王 龍

(中國科學(xué)院 微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗室,北京100101)

1 引言

籃狀菌屬(TalaromycesC.R. Benj.)真菌廣泛分布于陸地、水體(淡水和海水)、空氣等環(huán)境,是自然界物質(zhì)循環(huán)中的重要分解者?；@狀菌的無性階段一般形成對稱雙輪生帚狀枝(symmetrical biverticillate penicillus)的產(chǎn)分生孢子結(jié)構(gòu),即在分生孢子梗莖(孢梗莖)頂端產(chǎn)生簇生的、大小相近的梗基(metula),在?；敹水a(chǎn)生簇生的、大小相近的披針形瓶梗(phialide),梗基和瓶梗均呈軸對稱排列,在瓶梗頂端產(chǎn)生向基性生的鏈狀排列的分生孢子。若產(chǎn)生有性繁殖結(jié)構(gòu),則會形成裸囊殼(gymnothecium)型子囊果,內(nèi)含無規(guī)則排列的球形至橢球形子囊,子囊壁較薄,易消解,每個子囊內(nèi)含8個子囊孢子,子囊孢子通常呈橢球形,壁通常粗糙[1, 2]。

目前,基于3個蛋白質(zhì)基因序列,即β-tubulin gene(BenA)、calmodulin gene(CaM)、DNA-dependent RNA polymerase II second largest subunit gene(Rpb2)和rDNA ITS1-5.8S-ITS2(ITS)序列的分析,籃狀菌屬被劃分為8個組(section),即桿孢籃狀菌組(sect.BacillisporiYilmaz, Frisvad &Samson、sect.HeliciYilmaz, Frisvad &Samson)、島籃狀菌組(sect.Islandici(Pitt) Yilmaz, Frisvad &Samson)、紫籃狀菌組(sectPurpureiStolk &Samson)、近膨籃狀菌組(sect.SubinflatiYilmaz, Frisvad &Samson)、籃狀菌組(sect.Talaromyces)、糙刺孢籃狀菌組(sect.TrachypermiYaguchi &Udagawa)和細?；@狀菌組(sect.TenuesB.D. Sun, A.J. Chen, Houbraken &Samson),籃狀菌屬目前已報道約200種[2-8]。

糙刺孢籃狀菌組是籃狀菌屬中已發(fā)現(xiàn)物種較多的組,該組全球已報道36種,我國僅發(fā)現(xiàn)12個種[4-7, 9-12]。該組物種通常生長局限,一般形成雙輪生和/或三輪生帚狀枝的無性產(chǎn)孢結(jié)構(gòu),少數(shù)還兼有單輪生帚狀枝,有些種會產(chǎn)生白色或黃白色裸囊殼型的有性繁殖結(jié)構(gòu)。少數(shù)種產(chǎn)生嗜氮酮類色素(azaphilones),呈紅色可溶性色素擴散到培養(yǎng)基中,或只存在于菌絲內(nèi)而不擴散的培養(yǎng)基中,使得菌落背面呈紅色,如白雙輪籃狀菌(T.albobiverticillius(H.M. Hsieh, Y.M. Ju &S.Y. Hsieh) Samson, N. Yilmaz, Frisvad &Seifert),暗玫瑰籃狀菌(T.atroroseusN. Yilmaz, Frisvad, Houbraken &Samson),紅色素籃狀菌(T.rubrifaciensW.W. Gao)等。該類色素結(jié)構(gòu)類似于橙色或紅色紅曲色素(orange or redMonascuspigments),如絲紅素(mitorubrin)、暗玫瑰素(atrorosin),而且上述這三個種均不產(chǎn)真菌毒素,因此它們具有用于開發(fā)食用色素的潛力[13, 14]。

本文報道該組的我國兩個新記錄種,即熱微黃籃狀菌(T.calidominioluteusHoubraken &Pyrri)和卡迪斯籃狀菌〔T.gaditanus(C. Ramírez and A.T. Martínez) Houbraken and Soccio〕,其中卡迪斯籃狀菌產(chǎn)生紅色可溶性色素。

