吳亞迪,常嘉琪,金何雨潔,王子函,張 迪,樊祥宇

(濟(jì)南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250024)

1 引言

由于抗生素濫用,耐藥細(xì)菌不斷增多,超級細(xì)菌感染層出不窮,現(xiàn)有抗生素殺菌效果大大降低。針對超級細(xì)菌感染,人類可能面臨無藥可治的局面。抗生素替代品成為科學(xué)家的研究焦點(diǎn)。噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、藻類、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱,因部分能引起宿主菌的裂解,故稱為噬菌體。由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成,蛋白質(zhì)起著保護(hù)核酸的作用,并決定噬菌體的外形和表面特征;核酸只有一種類型,DNA或RNA,雙鏈或單鏈,環(huán)狀或線狀。噬菌體對紫外線和X射線敏感并且能耐受的最低溫大約在-20℃。相較于抗生素所具有的廣譜性,噬菌體由于其蛋白質(zhì)外殼上的蛋白可以與細(xì)菌特異性結(jié)合,特異識別特定的某種細(xì)菌,可專門殺傷細(xì)菌而不損傷其他細(xì)胞。且噬菌體與細(xì)菌結(jié)合位點(diǎn)蛋白不易發(fā)生突變且具有特異性,安全性高,可以避開抗生素自身缺陷[1]。即噬菌體其特異性強(qiáng)、安全性高、殺菌殘留少、對環(huán)境污染低[2],正因此,在諸多抗生素的代替物中,噬菌體表現(xiàn)出可以代替抗生素的巨大優(yōu)勢。在未來噬菌體類替抗產(chǎn)品必將在人畜細(xì)菌性傳染病的治療方面被廣泛應(yīng)用。噬菌體的生產(chǎn)及運(yùn)輸需要選擇合適的保藏方法。不當(dāng)?shù)谋２胤椒〞?dǎo)致噬菌體產(chǎn)品效價降低甚至死亡,影響噬菌體產(chǎn)品的使用效果。噬菌體保藏時添加適當(dāng)?shù)馁x形劑可降低損傷,做到抵抗不適溫度影響、提高保質(zhì)期限、方便運(yùn)輸?shù)萚3]。本文總結(jié)較常用的幾類噬菌體保藏方法的具體步驟、優(yōu)缺點(diǎn)以及其適用的賦形劑,并分析了賦形劑自身的可降低保藏中滴度損失的物質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn),為噬菌體類產(chǎn)品合適保藏方法的選擇提供借鑒。

2 保藏方法綜述

2.1 干燥法

2.1.1 噴霧干燥。噴霧干燥是最為常用的生物制劑制備方法,王道軍等人[4]便應(yīng)用此法法制備Ⅰ型糖尿病反義肽噬菌體殼聚糖微球疫苗。噴霧干燥的工藝步驟大致分為四步(1)干燥氣體的加熱;(2)液滴的產(chǎn)生;(3)液滴的干燥;(4)顆粒收集。首先,液體進(jìn)料在噴嘴中霧化。液滴尺寸的減小導(dǎo)致表面積的大幅增加。在干燥室中,通過熱干燥氣體的連續(xù)流動快速去除噴霧液滴中的溶劑,進(jìn)而形成一個由非揮發(fā)性成分包括噬菌體、輔料和少量水分組成的顆粒。干燥顆粒形成并從氣流中分離,并收集在收集容器中[5,6],其基本的流程如圖1所示。

圖1 噴霧干燥流程圖

噴霧干燥法需注意以下兩個方面。一是出口溫度和進(jìn)風(fēng)溫度會對噬菌體滴度造成一定的損失。有研究表明當(dāng)出口溫度高于60 ℃時,噬菌體可能失去活性[7], 當(dāng)溫度低至40 ℃,可減輕溫度對噬菌體活性造成的影響[8]。另一研究表明,當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度85 ℃時,假單胞菌噬菌體LUZ19和葡萄球菌噬菌體的滴度損失小于100 ℃進(jìn)風(fēng)溫度,故而在選擇噴霧干燥前需測定得出適合該種噬菌體的出口溫度和進(jìn)風(fēng)溫度,降低噬菌體滴度的損失。二是噴嘴噴射液體進(jìn)料并將其霧化成小液滴時產(chǎn)生的剪切應(yīng)力影響噬菌體顆粒的完整性,可通過使用超聲波噴嘴應(yīng)用溫和的霧化技術(shù)來減少有害的剪切應(yīng)力[9]。

