鄒 宏,羅 干,李 玲,夏應(yīng)菊,徐 璐,趙俊杰,張乾義*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 國(guó)家/OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室,北京100081;2.重慶市萬州區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,重慶 404100)

是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的RNA單鏈包膜病毒,分為種基因型(CSFV-1、CSFV-2、CSFV-3)和11種基因亞型,我國(guó)主要流行的有5個(gè)基因亞型,分別為1.1、2.1、2.2、2.3和3.4[1]?；谄涓甙l(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn),嚴(yán)重制約國(guó)內(nèi)外豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。CSFV基因組長(zhǎng)度約為 12.3 kb,包含個(gè)開放閱讀框和個(gè)非編碼區(qū)(UTR),翻譯成一種多聚蛋白[3],該多聚蛋白在病毒和宿主細(xì)胞酶的作用下形成4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1、E2)及8種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2-3、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B)[4],這些蛋白在CSFV的致病作用和免疫逃避中發(fā)揮重要作用,如位于病毒囊膜表面的E2蛋白,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,是研制新型疫苗和診斷試劑的首選靶蛋白[5];核衣殼C蛋白,可對(duì)CSFV C基因上特定氨基酸進(jìn)行突變,顯著降低子代病毒的產(chǎn)生[6];非結(jié)構(gòu)蛋白Npro,具有蛋白水解酶活性,會(huì)干擾宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng),會(huì)抑制干擾素(Interferons,IFN)的產(chǎn)生,也會(huì)與多種IFN調(diào)控因子的其他成員相互作用逃避宿主的先天免疫應(yīng)答[7]等。CSFV作為一種高致病性病原體,其致病機(jī)制和免疫逃避機(jī)制的研究一直受到國(guó)內(nèi)外動(dòng)物領(lǐng)域研究者廣泛關(guān)注?，F(xiàn)對(duì)CSFV可能的免疫逃避機(jī)制和防控策略進(jìn)行概述,以期為后期挖掘CSFV致病機(jī)理和與其相關(guān)的研究提供理論幫助。

1 CSFV逃避天然免疫應(yīng)答

1.1 天然免疫系統(tǒng)天然免疫系統(tǒng)是宿主機(jī)體內(nèi)最堅(jiān)實(shí)的一道防線,能在最短時(shí)間內(nèi)識(shí)別入侵的外源性病原相關(guān)分子模型(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)和內(nèi)源性危險(xiǎn)相關(guān)分子模型(damage associated molecular patterns,DAMPs)[8],發(fā)揮免疫保護(hù)作用,維持宿主機(jī)體的穩(wěn)定。在兩種模型識(shí)別中,發(fā)揮作用的主要是各種各樣的模型識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)[9]。隨著天然免疫系統(tǒng)的不斷深入研究,目前已經(jīng)鑒定出了類PRRs,分別為Toll樣受體[10](Toll-like receptors,TLRs)、RIG-Ⅰ樣受體[11](the retinoid acid-inducible gene-Ⅰ(RIG-Ⅰ)like receptors,RLRs)、NOD樣受體(nucleotide oligomerization domain (NOD) like receptors,NLRs)、AIM2樣受體[12](absent in melanoma 2(AIM2)like receptors,ALRs)。受體主要針對(duì)內(nèi)源性或外源性的病毒或細(xì)菌,與其特異性識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合觸發(fā)天然免疫反應(yīng),促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生IFN、炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)、誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡、自噬、焦亡等,在短時(shí)間內(nèi)對(duì)入侵的病原體進(jìn)行清除[13]。

1.2 CSFV抑制IFN產(chǎn)生研究表明,CSFV主要調(diào)控IFN的產(chǎn)生,分別為Ⅰ型和Ⅲ型IFN,RUGGLI等[14-15]發(fā)現(xiàn)CSFV利用Npro蛋白抑制Ⅰ型IFN,Npro是CSFV編碼的早期蛋白質(zhì),由細(xì)胞信號(hào)酶或病毒蛋白酶裂解產(chǎn)生,其N端1/2處具有個(gè)自體蛋白酶結(jié)構(gòu)域[16],Npro可以憑借蛋白酶體依賴的方式降低谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 s20的表達(dá)和tLR3的表達(dá)[17]。此外還可以介導(dǎo)IFN調(diào)控因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的泛素化和蛋白酶體降解,但并不抑制IRF3的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致Ⅰ型IFN的合成受到干擾[18]。在小鼠漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞感染模型中發(fā)現(xiàn)Npro還能與IFN調(diào)控因子7(Interferon regulatory factor 7,IRF7)相互作用抑制Ⅰ型IFN的合成[19],但該模型小鼠IRF3基因已敲除,而IRF7作為一種半衰期短的蛋白質(zhì),通常發(fā)現(xiàn)在Ⅰ型IFN誘導(dǎo)的后期被大量表達(dá)并參與機(jī)體的先天免疫,可見Npro與IRF7的相互作用機(jī)制還待進(jìn)一步研究[7]。

