0.001)。其中,糊化淀粉組血糖含量顯著高于生淀粉組(P<0.05)。此外,二者的交互作用顯著影響血糖水平(P<0.001),且糊化玉米淀粉組最高。

表5 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴血漿生化指標的影響Table 5 Effects of different starch sources and gelatinization degrees on the plasma metabolites of blunt snout bream

2.4 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴肝臟糖原和脂肪含量的影響

如表6所示,淀粉來源對肝臟糖原和脂肪含量均無顯著影響(P>0.05),而糊化程度顯著影響肝糖原含量(P<0.01)。其中,糊化淀粉組肝糖原含量顯著高于生淀粉組(P<0.01)。此外,二者交互作用顯著影響肝糖原含量其中(P<0.05),且以糊化玉米淀粉組為最低。

表6 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴肝糖原和脂肪含量的影響Table 6 Effects of different starch sources and gelatinization degrees on the liver glycogen and lipid contents of blunt snout bream

2.5 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴肝臟糖脂代謝相關基因表達的影響

從圖1和2可見,淀粉來源、糊化程度及其二者交互作用對glut2、gk、pk、g6pase、fbpase、gs、cpt-Ⅰ和aco基因的表達量均無顯著影響(P>0.05)。淀粉來源極顯著影響fas的表達量(P<0.001),且小麥淀粉組極顯著低于玉米淀粉組(P<0.001)。糊化程度顯著影響g6pdh、fas和accα的表達量(P<0.05),且糊化淀粉組顯著高于生淀粉組(P<0.05)。此外,二者交互作用極顯著影響g6pdh和fas表達量(P<0.001),且糊化玉米淀粉組g6pdh、fas和accα表達量最高。

圖1 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴肝臟糖代謝相關基因表達的影響Fig.1 Effects of different starch sources and gelatinization degrees on the expression of glucose metabolism-related genes in blunt snout bream 1)盒子的上線和下線代表第一和第三四分位數,中間的線代表中位數,上下線代表的最大值和最小值;2)柱子上方不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。1)The upper and lower limits of the box represent the first and third quartiles. The horizontal line inside the box represents the second quartile(median). Whiskers represent the maximum and minimum values. 2)Bars with different lower-case letters indicate significant difference(P<0.05). The same below.

圖2 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴肝臟脂肪代謝相關基因表達的影響Fig.2 Effects of different starch sources and gelatinization degrees on the expression of lipid metabolism-related genes in blunt snout bream

3 討論

3.1 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴生長性能與養(yǎng)分消化率的影響

本試驗中,糊化淀粉組的干物質消化率顯著高于生淀粉組,而蛋白質與脂肪的消化率也呈現類似結果,但無顯著差異。這與虹鱒(Oncorhynchusmykiss)對不同淀粉源利用率的結果相同［27］,說明糊化能提高水產動物對淀粉的消化率。究其原因,可能有以下兩點:1)糊化使淀粉分子內α-1,4-糖苷鍵斷裂,產生大量小分子糖類如葡萄糖、麥芽糖與糊精等,進而提高了其消化率［28］;2)糊化處理過程中淀粉離開模具的瞬間壓力驟降、水分大量蒸發(fā),使得淀粉顆粒內部產生大量空泡［29］,這有利于淀粉酶滲透進入淀粉顆粒,從而提高其消化率。此外,葡萄糖與其他養(yǎng)分(如氨基酸)的吸收均需要以鈉離子為主的偶聯轉運載體參與［30］,其吸收過程可能存在協同效應,進而促進蛋白質與脂肪的消化吸收。然而,本試驗中生淀粉組的增重率、特定生長率和采食量顯著高于糊化淀粉組?？赡苡捎诤矸圻M入腸道后被快速消化吸收,短時間內釋放大量葡萄糖進入血液,而魚體相關代謝酶的生理響應存在一定滯后性,導致餐后持續(xù)高血糖癥狀［31-32］,增加了魚體代謝負擔進而導致攝食量下降,最終影響其生長性能。另外,糊化淀粉具有較強的黏性［33］,可增加食糜在腸道中的潴留時間,增強魚體飽腹感,從而降低采食量和生長性能。此外,淀粉來源與糊化程度的交互作用顯著影響干物質消化率、增重率、特定生長率和采食量。使用玉米和小麥淀粉作為糖源時,糊化處理對上述指標的影響不同?？赡苁怯捎诙咧辨湹矸叟c支鏈淀粉的比例不同,直鏈淀粉與脂質形成的具有抗酶解作用的復合物含量也不盡相同［34］,進而影響水產動物對養(yǎng)分的利用率。