此外,為了避免噴霧干燥過程中噬菌體生物活性的喪失以及維持噬菌體粉劑在儲存過程中的穩(wěn)定性,賦形劑的選擇顯得極其重要。在噴霧干燥過程中,賦形劑的主要作用是代替水與噬菌體中蛋白質(zhì)形成氫鍵。由于氫鍵的喪失或減弱以及水蒸發(fā)過程中疏水相互作用的增加可能會造成蒸發(fā)液滴中的蛋白質(zhì)經(jīng)歷可逆或不可逆的變性[10],進(jìn)而引起噬菌體失活。因此需要在噴霧干燥的過程中添加合適的賦形劑。糖類可提供較多氫鍵的供體,所以它們與噬菌體中蛋白質(zhì)可形成氫鍵以維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定而成為噴霧干燥中常用的賦形劑[11,12]。

進(jìn)行單因素試驗(yàn)時，一種元素含量作為變量，其余三種元素含量保持不變.試驗(yàn)中各元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為10%～12%Si，1.5%～3.5%Cu，0.1%～0.3%Mg，0.1%～0.5%Mn.在ADC12鋁合金成分范圍內(nèi)，采用單因素條件試驗(yàn)分別向合金中添加不同量的Si，Cu，Mg，Mn元素時，考查合金力學(xué)性能的變化情況.在4種元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Si，1.5%Cu，0.1%Mg，0.1%Mn的條件下，分別進(jìn)行Si，Cu，Mg，Mn添加量對鑄態(tài)合金抗拉強(qiáng)度與延伸率影響的單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2～5所示.

現(xiàn)在，因?yàn)榉N種的原因，我們在感冒的用藥治療上仍存在一些誤區(qū)，和睦家藥師冀連梅給家長們一些提醒，爸爸媽媽要謹(jǐn)防入坑啊。

此外,冷凍干燥法和噴霧干燥法在制備噬菌體固體制劑的過程中,都需要用到多種賦形劑,其中以糖類為主,包括蔗糖、海藻糖和乳糖,但目前僅乳糖被批準(zhǔn)用于吸入輸送[26],故而在實(shí)際應(yīng)用中要注意賦形劑種類的選擇。真空干燥則應(yīng)用較少。

2.1.3 真空干燥。真空干燥法也稱減壓干燥或負(fù)壓干燥,是在密閉的空間中抽去空氣,形成負(fù)壓而進(jìn)行干燥的一種方法。真空干燥法屬于低溫干燥,為了避免真空干燥過程中噬菌體活性的喪失,需要添加各種保護(hù)劑。目前常用的保護(hù)劑包括脫脂奶粉、糖類、乳清粉和明膠等。其中,糖類是最常用的一種保護(hù)劑。例如許維素等將不同的噬菌體混合后加入糖類作分散劑,真空干燥后可以在2～7 ℃保存較長時間[21]。脫脂奶粉因其可采用加熱法除菌,且易獲得均質(zhì)的粉狀制品而成為一種常用的保護(hù)劑。例如金曉琳等在銅綠假單胞菌噬菌體PaP1中加入脫脂牛奶后真空干燥,4 ℃時保存時間長達(dá)六 個月[22]。此外,將不同保護(hù)劑混合后進(jìn)行真空干燥也是一種噬菌體保藏的方法。

2.1.2 冷凍干燥。冷凍干燥法的原理是先將富集液凍結(jié),然后在負(fù)壓下進(jìn)行升華、除水后形成粉末狀,凍干后可在不同溫度下保藏。冷凍干燥主要由三 個階段組成:凍結(jié)(凝固)階段,初級干燥(冰升華)階段,水分解吸的二次干燥階段。在凍結(jié)過程中,溶劑從溶液中分離出來并轉(zhuǎn)化為冰。在第二階段初級干燥過程中,凝固的液體樣品不通過液相直接轉(zhuǎn)化為氣相。在二次干燥過程中,未被凍結(jié)的吸附水和結(jié)合水通過解吸從溶質(zhì)相中除去[17]?；玖鞒倘鐖D2所示。

