王楊,王苗苗,單保森,吳望軍,杜星,李齊發(fā)

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)作為一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸(nt)的功能性RNA分子,通常被認(rèn)為不具備編碼蛋白的能力,而是以RNA的形式在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)［1-3］。依據(jù)基因組上與鄰近蛋白編碼基因的位置關(guān)系,可將lncRNA分為同義lncRNA(SS-lncRNA)、反義lncRNA(AS-lncRNA)、雙向型lncRNA(BD-lncRNA)、基因間lncRNA(LincRNA)和內(nèi)含子lncRNA(IT-lncRNA)等［1］。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用,哺乳動(dòng)物中越來(lái)越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn),其功能也被注釋,lncRNA在哺乳動(dòng)物許多生理和病理過(guò)程中的重要調(diào)控作用也逐漸引起人們的關(guān)注［4］。在雌性生殖系統(tǒng)中,lncRNA在多種相關(guān)組織(如下丘腦、垂體、卵巢和子宮等)中分布,通過(guò)多種機(jī)制參與卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟、排卵、妊娠和胚胎發(fā)育等多個(gè)生殖過(guò)程的調(diào)控［5］。例如,在人卵巢顆粒細(xì)胞(granulosa cell,GC)中高表達(dá)的HLA復(fù)合群26(lncRNAHCG26)表達(dá)水平與卵泡數(shù)有關(guān),敲減HCG26可抑制GC增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程,同時(shí)影響芳香化酶基因的表達(dá)和雌二醇的生成［6］;小鼠卵中l(wèi)ncRNA類固醇受體RNA激活劑(SRA)能夠刺激GC的生長(zhǎng),增加雌激素和孕激素水平［7］;在豬閉鎖卵泡中高度表達(dá)的lncRNANORHA能夠通過(guò)miR-183簇/FoxO1軸誘導(dǎo)GC凋亡［8］。此外,lncRNA H19印記母源表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(H19)被證實(shí)是影響胚胎發(fā)育的主要調(diào)節(jié)因子,可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-675的加工來(lái)抑制胎盤發(fā)育［9］,其失調(diào)會(huì)引起孕酮生成異常［10］,引起胎兒生長(zhǎng)［11］以及妊娠［12］中相關(guān)疾病的發(fā)生;Mira通過(guò)將Mll1募集到染色質(zhì)來(lái)激活小鼠胚胎干細(xì)胞中同源框A6(Hoxa6)和同源框A7(Hoxa7)的轉(zhuǎn)錄,對(duì)胚胎早期發(fā)育至關(guān)重要［13］;小鼠卵母細(xì)胞特異性表達(dá)lncRNA(Rose)在卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂和早期胚胎發(fā)育的母源-合子轉(zhuǎn)換(maternal-zygotic transition,MZT)中具有重要的調(diào)節(jié)作用［14］。這些結(jié)果均表明 lncRNA在卵泡發(fā)育和雌性生殖中具有重要作用。