2 材料與方法

2.1 菌株分離

土壤樣品中真菌的分離采用倍比稀釋涂布平皿法[15, 16],即將樣品碾碎混勻,取約1 g樣品放入裝有9 mL滅菌的0.1%瓊脂水溶液的大試管中,搖勻成懸濁液,作為第一稀釋度,然后取該稀釋度的懸濁液1 mL倒入第二個同樣的大試管中搖勻,作為第二稀釋度,依此類推直到第五個稀釋度,取最后兩個連續(xù)的稀釋度的懸濁液約1 mL傾倒于氯硝胺虎紅氯霉素瓊脂培養(yǎng)基(Dichloran rose bengal chloramphenicol agar,DRBC)上,用無菌涂布棒均勻涂布,于25 ℃倒置培養(yǎng),等菌長出后挑取單菌落獲得純培養(yǎng)菌株。本研究的菌株保存在中國普通微生物菌種保藏管理中心 (AS3.8022、CGMCC 3.15382和AS3.16376)。

2.2 傳統(tǒng)分類學(xué)研究

菌株的鑒定培養(yǎng)使用查氏酵母精瓊脂(Czapek yeast autolysate agar, CYA)培養(yǎng)基在25 ℃和37 ℃培養(yǎng)7天和麥芽精瓊脂(5% malt extract agar, MEA)培養(yǎng)基在25 ℃培養(yǎng)7天,然后進行菌落形態(tài)的觀測和描述,分生孢子、菌絲體、滲出液和可溶性色素及菌落背面的顏色命名參考Ridgway的命名法,產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的普通光學(xué)顯微鏡觀測挑取在MEA上25 ℃培養(yǎng)7天的菌體材料進行[2, 17]。

2.3 基因擴增及測序

采用植物基因組DNA提取試劑盒(通用型TSP101-200,擎科生物技術(shù)有限公司)提取真菌基因組DNA。上述四個遺傳標記的PCR擴增方法參考王龍等[18],其中擴增BenA的引物參考Glass and Donaldson[19],CaM的引物參考Wang[20],Rpb2的引物參考Jiang et al.[21],ITS的引物參考White et al.[22]。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳后純化,然后交給擎科生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

2.4 分子系統(tǒng)學(xué)分析

測序得到序列使用Bioedit 7.0.9[23]進行人工校對并刪除引物序列,然后提交到GenBank(熱微黃籃狀菌AS3.8022:BenA= OQ992535,CaM= OQ992536,Rpb2 = OQ992537,ITS = OQ981605;CGMCC 3.15382:BenA= ON569410,CaM= OQ626763,Rpb2 = OQ626765,ITS = OQ608443;卡迪斯籃狀菌AS3.16376(DJ6-12):BenA= ON569411,CaM= OQ626764,Rpb2 = ON569397,ITS = OQ608444)。選擇糙刺孢籃狀菌組中34個種的模式菌株和本研究的三個菌株的上述四個基因序列組合進行分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析,以紫籃狀菌組的褐孢籃狀菌(T.brunneosporusRodr.-Andr., Cano &Stchigel)作為外群。這些菌株的BenA-CaM-Rpb2-ITS組合序列矩陣包括空格(gap)共1889個位點(site)。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析采用最大似然法(Maximum Likelihood, ML),分析軟件使用MEGA6[24],最適堿基替代模型(substitution model)和位點演化速率(rates among sites)設(shè)為“K2+GI”,系統(tǒng)樹中各演化支的可靠性采用自展法(bootstrap)1 000次重復(fù)進行評估(圖 1),序列矩陣中的空格“gaps”的處理選擇“partial deletion”[25]。