圖2 冷凍干燥流程圖

冷凍干燥需要在冷凍和脫水過程中保持噬菌體的完整性和感染性。為了防止凍傷噬菌體,需要添加各種凍干保護(hù)劑。通常,凍干保護(hù)劑需要具備四個特征,即玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)高、吸水性差、結(jié)晶率低和不含還原基。常見的凍干保護(hù)劑包括糖類(蔗糖、海藻糖、乳糖)、氨基酸(谷氨酸、精氨酸)、多羥基化合物(甘露醇)等。

國內(nèi)外學(xué)者圍繞技術(shù)溢出，對合作創(chuàng)新的市場績效進(jìn)行了系統(tǒng)且細(xì)致的研究。但是研究的視角單一，技術(shù)溢出僅僅是影響合作創(chuàng)新的主要原因之一，另外實(shí)證研究也非常不夠。因此，從以下幾方面加強(qiáng)對合作創(chuàng)新市場績效的研究，對提高我國企業(yè)的自主創(chuàng)新動力和效率，發(fā)展戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新型國家的目標(biāo)意義重大。

在生物藥品的冷凍干燥過程中,最常用的保護(hù)劑是糖類。實(shí)驗(yàn)證明單糖在蛋白質(zhì)的凍干過程中不起到保護(hù)作用。與單糖相比,二糖既能在冷凍過程中充當(dāng)?shù)蜏乇Ｗo(hù)劑,也能在干燥脫水過程中充當(dāng)脫水保護(hù)劑,并且二糖不含還原基不會使生物藥品發(fā)生蛋白質(zhì)褐變反應(yīng)變性失活。例如Prasanth Manohar等人[18]將三種裂解噬菌體(大腸桿菌噬菌體ECP311、大腸桿菌噬菌體ELP140和克雷伯菌噬菌體KPP235)用六種不同的輔料(葡萄糖、蔗糖、明膠、甘露醇、聚乙二醇和山梨醇)作保護(hù)劑凍干噬菌體,并測試其生存能力,結(jié)果表明,噬菌體凍干后4 ℃儲存時,它們的存活時間維持了20個月; 37 ℃儲存時,它們的活性在10個月后才開始降低。而與蔗糖相比,海藻糖和乳糖具有更高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和更低的引濕性,且不具有還原性。榮蓉等人在副溶血弧菌噬菌體VPp1中加入0.3 mol/L的海藻糖凍干,發(fā)現(xiàn)噬菌體在4 ℃能夠保藏4個月[19]。

冷凍干燥法制備的噬菌體固體制劑與噴霧干燥法制備的噬菌體固體制劑類似,也可通過干粉吸入器輸送到肺部[24],但該固體制劑由于顆粒較大一般需要研磨,且冷凍干燥法制備的噬菌體固體制劑還可通過再水化后霧化的形式輸送到肺部。除此之外,冷凍干燥法還可將微膠囊化的噬菌體制備成固體粉劑,例如Kantiya等人[25]利用冷凍干燥技術(shù),制備以乳清蛋白分離物與海藻糖(比例3∶1)為微膠囊的壁材料的固體噬菌體制劑,用于食品防腐。

甘露醇也是一種很好的噬菌體凍干保護(hù)劑。甘露醇上的羥基能代替部分結(jié)構(gòu)水,與蛋白中的羰基和氨基結(jié)合形成氫鍵,使蛋白質(zhì)在缺水的條件下仍能保持其原有結(jié)構(gòu)而不喪失活性。將噬菌體溶液冷凍干燥后加入甘露醇,可以提高噬菌體的保藏活性。

與其它保存方法相比,冷凍干燥噬菌體的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下幾個方面:一是冷凍干燥法將噬菌體富集液轉(zhuǎn)化為粉末形式,粉末形式具有較長的保質(zhì)期;二是冷凍干燥法對噬菌體的傷害較小。由于加工溫度低及水分快速升華使得加入保護(hù)劑制成的凍干粉可在不同溫度下長期保藏,工廠應(yīng)用時可快速溶解凍干粉使用,但冷凍干燥的較高成本限制了其應(yīng)用范圍。

噴霧干燥噬菌體的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下兩個方面:一是與液體制劑相比,噴霧干燥產(chǎn)生的粉末大大降低了水分含量,從而能夠保證噬菌體在長期保存中的穩(wěn)定性;二是與傳統(tǒng)干燥技術(shù)如冷凍干燥相比,噴霧干燥的優(yōu)勢在于不涉及冷凍或者真空條件,且是一步完成干燥,能縮短再水化的時間,因此其效率高,制作成本低。但全過程所需費(fèi)用明顯高于其他,在制作流程上如能進(jìn)行改進(jìn)會更有優(yōu)勢。