不斷改善和提高家畜的生產(chǎn)性能是家畜育種的根本目標(biāo),而篩選與家畜生產(chǎn)性能有關(guān)的重要經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因和遺傳標(biāo)記對(duì)于加快實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo)具有重要意義。雖然目前鑒定的影響家畜重要經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因基本都是蛋白編碼基因,但研究證實(shí)lncRNA在家畜重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的細(xì)胞功能中也發(fā)揮與蛋白編碼基因相似的功能,如lncRNA肌肉生長(zhǎng)促進(jìn)因子(lncMGPF)與豬產(chǎn)肉性狀候選基因Ⅰ類肌球蛋白(MyoD)(前者是后者的靶標(biāo))均可誘導(dǎo)肌細(xì)胞的肌源性分化［15］,與卵泡閉鎖相關(guān)lncRNA(NORFA)和母豬繁殖性狀候選基因轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2(TGFBR2)(后者是前者的靶標(biāo))均可抑制GC凋亡［16］,因此可以看出lncRNA也可以作為家畜重要經(jīng)濟(jì)性狀的潛在候選基因。Lv等［15］以lncMGPF為潛在候選基因,在美系大白豬lncMGPF基因中發(fā)現(xiàn)10個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP),這些SNP均與產(chǎn)肉性狀(背膘厚和眼肌面積)顯著關(guān)聯(lián),證實(shí)lncMGPF是影響豬產(chǎn)肉性狀的關(guān)鍵lncRNA基因。Du等［16］以NORFA為潛在候選基因,利用DNA混池測(cè)序法在豬NORFA基因中發(fā)現(xiàn)6個(gè)變異位點(diǎn),其中啟動(dòng)子19 bp序列拷貝變異表現(xiàn)出品種特異性,在高繁殖力豬種(二花臉豬)中為雙拷貝,在國(guó)外引進(jìn)豬種大白豬和長(zhǎng)白豬中為單拷貝,認(rèn)為NORFA是影響高繁殖力性狀的候選lncRNA基因。但目前發(fā)現(xiàn)的影響家畜重要經(jīng)濟(jì)性狀的候選lncRNA基因較少。本課題組前期研究證實(shí)lncRNABRE-AS是豬卵泡閉鎖和GC凋亡的重要調(diào)節(jié)因子［17］,且位于母豬繁殖性狀的QTL(quantitative trait locus)內(nèi)。因此,本試驗(yàn)擬以BRE-AS為潛在候選基因,采用DNA測(cè)序法分離其啟動(dòng)子負(fù)調(diào)控區(qū)(PNRR)序列、篩選SNP,采用一般線性模型(GLM)分析SNP與大白豬繁殖性狀之間的關(guān)系,采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析其機(jī)制,評(píng)估BRE-AS作為母豬繁殖性狀候選lncRNA基因的可行性,以期為母豬繁殖性狀的分子育種提供遺傳標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

用于基因組DNA提取、基因分型及與繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析的315份大白母豬耳組織樣來(lái)自常州康樂(lè)農(nóng)牧有限公司種豬場(chǎng),詳細(xì)記錄每頭母豬的繁殖性能。基因組 DNA的提取采用常規(guī)的酚/氯仿抽提法。

1.2 引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、測(cè)序和生物信息學(xué)分析

根據(jù)本課題組前期分離的豬BRE-AS基因5′調(diào)控區(qū)序列和鑒定的PNRR［17］,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增大白豬BRE-AS基因PNRR序列的引物P1和P2(表1)。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序見(jiàn)文獻(xiàn)［18］。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后委托生工生物工程(上海)公司測(cè)序。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲取杜洛克豬基因組中的目標(biāo)序列。利用JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)預(yù)測(cè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),利用miRDB((http://mirdb.org/)預(yù)測(cè)序列中潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。

表1 豬BRE-AS基因啟動(dòng)子擴(kuò)增的引物序列Table 1 Sequences of the primers for amplification of the promoter of the porcine BRE-AS gene

1.3 SNP的篩選、分型與關(guān)聯(lián)分析

將16頭大白豬基因組 DNA 等量混勻,構(gòu)建 DNA 池。以池 DNA 為模板,利用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)合格后委托生工生物工程(上海)公司測(cè)序,篩選SNP。利用DNA測(cè)序法對(duì)每頭母豬進(jìn)行分型。根據(jù)文獻(xiàn)［19］中的方法計(jì)算基因型頻率等參數(shù),進(jìn)行哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)和關(guān)聯(lián)分析。

