董昭良,于瑞明,張莉萍,董昭彤,王永錄,潘 麗,杜曉華*,劉新生*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院,甘肅 蘭州 730070;2.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所,甘肅 蘭州730064;3.西安交通大學 錢學森學院,陜西 西安 710048)

豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)也稱為豬丁型冠狀病毒,可引起豬急性腹瀉,嘔吐,脫水甚至哺乳仔豬死亡[1]。該冠狀病毒最早于2007年由中國學者DONG等[2]在野生亞洲豹貓和中國白鼬獾中檢測發(fā)現(xiàn),但當時并未提出δ冠狀病毒的命名[3]。WOO等[4]于2012年在豬糞便樣品中檢測到該冠狀病毒,同時進行流行病學調查發(fā)現(xiàn)了6種禽源和1種豬源的新型冠狀病毒。2014年2月[5],美國學者在腹瀉仔豬腸道內(nèi)容物及LLC-PK細胞中首次分離出PDCoV OH-FD22株[6-7],隨后,包括中國在內(nèi)的亞洲等許多國家也相繼報道了PDCoV感染的病例[8-12]。給世界各個國家的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失[13-15]。此外,近年來國內(nèi)外有關研究表明,PDCoV具有廣泛的宿主譜,除感染豬之外,還可以感染牛[16]、雞[17]、火雞[18]。最新的研究結果顯示,從患有急性發(fā)熱疾病的海地兒童血漿中也檢測到PDCoV的存在,首次證實了PDCoV能夠感染人[19-20]。目前,尚沒有應對PDCoV感染的商品化抗病毒藥物和疫苗,因此,非常有必要建立特異性強、準確快捷的PDCoV檢測方法,為該病的臨床快速檢測及基礎研究提供重要的方法學基礎。

PDCoV是一種具有囊膜、單股、正鏈RNA病毒,屬于套式病毒目、冠狀病毒科、δ冠狀病毒屬,病毒直徑為60～180 nm,基因組大小為25.4 kb(除poly(A)尾巴),是目前已知冠狀病毒基因組中最小的,PDCoV主要編碼4種結構蛋白(S、E、M和N)、3個輔助蛋白(NS6、NS7、NS7a)[21-23]及15個非結構蛋白(nsp2-nsp16);M蛋白是病毒囊膜表面最豐富的跨膜運輸?shù)鞍?通過比對NCBI公布的不同PDCoV毒株的M基因序列發(fā)現(xiàn)其同源性在99%,常作為建立核酸診斷技術的靶基因[24]或血清學診斷[6,9,25]。M蛋白可分為3部分:即暴露于病毒囊膜外短的糖基化N末端區(qū)、病毒囊膜中大的C末端區(qū)和中間的α螺旋區(qū)。也有研究表明,該蛋白在刺激宿主機體產(chǎn)生免疫反應中有著重要作用以及刺激機體產(chǎn)生α干擾素[26]、負責營養(yǎng)物質的運輸[27]、并且也在病毒粒子的組裝、出芽[28-29]過程中發(fā)揮作用。本研究利用截短表達的PDCoV M蛋白制備了特異性單克隆抗體,為PDCoV臨床快速診斷檢測方法的建立及基礎研究提供重要材料。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞及主要試劑PDCoV流行株CH/XJYN/2016(MN064712),豬小腸腎上皮細胞(LLC-PK細胞)、雜交瘤細胞(SP2/0細胞)由本實驗室分離、保存。原核表達載體pCold Ⅱ由本實驗室保存,E.coliBL21(DE3)感受態(tài)購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司、SPF級6～8周齡BALB/c雌鼠由蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。碧云天超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術;BamHⅠ限制性內(nèi)切酶和HindⅢ限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs(NEB)公司;AxyPrepTMDNA凝膠回收試劑盒和HRP標記羊抗鼠購自Cayman公司;親和層析柱料購自匯研生物技術有限公司;SBA Clonotyping System-HRP購自Southern Biotech;PDCoV N蛋白單克隆抗體由本實驗室制備;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、50%PEG融合劑、HAT選擇性培養(yǎng)基和HT選擇培養(yǎng)基購自SIGMA。