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由于大多數(shù)的噬菌體制劑是以液態(tài)形式使用,噬菌體懸液保存法不需要將噬菌體原液轉(zhuǎn)化為粉末狀等其他狀態(tài),操作較為便捷,全程僅需注意溫度的把控。故在短期保存中有一定優(yōu)勢,但是若需要更好的保藏效果或者是更方便轉(zhuǎn)移,那就要運(yùn)用凍干法等其他保藏方法進(jìn)行保藏。同時,這一噬菌體保存方法同其他方法相比較易產(chǎn)生污染。

噴霧干燥法制備的噬菌體固體制劑,粒徑小,能通過干粉吸入器(DPI)直接輸送到肺部,應(yīng)用于治療肺部的細(xì)菌感染或其他細(xì)菌性呼吸道感染。Mengyu Li等人[23]的研究,利用噴霧干燥法制備了含三 種銅綠假蛋白菌噬菌體的雞尾酒固體粉末制劑,并通過體外模擬實(shí)驗(yàn),利用兩種吸入器模擬人體氣道,證明該固體粉末制劑的分散性及可吸入性。噴霧干燥法制備的噬菌體固體制劑,除了能夠直接輸送到肺部進(jìn)行肺部給藥之外,還可通過壓縮制成片劑應(yīng)用于腸道給藥,但有研究將噴霧干燥制備的PEV20噬菌體粉末壓縮后進(jìn)行腸溶包衣制成口服片劑,臨床試驗(yàn)后并未發(fā)揮良好效果,分析原因可能為胃液pH影響而失活,后研究改進(jìn),將大腸桿菌噬菌體噴霧干燥后,用pH響應(yīng)性甲基丙烯酸酯聚合物進(jìn)行封裝,使聚合物包封與噴霧干燥技術(shù)的結(jié)合,為噬菌體口服給藥的應(yīng)用提供了發(fā)展方向。

氨基酸是常見的蛋白質(zhì)凍干保護(hù)劑。噬菌體作為一種含有蛋白質(zhì)外殼的生物體,也可以選用氨基酸作為凍干保護(hù)劑。氨基酸的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度相對高于非氨基酸緩沖劑,因此可起到一定保護(hù)作用。H.W.B.Engel等人[20]在分枝桿菌噬菌體中加入5%谷氨酸鈉和0.5%明膠作為保護(hù)劑凍干,發(fā)現(xiàn)噬菌體可以在室溫、黑暗條件下儲存2.5年。

懸液法是指在噬菌體保藏的過程中,直接使用噬菌體原液保藏,或者在噬菌體原液中添加不同的賦形劑以使其保存的時間更長。懸液法大致分為噬菌體原液或培養(yǎng)液直接使用、加入甘油作為保護(hù)劑、加入氯仿作為保護(hù)劑或者加入噬菌體保存液等幾類。

在儲存過程中,賦形劑還能夠降低溫度和高濕度對噴霧干燥噬菌體制劑造成的影響。較高的儲存溫度(25 ℃)可能導(dǎo)致噬菌體熱不穩(wěn)定。賦形劑降低溫度影響的原理是提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。由于噴霧干燥制劑常溫儲存溫度必須遠(yuǎn)低于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度才能降低溫度的影響,因此需要選擇高玻璃轉(zhuǎn)變溫度的賦形劑如海藻糖(玻璃化轉(zhuǎn)變溫度115 ℃)、乳糖(玻璃化轉(zhuǎn)變溫度108 ℃)等。研究表明,在由各種量的海藻糖,甘露醇和亮氨酸的多組分賦形劑系統(tǒng)中,含有高海藻糖含量(>40%)的噴霧干燥粉末基質(zhì)在4 ℃下以22%相對濕度儲存12個月后具有良好穩(wěn)定性[13]。賦形劑降低濕度影響的原理是減少水分吸附以防止重結(jié)晶。研究表明噴霧干燥噬菌體制劑的重結(jié)晶往往發(fā)生在高濕條件下,比如在相對濕度高時,即使儲存溫度低于海藻糖玻璃轉(zhuǎn)化溫度,基質(zhì)中依然會產(chǎn)生結(jié)晶[14]。而這種結(jié)晶則容易使噬菌體病毒粒子失活。為了改善這一問題,可以引入具有防潮特性的賦形劑,例如亮氨酸。亮氨酸(L-異構(gòu)體)是一種支鏈α-氨基酸,具有四碳脂肪族非極性側(cè)鏈,有一定的疏水特性。已有研究表明當(dāng)疏水性亮氨酸存在于噬菌體顆粒表面時減少了水的吸附,并防止了顆粒之間毛細(xì)管橋的形成,并減少了顆粒間毛細(xì)管力,而且較高的亮氨酸濃度還可以增強(qiáng)海藻糖噴霧干燥粉末在高濕環(huán)境時的穩(wěn)定性,能夠在儲存過程中保護(hù)其免受濕度的影響[15]。目前亮氨酸主要與糖類協(xié)同作為噬菌體噴霧干燥的賦形劑。Nicholas B.Carrigy等人以亮氨酸和海藻糖為賦形劑制做噴霧干燥的抗彎曲桿菌噬菌體CP30A粉末,無論是室溫儲存3周還是長期的運(yùn)輸過程中噬菌體都保持良好的生物活性[16]。