1.4 載體的構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

不同單倍體型PNRR熒光素酶報(bào)告載體由南京擎科生物科技有限公司合成。將液氮罐中儲(chǔ)存的人GC系(KGN)取出,放入水浴鍋中,37 ℃復(fù)蘇55 min,再置于15 mL滅菌的離心管中,常溫下1 000 r·min-1離心5 min,然后接種于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)的T25瓶?jī)?nèi),置于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿瓶壁約90%時(shí),用胰蛋白酶消化2 min,加入等量1640培養(yǎng)基并終止消化,轉(zhuǎn)移至15 mL離心管,離心后棄上清液,再用1640培養(yǎng)基重懸,均勻接種12孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞量長(zhǎng)滿約90%時(shí),用Highgene試劑(ABclonal公司)轉(zhuǎn)染報(bào)告載體。

1.5 熒光素酶活性分析

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,使用100 μL Passive Lysis Buffer裂解液(Vazyme公司)裂解細(xì)胞。在避光條件下,用酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)測(cè)量每個(gè)樣品的螢火蟲(chóng)熒光和海腎熒光并計(jì)算兩者的比值。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 大白豬BRE-AS基因PNRR擴(kuò)增與序列分析

大白豬BRE-AS基因PNRR序列長(zhǎng)度為792 bp,與參考基因組(杜洛克豬)相應(yīng)序列的一致性為100%(圖1-A、B)。大白豬BRE-AS基因PNRR序列由31.4%的堿基A、26.1%的堿基T、22.2%的堿基G和20.3%的堿基C組成。用JASPAR在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)豬BRE-AS基因PNRR含有多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子(如OTX2、ASCL1、LIN54和MXI1等)結(jié)合元件,用miRDB在線工具預(yù)測(cè)到多個(gè)潛在的miRNA(如miR-466、miR-4533和miR-6165等)結(jié)合元件(圖1-B)。

圖1 豬BRE-AS基因PNRR序列Fig.1 Sequence of the porcine BRE-AS PNRR A. 豬BRE-AS基因PNRR結(jié)構(gòu)示意圖Schematic diagram of the porcine BRE-AS PNRR;B. 豬BRE-AS基因PNRR序列Sequence of the porcine BRE-AS PNRR. 加粗堿基為順式作用元件The bold bases indicate cis-acting elements.

2.2 大白豬BRE-AS基因PNRR上SNP篩選與多態(tài)性分析

2.2.1 SNP篩選利用DNA混池(n=16)測(cè)序法篩選大白豬BRE-AS基因PNRR上的SNP,結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有2個(gè)SNP,分別是位于-794 nt處的T>G單堿基突變和位于-756 nt處的A>C單堿基突變。根據(jù)規(guī)則將這2個(gè)SNP分別命名為g.-794T>G位點(diǎn)和g.-756A>C位點(diǎn)。

2.2.2 g.-794T>G位點(diǎn)多態(tài)性分析利用DNA測(cè)序法對(duì)大白豬群體(n=315)g.-794T>G位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種基因型,分別為TT、TG和GG型,其中TT型為優(yōu)勢(shì)基因型,基因型頻率為0.752(圖2-A、B)。等位基因頻率計(jì)算結(jié)果顯示,T為優(yōu)勢(shì)等位基因,等位基因頻率為0.863(圖2-C)?？ǚ綑z驗(yàn)顯示大白豬群體g.-794T>G位點(diǎn)的基因型分布符合哈代-溫伯格平衡定律(P>0.05)。

圖2 大白豬BRE-AS基因PNRR上SNP多態(tài)性分析Fig.2 Polymorphism analysis of SNP in BRE-AS PNRR of Yorkshire pigs A—C. g.-794T>G位點(diǎn)不同基因型峰圖(A)、基因型頻率(B)和等位基因頻率(C)Peaks(A),genotype frequency(B)and allele frequency(C)of different genotypes for SNP g.-794T>G;D—F. g.-756A>C位點(diǎn)不同基因型峰圖(D)、基因型頻率(E)和等位基因頻率(F)Peaks(D),genotype frequency(E)and allele frequency(F)of different genotypes for SNP g.-756A>C.