3 結(jié)果與分析

3.1 分子系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果

根據(jù)三個蛋白質(zhì)基因和ITS組合序列矩陣的分子系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果顯示我國菌株AS3.8022和CGMCC 3.15382與熱微黃籃狀菌的模式菌株CBS 147313 聚在一個分支,AS3.16376與卡迪斯籃狀菌的模式菌株CBS 169.81聚在一起,bootstrap支持率均分別為100%和99%。通過上述傳統(tǒng)分類學(xué)和DNA序列系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析方法對這兩株菌進行了準確鑒定,參考我國已發(fā)表的籃狀菌物種,確定熱微籃狀菌和卡迪斯籃狀菌為我國新記錄種(圖1～3)。

注:自展法(bootstrap)評估值≥70%的分支標記在分支節(jié)點處,T 表示模式菌株,粗體表示新記錄種?！?標尺為 0.02每核苷酸替代率。

3.2 新記錄種描述

熱微黃籃狀菌,如圖2。

注:(a,b)在CYA和MEA上25 ℃培養(yǎng)7天的菌落;(c～e)分生孢子梗;(f)分生孢子;標尺為10 μm。

TalaromycescalidominioluteusHoubraken &Pyrri, J. Fungi 7: 993, 2021[5]。

在查氏酵母膏瓊脂(CYA)上25 ℃培養(yǎng)7天,形成直徑16～20 mm的菌落,稍厚,菌落表面平坦或稍帶溝紋,中央凸起,菌落邊緣整齊;呈絨狀菌落質(zhì)地;產(chǎn)大量分生孢子,顏色呈深灰綠色,近于安多佛綠色至艾綠色Andover Green to Artemisia Green(R. Pl. XLVII);菌絲體呈白色至硫磺黃色Sulphur Yellow(R. Pl. V);不產(chǎn)或產(chǎn)微量無色滲出液;產(chǎn)適量可溶性色素,黃褐色至橙皮黃色Orange Buff(R. Pl. III);菌落背面橙赤褐色至煅赭褐色Orange Rufous to Burnt Sienna(R. Pl. II)。

在麥芽精瓊脂(MEA)上25 ℃培養(yǎng)7天,形成直徑13～23 mm的菌落,稍厚,菌落表面平坦,邊緣整齊;呈絨狀菌落質(zhì)地;產(chǎn)大量分生孢子,顏色呈安多佛綠色至艾綠色Andover Green to Artemisia Green(R. Pl. XLVII);菌絲體呈白色至硫磺黃色Sulphur Yellow(R. Pl. V);不產(chǎn)滲出液及可溶性色素;菌落背面呈旱金蓮皮黃色Capucine Buff(R. Pl. III)。在CYA上37 ℃培養(yǎng)7天,未萌發(fā)。

從表面菌絲產(chǎn)生分生孢子梗,分生孢子梗莖100～200 μm × 2.5～3.5 μm,壁光滑;帚狀枝雙輪生,排列較緊密,偶見1～2個副枝;梗基每輪3～10個,10～16 μm × 2.5～3.5 μm;瓶梗披針形,每輪3～8個,10～13 μm × 2～3 μm;分生孢子呈橢球形至檸檬形,3～4 μm × 2～2.5 μm,壁光滑。

分布和基物:安徽黃山土壤(AS3.8022);新疆阜康梧桐溝土壤(CGMCC3.15382)。

卡迪斯籃狀菌,如圖3。

注:(a,b)在CYA和MEA上25 ℃ 培養(yǎng)7天的菌落;(c～e) 分生孢子梗;(f) 分生孢子,標尺為10 μm。

Talaromycesgaditanus(C. Ramírez and A.T. Martínez) Houbraken and Soccio, J. Fungi 7: 993, 2021[5]。