“縱觀西方哲學(xué)研究，自始至終貫穿著感性與理性、經(jīng)驗(yàn)主義與唯理主義的爭論，這些對立的觀點(diǎn)以不同的形式反映在語言研究中，并形成了兩種對立的語言研究方法:一種是通過可觀察到的語言用法，從外部對語言進(jìn)行研究;另一種是把語言看作人的天賦能力的一部分，看作人類理性的表現(xiàn)，從人類心智內(nèi)部研究語言?！保?］“傳統(tǒng)語文學(xué)、對比語言學(xué)、描寫語言學(xué)主要基于經(jīng)驗(yàn)主義哲學(xué)觀，而普遍語法、思辨語法、轉(zhuǎn)換生成語法則主要基于唯理主義?！保?］82

2.2 懸液法

“孩子，我對不起你……”范堅(jiān)強(qiáng)失聲道，“本來，你是不應(yīng)該活著的，但你是我在這世上唯一的親人了，當(dāng)我看到你脖子上戴的玉佩時，我就知道，你是那個我找了二十多年的親人。所以，才把你關(guān)在石屋里。你不知道，我每天在石屋外面徘徊，心里有多難過?！狈秷?jiān)強(qiáng)的話里帶著幾份凄涼。

2.2.1 噬菌體原液。本方法不加入任何試劑,直接使用噬菌體原液或者培養(yǎng)液進(jìn)行保存。在大多情況下,4 ℃保存的效果最好,例如彭帆等人[27]將噬菌體IME-AB6在LB液體培養(yǎng)基中放于不同溫度下保存,發(fā)現(xiàn)該噬菌體在4 ℃的情況下保存效果最優(yōu)。此外,科學(xué)家們常常將各種噬菌體(例如副溶血弧菌噬菌體或沙門氏菌裂解性噬菌體)在4 ℃冰箱中以噬菌體原液形式保存。

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2.2.2 甘油。甘油可以作為噬菌體懸液的保護(hù)劑。將甘油加入至噬菌體懸浮液或濃縮液中可以提高噬菌體保存效果。有研究表明[28],在木糖氧化無色桿菌噬菌體(phiAxp-1,phiAxp-2和phiAxp-3)中添加甘油到終濃度15%,將它們在-80 ℃、-20 ℃、4 ℃環(huán)境下保存16個月后,噬菌體phiAxp-1和phiAxp-2的效價均無明顯降低,噬菌體phiAxp-3的效價僅下降了一個數(shù)量級。在大腸桿菌噬菌體的研究中發(fā)現(xiàn),與直接使用噬菌體原液相比,加入無菌甘油作為保護(hù)劑后噬菌體的效價降低速率減緩,且在4 ℃保存16個月時,噬菌體的效價幾乎未發(fā)生變化。