M.DL5000 DNA Marker;1.PDCoV M基因;2～4.pCold II-PDCoV-M雙酶切產(chǎn)物

M.蛋白分子質量標準;1.誘導pColdⅡ;2.未誘導pColdⅡ-PDCoV M;3.誘導pColdⅡ-PDCoV M;4.誘導pColdⅡ-PDCoV M上清;5.誘導pCold II-PDCoV M沉淀

1.2 引物的設計與合成根據(jù)PDCoV流行株CH/XJYN/2016的M基因組序列,利用Snap Gene軟件設計M特異性引物M-F:ATGGATCCGACAGCATTCGCTTGCTTATTAAG(5′→3′);M-R:ATAAGCTTCATGTACTTGTAGAGACGG-GCATC(5′→3′);引入限制性酶切位點分別為BamH Ⅰ和Hind Ⅲ(引物處下劃線序列),引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

A.SDS-PAGE鑒定目的蛋白純化;M.蛋白分子質量標準;1～2.純化后的PDCoV M蛋白;B.重組蛋白PDCoV M表達鑒定;3～4.目的蛋白鑒定;5.pColdⅡ空載體表達鑒定

1.3 載體的構建以提取PDCoVCH/XJYN/2016株RNA為模板經(jīng)反轉錄獲得cDNA,以cDNA為模板,利用設計的特異性引物RT-PCR擴增獲得PDCoV M基因。將載體pColdⅡ和目的片段PDCoV M同時用BamHⅠ和HindⅢ 進行雙酶切,雙酶切合適的回收產(chǎn)物與T4DNA連接酶16℃過夜連接,連接產(chǎn)物轉化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞。經(jīng)過涂板挑取陽性質粒,構建了重組質粒pColdⅡ-PDCoV M,并對其進行第2次雙酶切,然后測序鑒定并保存于超低溫冰箱。

1.4 目的蛋白的鑒定和純化將測序準確的M重組質粒轉化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中,挑取陽性菌株經(jīng)擴大培養(yǎng)后,誘導時間參照pColdⅡ說明書,采用IPTG 16℃ 搖床低溫誘導表達24 h,8 000 r/min離心20 min,收取菌體沉淀,加入Tris-NaCl重懸菌體洗滌,放置于冰水混合物上進行超聲破碎。取其上清和沉淀(保存于4℃冰箱)制樣,進行SDS-PAGE電泳,確定其表達形式后大量誘導表達,利用Ni-NTA親和層析柱法純化帶His標簽重組M蛋白。

1.5 BALB/c小鼠免疫及血清效價檢測用M蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混合并充分乳化,對6～8周齡的雌性BALB/c小鼠(20 μg只)進行免疫,采用皮下多點注射(或大腿肌肉注射),用弗氏不完全佐劑,按照同樣方法進行二免(20 μg/只)和三免(每只20 μg),免疫間隔為2周,二免之后14 d采血,小鼠血清稀釋1∶12 800,D450 nm值為1.0時即滿足融合要求,血清抗體效價不滿足的小鼠繼續(xù)三免。檢測小鼠血清抗體效價用間接ELISA方法。步驟如下:用純化后的M蛋白(1 mg/L)包被酶標板,4℃過夜,5%脫脂奶粉37℃封閉2 h;小鼠血清為一抗,以1∶500倍比稀釋,PBS免疫的BALB/c小鼠血清作為對照,37℃孵育40 min;羊抗鼠IgG-HRP為二抗以1∶10 000稀釋每孔加入100 μL,37℃孵育30 min;每孔加入50 μL加入TMB顯色液顯色,37℃孵育10 min;利用每孔加入50 μL終止液(2 mol/L H2SO4)終止反應,用酶標儀讀取D450 nm值。