在查氏酵母膏瓊脂(CYA)上25 ℃培養(yǎng)7天,形成直徑11～12 mm的菌落,較薄,菌落表面不平坦,邊緣整齊;呈絨狀菌落質(zhì)地;產(chǎn)稀疏分生孢子,顏色呈玉石綠色Jade Green(R. Pl. XXXI);菌絲體呈白色夾雜淡紅色;不產(chǎn)滲出液;產(chǎn)生適量可溶性色素,呈猩紅色Scarlet(R. Pl. I);菌落背面呈牛血紅色Ox-blood Red(R. Pl. I)。

在麥芽精瓊脂(MEA)上25 ℃培養(yǎng)7天,形成直徑22～23 mm的菌落,較厚,表面具較多輻射狀皺紋,邊緣呈流蘇狀;呈短絮狀菌落質(zhì)地;分生孢子無或稀疏,分布于中央,顏色呈玉石綠色Jade Green(R. Pl. XXXI);產(chǎn)綠黃色菌絲體Green-Yellow(R. Pl. V);不產(chǎn)滲出液及可溶性色素;菌落背面呈生赤者褐色Raw Sienna (R. Pl. III)。

在CYA上37 ℃培養(yǎng)7天,未萌發(fā)。

從表面菌絲產(chǎn)生分生孢子梗,分生孢子梗莖100～200 μm × 2.5～3.5 μm,壁光滑;產(chǎn)生雙輪生帚狀枝的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu);?；枯?～8個,排列緊密,10～13 μm × 2.5～3.5 μm;瓶梗呈披針形,每輪4～8個,排列緊密,9～13 μm × 2～3 μm;產(chǎn)生檸檬形分生孢子,2.5～4 μm × 2～3 μm,壁光滑。

分布和基物:西藏日喀則定結(jié)縣土壤(DJ6-12=AS3.163 76)。

4 討論

本文報道的這兩個新記錄種屬于微黃籃狀菌群(T.minioluteusspecies group),該群目前包括8個種,即非洲籃狀菌(T.africanusHoubraken, Pyrri &Visagie)、熱微黃籃狀菌、重慶籃狀菌(T.chongqingensisX.C. Wang &W.Y. Zhuang)、卡迪斯籃狀菌、日耳曼籃狀菌(T.germanicusHoubraken &Pyrri)、微黃籃狀菌(T.minioluteus(Dierckx) Samson, N. Yilmaz, Frisvad &Seifert)、明尼蘇達籃狀菌(T.minnesotensisGuevara-Suarez, Cano &Dania García)和薩姆森籃狀菌(T.samsonii(Quintan.) Houbraken &Pyrri)。熱微黃籃狀菌在形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上均與非洲籃狀菌關(guān)系最近,卡迪斯籃狀菌在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上與重慶籃狀菌、微黃籃狀菌、薩姆森籃狀菌關(guān)系較近[5],我們的研究也顯示同樣的結(jié)果(圖 1)。

熱微黃籃狀菌此前只發(fā)現(xiàn)于荷蘭、伊朗、泰國和尼日利亞,GenBank目前只有11個菌株的序列[5]。在菌落特征上,我國的兩個菌株AS3.8022和CGMCC 3.15382在CYA上25 ℃時比模式菌株CBS 147313(DTO 052-G3)生長慢(16～20 mm vs. 20～30 mm),在MEA上,模式菌株產(chǎn)生橙褐色(orange-brown)滲出液,而我國菌株不產(chǎn)滲出液。其它菌落特征,如菌落質(zhì)地、分生孢子產(chǎn)量和顏色以及菌絲體顏色均與模式菌株類似。在顯微特征上,我國菌株與模式菌株在帚狀枝及各其個部分的形態(tài)和維度與模式菌株幾乎沒有差別。我國這兩個菌株四個遺傳標記序列完全相同,它們與模式菌株的BenA序列無差別(ON569410和OQ992535 vs. OK338786),CaM序列有7個堿基差別(OQ626763和OQ992536 vs. OK338817),Rpb2序列只差2個堿基(OQ626765和OQ992537 vs. OK338837),ITS序列只有1個堿基的差異(OQ608443和OQ981605 vs. OK339612)。基于BenA-CaM-Rpb2-ITS組合序列的發(fā)育樹顯示這兩個菌株與模式菌株同在一個分支且bootstrap支持率為99%(圖 1)。