通過對(duì)豬宿主干擾素相關(guān)因子進(jìn)行篩選,鑒定出了型IFN的相關(guān)成員(包括IFN-λ1、IFN-λ3和IFN-λ4)[20],且在呼吸道和胃腸道上皮中發(fā)現(xiàn)型IFN可以通過獨(dú)立調(diào)節(jié)IFN調(diào)控因子1(Interferon regulatory factor 1,IRF1)或核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)[21]。CAO等[22]通過CSFV強(qiáng)毒株的持續(xù)感染發(fā)現(xiàn)IFN誘導(dǎo)劑(poly(I∶C))刺激細(xì)胞中型INF的產(chǎn)生被抑制,這種抑制主要是由于Npro引起IRF1的抑制表達(dá)及其核轉(zhuǎn)移降低型INF的產(chǎn)生。

1.3 CSFV調(diào)控細(xì)胞凋亡CSFV可直接或間接引起細(xì)胞凋亡,從而實(shí)現(xiàn)免疫逃避[23]。如CSFV感染引起骨髓造血細(xì)胞和骨髓淋巴細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致宿主淋巴細(xì)胞數(shù)量降低,降低宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)[24]。此外還有報(bào)道感染CSFV的細(xì)胞會(huì)分泌大量的細(xì)胞外病毒糖蛋白Erns,從而間接誘導(dǎo)相鄰細(xì)胞凋亡[25]。

CSFV感染還可依賴其編碼的蛋白延緩或抑制細(xì)胞凋亡,非結(jié)構(gòu)蛋白Npro、NS2和NS4B介導(dǎo)其中。Npro與抗凋亡蛋白HAX-1相互作用可以防止細(xì)胞對(duì)dsRNA的凋亡,猜測(cè)這也是CSFV體外感染不引起細(xì)胞病變的重要原因之一[26]。而NS2主要激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子并誘導(dǎo)豬臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而促進(jìn)白介素 (IL)-8和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)增加,并抵抗蛋白酶體抑制劑MG132誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[27]。NS4B能與重鏈鐵蛋白(ferritin heavy chain,FHC)相互作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的積累并促進(jìn) CSFV 在 PK- 15 細(xì)胞中的復(fù)制,在CSFV誘導(dǎo)線粒體自噬中揮重要作用[28]?？傊?在CSFV感染宿主細(xì)胞的早期,主要表現(xiàn)為抗凋亡,而在宿主細(xì)胞感染CSFV的晚期,凋亡效應(yīng)占主導(dǎo)地位[25]。

1.4 CSFV調(diào)控細(xì)胞自噬細(xì)胞自噬機(jī)制將病毒顆粒遞送至溶酶體進(jìn)行降解從而影響病毒復(fù)制是宿主抵抗病原體入侵的又一機(jī)制[29]。但CSFV巧妙地利用了宿主自身的細(xì)胞自噬機(jī)制,不僅自主誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬,而且還利用自噬機(jī)制進(jìn)行病毒復(fù)制和病毒釋放。目前關(guān)于CSFV利用細(xì)胞自噬進(jìn)行免疫逃避的策略有兩種方式,其一是CSFV通過自身的線粒體基因序列靶向線粒體,依賴PINK1-PRKN途徑進(jìn)行可選擇性線粒體自噬[30]。

在CSFV線粒體自噬研究中,FAN等[30]發(fā)現(xiàn)CSFV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3可以和乳酸脫氫酶B(lactate dehydrogenase B,LDHB)相互作用。通過抑制 LDHB發(fā)現(xiàn),線粒體自噬蛋白 TOMM20和 VDAC1的表達(dá)下降,線粒體融合介質(zhì) MFN2的泛素化和受線粒體自噬調(diào)控的 NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)被促進(jìn),而CSFV的感染使NF-κB抗病毒應(yīng)答失效。

ZHANG等[31]發(fā)現(xiàn)CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A也在CSFV誘導(dǎo)的線粒體自噬中發(fā)揮作用。利用CSFV感染PK-15細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)NS5A的表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)膜電位喪失和線粒體分裂,線粒體的數(shù)量和PINK1的表達(dá)都明顯增加, ROS的表達(dá)水平明顯增加,宿主不等不激活線粒體自噬維持線粒體穩(wěn)定。