2.2.3 g.-756A>C位點(diǎn)多態(tài)性分析在大白豬群體(n=315)中g(shù).-756A>C位點(diǎn)也存在3種基因型,即AA、AC和CC型,其中AA型為優(yōu)勢(shì)基因型,基因型頻率為0.759(圖2-D、E);A為優(yōu)勢(shì)等位基因,等位基因頻率為0.868(圖2-F)。大白豬群體g.-756A>C位點(diǎn)的基因型分布也符合哈代-溫伯格平衡定律(P>0.05)。

2.3 大白豬BRE-AS基因PNRR上SNP多態(tài)性與母豬繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析

2.3.1 g.-794T>G位點(diǎn)多態(tài)性與母豬繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析為了研究BRE-AS基因g.-794T>G位點(diǎn)變異與母豬繁殖性狀的關(guān)系,利用GLM模型分別對(duì)g.-794T>G位點(diǎn)多態(tài)性與大白豬群體6個(gè)繁殖性狀等進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。如圖3-A所示:g.-794T>G位點(diǎn)多態(tài)性與大白豬總產(chǎn)仔數(shù)(TNB)、產(chǎn)活仔數(shù)(NBA)和健仔數(shù)(NSP)等性狀顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05),其中TT型母豬TNB、NBA和NSP均顯著高于GG型母豬(P<0.05)。其他性狀各基因型間無(wú)顯著差異(P>0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明BRE-AS是大白豬TNB、NBA和NSP等繁殖性狀的候選基因。

圖3 BRE-AS基因PNRR上g.-794T>G突變(A)和g.-756A>C突變(B)與大白豬繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析Fig.3 Association analysis of the g.-794T>G mutation(A)and g.-756A>C mutations(B) in BRE-AS PNRR with Yorkshire pigs TNB:總產(chǎn)仔數(shù)Total number of piglets born;NBA:產(chǎn)活仔數(shù)Number of piglets born alive;NSP:健仔數(shù)Number of strong pigs;NWP:弱仔數(shù)Number of weak pigs;NSB:死胎數(shù)Number of stillborn;LW:出生窩重Litter weight.不同大小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和差異顯著(P<0.05)。下同。Significant differences among the groups are indicated by different uppercase letters(P<0.01)or lowercase letters (P<0.05). The same below.

2.3.2 g.-756A>C位點(diǎn)多態(tài)性與母豬繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析BRE-AS基因g.-756A>C位點(diǎn)多態(tài)性與大白豬群體6個(gè)繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如圖3-B所示。BRE-AS基因g.-756A>C位點(diǎn)多態(tài)性與大白豬TNB、NBA和NSP這3個(gè)繁殖性狀間極顯著關(guān)聯(lián)(P<0.01),其中AA型母豬的TNB、NBA和NSP極顯著高于CC型母豬(P<0.01),AC型母豬的TNB極顯著高于CC型母豬(P<0.01),NBA和NSP顯著高于CC型母豬(P<0.05)。其他性狀各基因型間無(wú)顯著差異(P>0.05)。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明BRE-AS是大白豬TNB、NBA和NSP等繁殖性狀的候選基因。

2.4 大白豬BRE-AS基因PNRR上SNP合并基因型與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.4.1 SNP位點(diǎn)單倍型分析對(duì)BRE-AS基因PNRR上SNP(g.-794T>G和g.-756A>C)進(jìn)行聯(lián)合分析,結(jié)果在大白豬群體中發(fā)現(xiàn)3種合并基因型(TT/AA、TG/AC和GG/CC型),其中TT/AA型為優(yōu)勢(shì)合并基因型,合并基因型頻率為0.760(圖4-A)。此外,在大白豬群體中共發(fā)現(xiàn)2種單倍型,T-A型和G-C型,其中T-A型是優(yōu)勢(shì)單倍型,單倍體型頻率為0.869(圖4-B)。

圖4 大白豬BRE-AS基因PNRR上SNP合并基因型與大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析Fig.4 Association analysis between combined genotype for SNP in BRE-AS PNRR and reproductive traits in Yorkshire pigs A.合并基因型頻率Frequency of combined genotypes;B.單倍型頻率Haplotype frequency;C.合并基因型與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析Association analysis between the combined genotypes and reproductive traits.