1.6 細胞融合及雜交瘤細胞的篩選挑選2只高效價的小鼠進行腹腔注射M(每只40 μg)蛋白進行加強免疫,3 d后進行融合,融合前1 d制備飼養(yǎng)層。12～24 h內(nèi)融合,融合提前預熱PEG、DMEM和無菌的去離子水,用預熱50%的PEG進行融合,骨髓瘤細胞(SP2/0)與小鼠脾細胞按1∶4混合。放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),融合后3 d觀察細胞集落,并補加含有20%FBS的HAT培養(yǎng)基每隔3～5 d 換液1次(也可用含有20%FBS的HT培養(yǎng)基),補加液體時一定要輕柔,防止集落細胞被打散。每天觀察待雜交瘤細胞聚團長至單孔面積的30%～50%時,取其細胞培養(yǎng)上清,用間接ELISA方法檢測其在D450 nm值較高的陽性雜交瘤細胞株,應用有限稀釋法對其多次亞克隆,獲得100%的陽性雜交瘤細胞株。

1.7 腹水的制備及效價測定首先將弗氏不完全佐劑對BALB/c雌鼠進行腹腔注射(0.3 mL/只),3 d后腹腔注射陽性雜交瘤細胞株,在7 d后觀察小鼠產(chǎn)生腹水狀態(tài),隨時準備收集腹水。用正辛酸-飽和硫酸銨法對獲取的腹水進行純化,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,并測定濃度,通過間接ELISA方法測定純化后抗體的效價(mAb稀釋度從1∶200進行倍比稀釋)。

1.8 PDCoV M蛋白單克隆抗體的鑒定

1.8.1Western blot鑒定 將感染PDCoV的PK細胞,分別在0,6,12,24,36 h觀察病變,出現(xiàn)病變后收集細胞樣品,同時設立未接毒細胞對照組。制樣后將樣品進行SDS-PAGE電泳,轉膜,之后經(jīng)過5%脫脂奶粉封閉1 h,以制備稀釋的單克隆抗體4℃過夜,HRP標記的山羊抗鼠IgG室溫作用1 h,最后按照碧云天超敏ECL化學發(fā)光試劑盒說明書進行曝光。

1.8.2間接ELISA鑒定 分別將PDCoV N蛋白和PDCoV M蛋白稀釋至1 mg/L進行包被,操作方法見1.5,最后用酶標儀讀取D450 nm值進行分析。

1.8.3IFA鑒定 將PK細胞鋪于12孔板中,待細胞長滿每孔的80%左右,用PDCoV感染PK細胞,鑒定制備PDCoV M蛋白單克隆抗體的特異性。根據(jù)計算接毒量,在接毒后觀察細胞病變情況,約24 h每孔加入1 mL 4%多聚甲醛,放置于4℃冰箱,固定60 min或過夜固定;每孔加入500 μL 0.25%Triton-100,室溫條件下通透10 min,每孔加入1 mL PBS洗滌3次,每次3 min并在微量振蕩器上混勻,每孔加入500 μL 5%BSA封閉60 min并洗滌;每孔加入500 μL用3%BSA以1∶10稀釋的雜交瘤細胞株上清,4℃孵育過夜,在避光條件下,每孔加入500 μL以1∶2 000稀釋的488標記的山羊抗鼠,37℃孵育60 min;避光條件下每孔加入1滴DAPI,室溫靜置5 min,每孔加入1 mL PBS洗滌3次后,再每孔加入500 μL PBS,放入4℃冰箱,在倒置熒光顯微鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 目的基因擴增與重組質粒的鑒定電泳結果顯示PCR擴增產(chǎn)物大小約393 bp,與預期大小相符(圖1A)。用BamHⅠ和HindⅢ 對擴增產(chǎn)物與pColdⅡ載體進行雙酶切。酶切鑒定確認載體片段與目的片段(圖1B)均與預期片段大小一致,通過測序證實無誤,說明原核表達載體pColdⅡ-PDCoV M構建成功。