卡迪斯籃狀菌此前只發(fā)現(xiàn)于西班牙、荷蘭、丹麥和美國,GenBank目前只有7個菌株的序列[5]。我國菌株AS3.16376與模式菌株CBS 169.81(DTO 228-B8)在CYA菌落形態(tài)上差別較大,我國菌株生長局限,產(chǎn)稀疏的分生孢子,菌絲體白色夾雜淡紅色,產(chǎn)較多紅色可溶性色素,菌落背面呈牛血紅色;而模式菌株則生長適度,產(chǎn)較多分生孢子,菌絲體呈淺黃色,不產(chǎn)可溶性色素,菌落背面呈褐色[5]。這可能由于不同菌株利用硝態(tài)氮的能力不同,而且不同氮源對真菌生長和次級代謝具有很大影響[26]。但它們在MEA上的菌落特征非常相近,均形成絮狀綠黃色菌絲體和稀疏的分生孢子,不產(chǎn)滲出液和可溶性色素,背面呈褐色。我國菌株與模式菌株的顯微結(jié)構(gòu)各部分的形態(tài)和尺度幾乎無差別。它們的BenA序列只有2個堿基差異(ON569411 vs. OK338775),CaM序列有5個堿基差別(OQ626764 vs.OK338802),Rpb2序列有5個堿基的差異(ON569397 vs.OK338827),ITS序列只有1個堿基差別(OQ608444 vs.MH861318)。根據(jù)BenA-CaM-Rpb2-ITS組合序列的發(fā)育樹顯示AS3.16376與模式菌株同在一個分支且bootstrap支持率為100%(圖1)。

目前人類食用色素主要來源于植物、動物材料的提取物,如花青素、類胡蘿卜素、甜菜苷、姜黃素和胭脂紅酸等。這些色素原料的種植和養(yǎng)殖消耗大量自然資源、人力和能源,并產(chǎn)生大量廢棄物和二氧化碳,若采用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)則會大幅降低成本并減少廢棄物和二氧化碳排放,如工業(yè)上用三孢布拉霉(BlakesleatrisporaThaxt.)生產(chǎn)β-胡蘿卜素,紅發(fā)夫酵母(PhaffiarhodozymaM.W. Mill., Yoney. &Soneda)生產(chǎn)蝦青素,紫色紅曲和紅色紅曲(MonascuspurpureusWent和M.ruberTiegh.)生產(chǎn)紅曲色素等[27]。紅曲色素屬于嗜氮酮類色素,該類色素是一類非常具有開發(fā)前景的天然色素。除了紅曲屬(MonascusTiegh.)外,已報道還有8屬真菌可以產(chǎn)生嗜氮酮類色素,其中籃狀菌屬和青霉屬(PenicilliumLink)是產(chǎn)生嗜氮酮類色素最具潛力的兩個屬[28]。已有報道,利用暗玫瑰籃狀菌發(fā)酵生產(chǎn)一種嗜氮酮類色素,即暗玫瑰素S(atrorosin S),產(chǎn)量可達0.9 g/L,而且成本低、純度高、無任何真菌毒素[29, 30]。除了本文提到的這四個產(chǎn)色素的物種外,籃狀菌至少還有21個種產(chǎn)生嗜氮酮類色素[31]。我國幅員遼闊,氣候類型復(fù)雜多變,自然環(huán)境多種多樣,隨著研究技術(shù)的進步,如傳統(tǒng)分類學(xué)技術(shù)結(jié)合環(huán)境基因組學(xué)(environmental metagenomics),將會有更多的籃狀菌新種和新記錄種被發(fā)現(xiàn),為真菌資源的研究、開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。