2.4.2 合并基因型與母豬繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如圖4-C所示:BRE-AS基因PNRR上2個(gè)SNP合并基因型與大白豬TNB、NBA和NSP等繁殖性狀顯著或極顯著關(guān)聯(lián),其中TT/AA型和GT/CA型母豬的TNB極顯著高于GG/CC型母豬(P<0.01);TT/AA型母豬的NBA極顯著高于GG/CC型母豬(P<0.01),GT/CA型母豬的NBA顯著高于GG/CC型母豬(P<0.05);TT/AA型母豬的NSP顯著高于GG/CC型母豬(P<0.05);其他性狀間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.5 PNRR上SNP對(duì)BRE-AS啟動(dòng)子活性的影響

為了分析豬BRE-AS基因PNRR上SNP是否通過(guò)調(diào)控啟動(dòng)子活性來(lái)影響大白豬繁殖性能,本試驗(yàn)構(gòu)建了BRE-AS基因SNP(g.-794T>G和g.-756A>C位點(diǎn))的2種單倍體型PNRR熒光素酶報(bào)告載體pGL3-T-A和pGL3-G-C(圖5-A)。將空載 pGL3-basic 和 pGL3-T-A、pGL3-G-C分別與pRL-TK共轉(zhuǎn)KGN細(xì)胞。結(jié)果(圖5-B)發(fā)現(xiàn),pGL3-G-C的熒光素酶活性極顯著高于pGL3-T-A(P<0.01),說(shuō)明BRE-AS基因PNRR上SNP影響豬GC中促凋亡因子BRE-AS的轉(zhuǎn)錄活性。

圖5 PNRR上SNP對(duì)BRE-AS啟動(dòng)子活性的影響Fig.5 The effect of SNP in PNRR on BRE-AS promoter activity A.2個(gè)單倍型PNRR報(bào)告載體示意圖Schematic diagram of reporter vectors of PNRR with different haplotypes;B.熒光素酶活性Luciferase activity.**P<0.01.

3 討論

SNP主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,與基因表達(dá)、功能、表型和疾病等有關(guān)［20］。在畜牧領(lǐng)域,許多重要功能基因上的SNP被證實(shí)與畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀有關(guān),成為畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀分子育種(如標(biāo)記輔助選擇育種、基因組選擇育種和基因編輯育種等)的遺傳標(biāo)記。例如,美利奴羊胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1R)基因第3外顯子c.654G>A位點(diǎn)多態(tài)性與生長(zhǎng)、體型、屠宰和肉質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)［21］;蘇淮豬骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP7)基因3′-UTR上c.*273A>G位點(diǎn)多態(tài)性與母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀顯著關(guān)聯(lián)［22-23］;揚(yáng)州鵝泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)基因啟動(dòng)子c.-652C>T位點(diǎn)多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)［24］。但目前鑒定的與畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP絕大多數(shù)都位于蛋白編碼基因上,而非編碼基因上的極少。本文在本實(shí)驗(yàn)室前期證實(shí)BRE-AS為豬卵泡閉鎖和GC凋亡的重要功能AS-lncRNA的基礎(chǔ)上,在其PNRR上鑒定2個(gè)與母豬繁殖性狀(包括TNB、NBA和NSP)顯著關(guān)聯(lián)的SNP(g.-794T>G和g.-756A>C),進(jìn)一步證實(shí)BRE-AS是母豬繁殖性狀的候選基因。此前鑒定的影響母豬繁殖力的候選lncRNA只有NORFA［16］。另外,在其他畜禽lncRNA上還發(fā)現(xiàn)了一些與重要經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的SNP,如Yu等［25］發(fā)現(xiàn)lncRNA母系表達(dá)基因3(MEG3)基因4個(gè)SNP與豬肉質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián);Mi等［26］發(fā)現(xiàn)lncRNA祖細(xì)胞更新相關(guān)非編碼RNA(PRANCR)上的1個(gè)A>G突變與奶牛金黃色葡萄球菌乳腺炎抗性性狀顯著關(guān)聯(lián);Mei等［27］發(fā)現(xiàn)lncRNApouBW1基因啟動(dòng)子n.830G>A與雞的生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián);Li等［28］發(fā)現(xiàn)lncRNA肝臟甘油三酯合成調(diào)節(jié)因子(LTR)上c.242G>A與雞生長(zhǎng)和胴體性狀顯著相關(guān)?？傊?占基因組序列98%以上的非編碼區(qū)正在逐漸成為畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀遺傳標(biāo)記挖掘的熱點(diǎn)目標(biāo)區(qū)域。

畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的關(guān)鍵功能基因5′-調(diào)控區(qū)上的SNP往往通過(guò)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)發(fā)揮作用［29］。Wang等［24］發(fā)現(xiàn)與鵝生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的c.-652C>T突變?cè)鰪?qiáng)UCHL1基因的啟動(dòng)子活性。骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B(BMPR1B)基因第1內(nèi)含子中與母豬繁殖性狀顯著關(guān)聯(lián)的4個(gè)SNP組成的單倍型中,二花臉豬特異的單倍型調(diào)控區(qū)活性顯著高于杜洛克豬特異的單倍型［30］。5′調(diào)控區(qū)SNP影響基因轉(zhuǎn)錄活性,一般通過(guò)改變轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合親和力來(lái)實(shí)現(xiàn)［31-32］。Du等［16］在二花臉豬lncRNANORFA啟動(dòng)子中檢測(cè)到的雙拷貝19 bp序列,主要通過(guò)募集更多轉(zhuǎn)錄因子核因子I X(NFIX)來(lái)增強(qiáng)GC中NORFA的轉(zhuǎn)錄活性;Zheng等［33］利用GWAS方法鑒定了奶牛乳脂性狀的一個(gè)重要的候選基因核糖體蛋白L8(RPL8),發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子g.-931G>T突變通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子Pax6和RPL8啟動(dòng)子上結(jié)合位點(diǎn)的互作來(lái)改變RPL8基因的轉(zhuǎn)錄活性。本研究發(fā)現(xiàn),PNRR上g.-794T>G和g.-756A>C變異可引起GC中l(wèi)ncRNABRE-AS基因轉(zhuǎn)錄活性的改變,其中T-A單倍型啟動(dòng)子活性低于G-C單倍型,這與TT/AA基因型母豬繁殖力高于GG/CC母豬型母豬,以及本實(shí)驗(yàn)室前期證實(shí)lncRNABRE-AS是母豬繁殖力限制因子［14］等結(jié)果是一致的。但本文并未檢測(cè)到BRE-AS基因PNRR上SNP可引起雌性生殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的改變,因此關(guān)于SNP影響B(tài)RE-AS啟動(dòng)子活性的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

總之,本試驗(yàn)獲得了大白豬lncRNABRE-AS基因PNRR序列,發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與母豬繁殖性狀(如TNB、NBA和NSP等)顯著關(guān)聯(lián)的SNP g.-794T>G和g.-756A>C,初步闡明了2個(gè)SNP影響母豬繁殖力的分子機(jī)制(增強(qiáng)母豬繁殖力抑制因子BRE-AS的轉(zhuǎn)錄活性)。結(jié)合前期功能研究結(jié)果［17］,證實(shí)BRE-AS是第2個(gè)被發(fā)現(xiàn)的影響母豬繁殖性狀的功能lncRNA,而鑒定出的2個(gè)SNP(g.-794T>G和g.-756A>C)均可作為母豬繁殖性狀分子育種的潛在遺傳標(biāo)記。