2.2.3 氯仿。氯仿也可以作為噬菌體懸液的保護(hù)劑。在黎爾納等人[28]的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)加入氯仿至終濃度為20%后,4 ℃保存噬菌體16個月后,噬菌體phiAxp-1、phiAxp-2的效價穩(wěn)定在109PFU /mL,噬菌體phiAxp-3的效價穩(wěn)定在1010PFU /mL。4 ℃保存環(huán)境比-80 ℃、-20 ℃、室溫、37 ℃的保存效果更佳。但是代保英[29]在大腸桿菌K88噬菌體的保存研究中則發(fā)現(xiàn),氯仿并不是一個可以廣泛應(yīng)用的保護(hù)劑,僅僅對部分噬菌體具有一定效果。

2.2.4 噬菌體保存液。噬菌體保存液即為SM緩沖液,成分為氯化鈉、硫酸鎂、明膠等,主要用于稀釋和保存噬菌體。SM緩沖液的保存溫度和上述的噬菌體懸液保存法類似,也是將噬菌體保存在4 ℃的環(huán)境中。將出血性大腸桿菌噬菌體933W置于SM緩沖液中并放于4 ℃冷藏是保存933W的一種較好方法。譚德猛等人[30]也在實(shí)驗(yàn)中利用SM保存液稀釋和保存噬菌體。

真空干燥的的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在以三 個方面:一是與普通干燥相比,真空干燥噬菌體時,粉末狀噬菌體不會被流動空氣吹動,減少了不必要的損失;二是若密封保存得當(dāng),噬菌體將會長期保持原始的效價和遺傳性狀;三是能防止發(fā)生試料的自動凍結(jié),真空干燥噬菌體時,噬菌體可以保持不凍結(jié)而在高度真空下減壓干燥。但其制作成本較高,工廠應(yīng)用時需要權(quán)衡考慮。

2.3 凍液法

凍液法是指在-20 ℃及以下的低溫冷凍條件保藏噬菌體溶液,可以選用干冰、超低溫冰箱和液氮等。在金曉琳等人[22]的研究中,對凍干、室溫、4 ℃、-20 ℃、液氮這幾種保存方法的效果進(jìn)行對比,液氮和凍干儲存效果最好,在-20 ℃下儲存噬菌體滴度降低最快,儲存效果最差。-20 ℃保藏噬菌體6個月之后,效價便從109降到了106。但是液氮和凍干儲存條件苛刻,難以用于大規(guī)模使用。在-20 ℃下,噬菌體效價降低可能是因?yàn)樵诖藴囟认滦纬杀?損害噬菌體。因此在-20 ℃條件下加入合適的冷凍保護(hù)添加劑(Cryoprotective additives,CPAs)可以減緩冰晶的形成從而延長噬菌體的儲存時間。CPAs主要被分為三類:(1) 可穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的CPAs;(2) 可穿透細(xì)胞壁而不穿透細(xì)胞膜的CPAs;(3)不能穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的CPAs。

2.3.1 可穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的CPAs?？纱┻^細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的CPAs主要有甘油和二甲基亞砜。不同濃度的甘油具有不同的保護(hù)效果。根據(jù)Wanger等人[31]的研究,向乳制品菌株的噬菌體懸液中加入15%的甘油, -80 ℃環(huán)境可穩(wěn)定保存四年,效價基本不降低。在沙門菌噬菌體培養(yǎng)液中加入20%的甘油,在-20 ℃條件下可有效保存一年,效價基本不降低 。在噬菌體原液中加入二甲基亞砜(Me2SO)也可以有效提高噬菌體的保存時間。Hubalek等人[32]研究發(fā)現(xiàn)各濃度二甲基亞砜都可以作為冷凍保護(hù)添加劑。在金黃色葡萄球菌噬菌體中混入7%的二甲基亞砜,在-80 ℃的條件下可有效保存3個月且效價不變。然而,二甲基亞砜對某些噬菌體可能是有毒的,例如40%的二甲基亞砜會使T4噬菌體的滴度降到6%。

取平底雙碟8套，放置水平臺面上，分別加入已滅菌、熱的培養(yǎng)基約20 ml，于碟底均勻攤布，待凝固，作為底層；另取已滅菌溫度降至約50℃的培養(yǎng)基適量，加入藤黃微球菌的菌懸液適量，能得清晰的抑菌圈，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18～22 mm，搖勻，在每個雙碟中分別加入5 ml菌懸液，在底層均勻攤布，作為菌層；待培養(yǎng)基凝固后，在雙碟中等距離安置不銹鋼小鋼管4個，將對照品溶液與供試品溶液按順序滴加于不銹鋼小鋼管內(nèi)，用陶瓦圓蓋覆蓋，在37 ℃培養(yǎng)16～18 h。