2.2 目的蛋白的誘導表達與可溶性分析將原核表達質粒pColdⅡ-PDCoV M轉化至BL21(DE3),加入IPTG,15℃ 220 r/min的條件下誘導表達24 h,誘導時間參照pColdⅡ說明書,并對空載體誘導表達24 h,超聲破碎后,用8 mol/L的尿素溶解,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,與預期大小相符,且重組蛋白在包涵體中表達(圖2)。

2.3 重組蛋白pColdⅡ-PDCoV M的純化經(jīng)SDS-PAGE結果顯示,包涵體M蛋白用Ni親和層析注法純化,純化后的純度可達90%,經(jīng)透析用BCA法測定其質量濃度為1.63 g/L,并作Western blot驗證(圖3)。

2.4 間接ELISA測定免疫小鼠血清抗體效價采用間接ELISA方法檢測免疫小鼠血清抗體效價,結果如圖4所示,免疫小鼠體內(nèi)血清抗體效價(D450 nm值)均比較高,對照小鼠血清抗體效價(D450 nm值)較低。在免疫的8只小鼠中,除2號不滿足實驗要求,其余小鼠抗體效價均達約為1∶32 000,可作為細胞融合的脾細胞供體。

圖4 三免后小鼠血清效價

2.5 雜交瘤細胞的篩選及腹水效價測定本研究進行陽性雜交瘤細胞株的亞克隆,采用有限稀釋法,之后篩選出4株陽性雜交瘤細胞株。分別命名為4A6、4G3、5F3和5G8,選取5F3株雜交瘤細胞進行腹水制備,采用正辛酸-飽和硫酸銨法對獲得腹水進行純化,純化后的腹水經(jīng)透析,SDS-PAGE電泳分析,抗體重鏈和輕鏈與預期一致。對純化后的mAb進行倍比稀釋,測定純化后抗體的效價達204 800(圖5),質量濃度為2.12 g/L。

A.雜交瘤細胞上清與PDCoV M蛋白反應;B.雜交瘤細胞上清與PDCoV全病毒反應

2.6 PDCoV M蛋白單克隆抗體與病毒反應的鑒定

2.6.1Western blot鑒定 經(jīng)Western blot(對PDCoV M蛋白進行稀釋)分析結果表明4株單克隆抗體均能檢測到抗M蛋白的特異性條帶,大小與預期相符,而對照組未出現(xiàn)類似大小條帶(圖6 )。

2.6.2PDCoV M蛋白單克隆抗體特異性鑒定 分別將PDCoV N蛋白和PDCoV M蛋白稀釋至1 mg/L包被酶標板,以稀釋的mAb作為一抗進行間接ELISA,結果如圖7所示,mAb與PDCoV M蛋白發(fā)生反應,具有較高的D450 nm值;與PDCoV N蛋白不反應,D450 nm值較低,說明mAb具有良好的特異性。

圖7 間接ELISA鑒定mAb的特異性

2.6.3mAb的亞類鑒定 按照SBA Clonotyping System-HRP試劑盒說明書對4株單克隆抗體進行亞型鑒定,鑒定出4株單克隆抗體均為IgG亞類,單克隆抗體為IgG2a型,單克隆抗體輕鏈類型均為κ(表 1)。

表1 PDCoV M 蛋白單克隆抗體亞類鑒定

2.6.4IFA鑒定 將PDCoV感染LLC-PK細胞,用雜交瘤細胞株的上清作為一抗,進行mAb的免疫熒光分析。結果顯示,4A6、4G3、5F3和5G8均可觀察到特異性綠色熒光,同時陽性對照(PDCoV N mAb為一抗)中,可明顯看到特異性綠色熒光,而陰性對照(SP2/0上清為一抗)中沒有綠色熒光(圖8),表明本研究所制備的4株單克隆抗體均可與PDCoV發(fā)生特異性反應。