3.2 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴血漿生化指標及肝臟糖原與脂肪含量的影響

本試驗中,糊化淀粉組血糖水平與肝糖原含量均顯著高于生淀粉組,說明攝食糊化淀粉后魚體更傾向于將葡萄糖合成肝臟糖原以維持血糖穩(wěn)態(tài)。這與金頭鯛對不同糖源利用率的結果相似［35］。究其原因,可能在于糊化淀粉結構相對松散且對淀粉酶的敏感性較高,腸道對其消化和吸收率較高,導致魚體出現餐后高血糖癥狀;而血糖升高會誘導胰島素合成和釋放,進而促進糖原合成與沉積［36］。過量的肝糖原沉積可導致肝臟病理性變化,進而影響魚體代謝機能和生長。然而,對虹鱒的研究發(fā)現,糊化淀粉首先誘導了肝臟脂肪合成,而肝糖原含量在養(yǎng)殖1個月后顯著升高［37］?？赡苡捎隰~類食性差異所導致的糖代謝調控策略不同。本研究中,淀粉來源與糊化程度的交互作用顯著影響血糖水平與肝糖原含量,且二者均以糊化玉米淀粉組最高?？赡苡捎诤衩椎矸鄣睦寐瘦^高,其在消化道被消化吸收后,大量葡萄糖迅速進入血液進而導致餐后高血糖癥狀［38］。較高的血糖水平可能超過魚體的承受范圍,造成魚體代謝障礙,表現出較慢的生長速度。此外,過高的血糖水平可激活肝臟糖原合成途徑,導致糖原大量生成以維持機體血糖穩(wěn)態(tài)［39］。因此,以上結果表明,糊化淀粉可提高魚體血糖水平并促進肝糖原蓄積,進而導致機體代謝負擔,這可能是其消化率提高,但生長性能降低的部分原因。

3.3 不同淀粉來源及其糊化程度對團頭魴肝臟糖脂代謝相關基因表達的影響

本試驗中,不同淀粉來源僅顯著影響肝臟fas表達,且小麥淀粉組最低。這表明,與玉米淀粉相比,長期飼喂小麥淀粉可抑制魚體脂肪合成,并降低魚體脂肪沉積。研究表明,FAS是機體脂肪酸從頭合成過程中的限速酶,其轉錄水平可反映機體脂肪合成程度［40］。因為玉米淀粉中直鏈淀粉含量高于小麥淀粉,而團頭魴為淡水草食性魚類,對直鏈淀粉利用率相對較高。大量攝入高利用率淀粉會激活魚體脂質合成途徑,繼而促進脂肪合成與沉積［41］。此外,糊化淀粉組g6pdh、fas與accα的表達水平均顯著高于生淀粉組。這表明,與生淀粉相比,攝食糊化淀粉可顯著促進魚體脂肪合成。與fas類似,accα也是脂肪酸從頭合成的限速酶;而g6pdh是磷酸戊糖途徑中的關鍵酶,該途徑生成的NADPH是脂肪酸從頭合成的重要能量來源［40］。g6pdh、fas與accα表達水平的高低在一定程度上反映魚體脂肪合成能力的變化［42］。因為糊化處理提高了淀粉利用率,進而促進了魚體脂肪合成。然而,各組血漿甘油三酯水平并無明顯差異,表明合成的脂肪可能主要以脂滴形式沉積在肝臟等組織中［43］。另外,淀粉來源與糊化程度的交互作用顯著影響g6pdh、fas與accα基因的表達,且三者均以糊化玉米淀粉組最高。推測原因,可能在于糊化玉米淀粉的利用率較高,其在機體內產生大量葡萄糖,激活了魚體脂肪合成途徑,致使脂肪大量生成以調節(jié)機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)。此外,糊化淀粉組肝糖原含量顯著高于其他組,而各組間的gs表達水平并無顯著差異。其原因可能在于gs活性受到翻譯后修飾的調控,導致其轉錄水平與酶活性之間的結果不吻合［44］。然而,具體調控機制尚需進一步研究。

本研究結果表明,淀粉糊化程度對團頭魴的生長性能、養(yǎng)分消化率和糖脂代謝均有顯著影響,而淀粉來源的影響相對較小。綜合來看,生玉米淀粉組增重率和干物質消化率較高,而血糖水平及糖原與脂肪沉積較低,更適合作為團頭魴的糖源。