2.3.2 可穿透細(xì)胞壁而不穿透細(xì)胞膜的CPAs?？纱┻^細(xì)胞壁而不穿透細(xì)胞膜的CPAs主要有聚乙烯氧化物和酰胺及胺類化合物。聚乙烯氧化物又稱聚氧乙烯(PEO),有研究表明PEO-400在濃度為5%～15%范圍內(nèi)可以作為CPAs保護(hù)T4噬菌體。另一研究發(fā)現(xiàn),濃度為10%的乙酰胺、二甲基乙酰胺和二甲基甲酰胺在保護(hù)產(chǎn)氣腸桿菌冷凍懸浮液方面幾乎與甘油和Me2SO一樣有效,但甲酰胺(MW 45.04)的保護(hù)效果要差得多[33]。

2.3.3 不能穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的CPAs。既不能穿過細(xì)胞壁也不能穿過細(xì)胞膜的CPAs主要是葡萄糖和血清白蛋白。葡萄糖已被證實(shí)可以作為CPAs保護(hù)噬菌體。有研究證實(shí),將10% Me2SO和8%葡萄糖的混合物加入至噬菌體液中進(jìn)行-20 ℃的低溫保存,效果優(yōu)于單獨(dú)使用10% Me2SO[32]。0.1%～4%濃度的血清白蛋白一直被用作病毒和立克次體的CPAs[34],其在低溫下效果優(yōu)于二甲基亞砜。

總體來看,凍液法價格低廉但是保存時間和保存效果相較于噴霧干燥等有較大差距。

3 總結(jié)與展望

我們按照噬菌體和宿主菌的種類以及它們所應(yīng)用的保存方法的不同進(jìn)行了初步統(tǒng)計(jì),結(jié)果如表1所示。

表1 已發(fā)表的常見噬菌體保藏方法列表

總體來看,噬菌體保存與細(xì)菌和活性蛋白質(zhì)的保存類似,符合低溫保存即可在較長時間保持活性,但溫度不可低于-20 ℃,否則產(chǎn)生冰晶使噬菌體滴度下降。而在所有保存方法中最為便宜,簡便的即為4 ℃原液保存,若使用噬菌體限制不高,無其他特殊要求,那么4 ℃常溫保存即為最佳方式[39]。

現(xiàn)在一些企業(yè)已經(jīng)開始進(jìn)行噬菌體制劑和噬菌體保藏方法的研發(fā),如諾立(上海)生物工程有限公司研發(fā)產(chǎn)品“獵弧特工”,利用噴霧干燥法和懸液法進(jìn)行保藏,該產(chǎn)品可以在對蝦養(yǎng)殖中高效裂解弧菌;潤達(dá)生物科技有限公司研發(fā)出液態(tài)的噬菌體產(chǎn)品“常噬”,裂解譜涵蓋多種沙門氏菌和大腸桿菌的烈性噬菌體?？傮w來看,噬菌體使用懸液法進(jìn)行保藏時,可以直接用原液或者加入不同的賦形劑,只要在適合溫度下儲存保藏效果均不錯。但是懸液法的運(yùn)輸難度大且易造成污染,后續(xù)取用也不方便。凍液法中液氮法和凍干法對噬菌體的儲存效果好但條件苛刻難達(dá)到,-20 ℃條件且添加賦形劑后噬菌體的儲存效果不錯但是與噴霧法比較仍有差距。干燥法將噬菌體制成粉末狀,解決了運(yùn)輸難這一問題,但具體流程較繁瑣、費(fèi)用高。還有一些應(yīng)用較少的保藏方法,例如微膠囊法[44],適量的噬菌體脂質(zhì)體與海藻酸鈉溶液混合,后取注射器加入交聯(lián)溶液中勻速滴取過濾即得微膠囊。此類方法只要儲存得當(dāng),保藏效果不錯但是制作過程繁瑣,花費(fèi)高,大規(guī)模生產(chǎn)投入過大。現(xiàn)階段研究出流程簡單且花費(fèi)不高的保藏方法是噬菌體產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用中亟待解決的問題,我們設(shè)想將較常使用且花費(fèi)不高的噬菌體懸液法進(jìn)行改造——將其常用賦形劑進(jìn)行組合搭配,提升其在常溫下的保藏效果。