另外一種自噬是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)自噬,宿主為維持各種刺激對(duì)ER穩(wěn)態(tài)的擾動(dòng),通過激活個(gè)未折疊蛋白響應(yīng)(unfolded protein response,UPR):包括蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R—like ER kinase,PERK)、肌醇需要酶1(inosital requiring enzyme 1,IRE1)和激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)來緩解ER應(yīng)激。CSFV感染后,這種響應(yīng)在主要免疫器官和部分非免疫器官中被不同程度的激活,但在非免疫器官中一般只激活I(lǐng)RE1途徑,且CSFV感染較輕[32]。

此外CSFV誘導(dǎo)的自噬與自噬受體核點(diǎn)蛋白ND52的表達(dá)也有關(guān)系,通過抑制NDP52發(fā)現(xiàn)可以減少外泌體蛋白CD63的表達(dá)與CSFV E2蛋白的結(jié)合和進(jìn)入自噬泡,而E2蛋白在CSFV的持續(xù)感染中具有重要作用。而抑制NDP52會(huì)促進(jìn)IFN的釋放,并促進(jìn)NF-κB抗病毒效應(yīng)的激活[33]。LI等[34]發(fā)現(xiàn)IFN誘導(dǎo)IFN刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的表達(dá)會(huì)減弱CSFV的復(fù)制,但I(xiàn)SG15基因的上調(diào)會(huì)抑制自噬,而自噬又是CSFV復(fù)制所不可缺少的。總之,CSFV誘導(dǎo)自噬的免疫逃避機(jī)制復(fù)雜,涉及到其他各個(gè)機(jī)制之間的相互作用,需進(jìn)一步進(jìn)行探究。

1.5 CSFV調(diào)控細(xì)胞焦亡與炎癥反應(yīng)細(xì)胞焦亡表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞內(nèi)容物釋放進(jìn)而激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)的一種程序性死亡過程。已有研究證實(shí),CSFV調(diào)控宿主細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)能夠促進(jìn)CSFV免疫逃避和復(fù)制[35]。CSFV的病毒成分可以激活大量炎性小體如NLRP3、NLRC4和NLRP1,誘導(dǎo)宿主發(fā)生炎癥反應(yīng)[25]。其中NLRP3炎癥小體的組裝是Caspase-1激活和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵,通過Caspase-1途徑裂解GSDMD蛋白可以形成GSDMD-N和GSDMD-C蛋白片段,而GSDMD-N能夠引起細(xì)胞膜穿孔和細(xì)胞炭化導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[36]。

2 CSFV逃避適應(yīng)性免疫應(yīng)答

CSFV感染隨毒株毒力的高低引起不同的宿主體液免疫和細(xì)胞免疫。強(qiáng)毒力毒株致病性較強(qiáng),短時(shí)間內(nèi)就能導(dǎo)致宿主死亡;中等毒力毒株差異大,可對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)造成不同程度的損傷,如白細(xì)胞減少癥、循環(huán)系統(tǒng)中淋巴細(xì)胞的衰減及淋巴組織的功能衰退、胸腺萎縮等;而低毒力毒株免疫反應(yīng)輕微或不產(chǎn)生免疫反應(yīng)應(yīng)答[37]。在宿主的體液免疫中,抗病毒作用的主要是特異性中和抗體,能與CSFV外膜上的抗原性蛋白E0和E2結(jié)合,中和病毒并增強(qiáng)對(duì)病毒的吞噬[38]。B細(xì)胞作為CSFV的主要靶細(xì)胞之一,CSFV感染后,外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的B細(xì)胞數(shù)量明顯降低,但PBMC中B細(xì)胞的數(shù)量較少,為20%左右,不足以解釋CSFV感染引起的白細(xì)胞減少癥和淋巴樣組織中淋巴細(xì)胞的減少[39]。因此有研究表明特異性T淋巴細(xì)胞也參與了抗CSFV的體液免疫,而B細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的衰減將抑制特異性中和抗體的產(chǎn)生,導(dǎo)致CSFV大量復(fù)制[40]。

CSFV感染后使淋巴細(xì)胞(包括敏感的T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、顆粒白細(xì)胞等)凋亡是其免疫逃避的主要策略,其外膜上的糖蛋白Erns能夠在細(xì)胞膜通透性改變之前誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞蛋白的合成,從而導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡[41]。