A～C.PDCoV N mAb作為陽性對照與PDCoV感染的PK細胞進行特異性反應;D～F.PDCoV M 4A6 mAb與PDCoV感染的PK細胞進行特異性反應;G～I.PDCoV M 4G3 mAb與PDCoV感染的PK細胞進行特異性反應;J～L.PDCoV M 5F3 mAb與PDCoV感染的PK細胞進行特異性反應;M～O.PDCoV M 5G8 mAb與PDCoV感染的PK細胞進行特異性反應;P～R.SP2/0上清作為陰性對照與PDCoV感染的PK細胞進行特異性反應

3 討論

PDCoV作為近年來出現(xiàn)的一種新型冠狀病毒,自2014年在美國豬場首次暴發(fā)后[5],隨后在全球多個國家檢測到PDCoV的存在,目前已形成全球流行的趨勢,嚴重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。在臨床癥狀上面PDCoV與多種病毒(如豬流行性腹瀉病毒)表現(xiàn)十分相似,很難判別,在技術手段上借助實驗室診斷技術完成,而且臨床上多種病毒混合感染,給疾病綜合防控帶來很大的挑戰(zhàn)。即使近年來PDCoV各方面研究進一步發(fā)展,但是對該病毒具有廣泛宿主譜的機制尚不清楚。而且2021年的研究發(fā)現(xiàn)PDCoV跨種傳播給人,給人類健康帶來威脅。因此,快速構建PDCoV的診斷檢測方法,觀測豬群和人群中PDCoV受感染的情況具有十分重要的意義。

PDCoV M蛋白在刺激機體產(chǎn)生免疫應答中有著重要的作用。然而,在國內(nèi)單克隆方面的研究較少,目前,在針對M蛋白的特征,大量制備PDCoV M和針對M蛋白的抗體,為病毒的診斷奠定基礎。例如,史繼亞[30]制備的PDCoV M蛋白的單克隆抗體,用于間接免疫熒光法,逄鳳嬌等[31]和苑建軍等[32]針對PDCoV M基因建立了RT-PCR檢測方法,鄭蘭蘭等[33]和江珊等[34]用TaqMan熒光定量RT-PCR方法,可用于臨床PDCoV的檢測和流行病學的調查,魏姍等[35]最早構建重組M蛋白能與PDCoV陽性血清發(fā)生反應,馮宇等[36]、宋代麗等[37]和張藝旋等[38]通過原核表達PDCoV M蛋白,建立了間接ELISA檢測方法,對四川不同地區(qū)937份臨床樣品檢測,發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)樣本PDCoV抗體陽性率平均為32.01%,表明該地區(qū)PDCoV廣泛流行?？偠灾?以PDCoV M基因作為靶標,廣泛的研究已經(jīng)建立了相關的檢測方法。盡管如此,現(xiàn)階段仍然對PDCoV單克隆抗體開發(fā)方面的研究較少;因此,研發(fā)關于PDCoV相關的單克隆抗體是必不可少的。

因M蛋白是一種跨膜蛋白,對其全長進行表達難度較大,所以本研究選擇將M蛋白跨膜區(qū)去除,只表達暴露于病毒囊膜外的區(qū)域。

本研究利用PDCoVCH/XJYN/2016株M蛋白進行截短表達,通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng),表達及純化后的M為免疫原,利用雜交瘤技術,獲得4株能與PDCoV感染細胞產(chǎn)生特異性反應的單克隆抗體,ELISA結果發(fā)現(xiàn)4株單克隆抗體分泌抗體能力幾乎相同。IFA顯示4株mAb均能識別PDCoV,與Western blot結果是相符的,由此看來,本研究成功在體外原核表達了重組PDCoV M蛋白并制備了針對PDCoV M的單克隆抗體,為后續(xù)建立PDCoV臨床檢測方法及相關基礎研究提供了良好的實驗材料。