3 CSF的防控

CSF是由CSFV感染引起的,主要特征為高致病率和高死亡率,科學(xué)的生物安全措施和疫苗接種是預(yù)防和控制CSF的主要方法。隨著C 株疫苗的使用、CSFV的監(jiān)測(cè)、科學(xué)的CSFV防控措施,CSF得到了有效的控制,但多地報(bào)道CSF已經(jīng)演變?yōu)橐环N慢性非典型流行趨勢(shì),表現(xiàn)為仔豬生長(zhǎng)遲緩、震顫、妊娠母豬流產(chǎn)等[42]。如在古巴,慢性非典型的CSF已經(jīng)演變成了一種地方性疫病,每年頻發(fā),嚴(yán)重威脅豬群的健康[43]。研究表明在感染低毒力CSFV或患慢性非典型CSF的動(dòng)物血清中IFN和其他炎性細(xì)胞因子的濃度非常低,雖然會(huì)短暫的引起宿主淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少,但宿主基本上不發(fā)生免疫反應(yīng)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),CSFV會(huì)大量復(fù)制,最終導(dǎo)致宿主死亡或可能會(huì)造成終身免疫,母豬通過垂直傳播給下一代造成CSFV免疫失敗[44]。因此在實(shí)際工作為更好地防控CSFV,應(yīng)切實(shí)遵守各地公布的CSF科學(xué)防控建議,做好養(yǎng)殖場(chǎng)消毒和疫苗接種工作,對(duì)豬群進(jìn)行常見傳染病病原監(jiān)測(cè),對(duì)患病母豬及仔豬及時(shí)淘汰。此外BVDV作為CSFV同屬成員之一,與CSFV有相似的基因結(jié)構(gòu)和抗原性,且BVDV能感染豬,造成和慢性非典型CSF相似的臨床癥狀,導(dǎo)致CSFV疫苗的免疫失敗。研究表明,CSFV和BVDV的混合感染主要原因是由于牛源生物制品的使用,在大量的牛血清中有檢測(cè)到BVDV的存在,因此養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)豬群中BVDV的檢測(cè)和牛源生物制品中BVDV的檢測(cè)對(duì)CSFV的防控意義重大[45]。

4 小結(jié)和展望

徹底根除CSF的困擾,是國(guó)內(nèi)外動(dòng)物學(xué)領(lǐng)域研究者和獸醫(yī)人員堅(jiān)持不懈的動(dòng)力。但僅僅通過科學(xué)的生物安全措施和疫苗接種策略難以根除CSFV,因此進(jìn)一步研究CSFV的免疫逃避機(jī)制、致病機(jī)制、CSFV與宿主的相互作用及開發(fā)抗CSFV藥物的意義重大。

通過對(duì)CSFV可能發(fā)生的免疫逃避策略進(jìn)行了一個(gè)概述發(fā)現(xiàn),CSFV在與宿主相互作用的過程中通過逃避PRRs受體的識(shí)別、抑制抗病毒因子如IFN、NF-κB的誘導(dǎo)、導(dǎo)致宿主淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡等是其免疫逃避的主要策略,且每個(gè)策略之間相互作用,共同促進(jìn)CSFV的復(fù)制。通過對(duì)每一個(gè)策略進(jìn)一步挖掘發(fā)現(xiàn),在CSFV免疫逃避實(shí)施過程中發(fā)揮作用的主要是其編碼的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白,通過與宿主細(xì)胞膜上的特異性識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮誘導(dǎo)作用,而正是這種結(jié)合使研究者們發(fā)現(xiàn)了潛在的抗CSFV感染的靶標(biāo)位置,給抗CSFV感染和致病機(jī)制的研究提供了研究基礎(chǔ),給抗CSFV藥物和基因工程疫苗的研發(fā)提供了理論依據(jù)。FAN等[46]發(fā)現(xiàn)宿主的許多蛋白在抗CSFV感染發(fā)揮相反的作用,是潛在的靶標(biāo)位置,包括小Rab GTP酶家族的許多成員(Rab1A、Rab1b、Rab2)、蛋白質(zhì)激酶PKR、PCBP1蛋白、MERTK蛋白、Tsg101蛋白、Anx2蛋白、LamR蛋白、CCDC115蛋白、SERTAD1蛋白等。

細(xì)胞自噬的行為是每個(gè)生物體都會(huì)發(fā)生的一種免疫現(xiàn)象,其中線粒體自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬是目前最新的自噬機(jī)制。線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為生物體中重要的細(xì)胞器,在生物生命中發(fā)揮重要的作用。關(guān)于CSFV線粒體自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的研究中涉及到的PINK1-PRKN途徑、個(gè)未折疊蛋白響應(yīng)、NF-κB抗病毒效應(yīng)因子也是人類生命健康研究中的重要組成部分,其中PINK1-PRKN途徑涉及到阿爾茨海默病(alzheimer disease,AD)的研究[47],NF-κB抗病毒效應(yīng)因子不僅僅在抗病毒方面有積極作用,在抗腫瘤方面也有重要意義[48],因此CSFV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的研究不僅僅在CSFV防控中意義較大,也在生物公共健康安全方面的研究中發(fā)揮積極的補(bǔ)充作用。