任項(xiàng)霏,馮賀龍,徐英英,李 麗,楊宏春,王 鑫,商 雨,陽柳君,周祖濤,李自力,劉 梅,羅青平,胡思順*,溫國元*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/動物醫(yī)學(xué)院,湖北 武漢 430070;2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,湖北 武漢 430064;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430064;4.畜禽病原微生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430064;5.湖北洪山實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070;6.湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070)

天蠶素(Cecropin)是世界上首個被發(fā)現(xiàn)的抗菌肽,含有A、B、C、D種以及其他類似物[1]。Cecropin AD(CAD)是人工設(shè)計(jì)的由Cecropin A的氨基端1～11個氨基酸和Cecropin D的羧基端12～37個氨基酸殘基組成的一種雜合肽[2],該抗菌肽有較強(qiáng)的抗細(xì)菌、病毒和腫瘤等多種生物活性[3],無細(xì)胞毒性作用[4-6]。其殺菌活性和抗菌譜明顯優(yōu)于Cecropin A和Cecropin D,且殺菌活性是Cecropin D的5～55倍,對枯草芽孢桿菌的抑制活性是Cecropin A的6倍[7-8];CAD對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果尤為明顯,MIC分別為1.8,0.2 g/L[9]。CAD耐高溫性較強(qiáng),在100℃下放置3 h仍能具有抑菌活性[10]。因此,CAD抗菌肽作為抗生素替代物,在禽病治療方面具有較好的應(yīng)用前景。

天然的提取工藝復(fù)雜,含量極低。盡管可以利用固相肽進(jìn)行人工化學(xué)合成,但其合成價格昂貴,不利于其在大規(guī)模畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用[11]。因此,采用基因工程的方法制備抗菌肽是當(dāng)前研究的熱點(diǎn),也是表達(dá)有活性抗菌肽的有效途徑之一。在目前可用的表達(dá)系統(tǒng)中,因抗菌肽對宿主細(xì)胞有一定的毒性作用以及對蛋白酶非常敏感,所以很難在不添加融合蛋白的情況下,利用原核表達(dá)系統(tǒng)單獨(dú)地表達(dá)有活性的小分子抗菌肽[12]。因其相對分子質(zhì)量較小,所以在利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽時,會出現(xiàn)純化難、表達(dá)量低等問題[10]。

新城疫病毒(NDV)載體是一種常見的疫苗載體,因其RNA基因組不能整合到宿主DNA染色體上[13-14],在癌癥治療中的溶瘤特性[15],具備穩(wěn)定的表達(dá)效率[16-17],以及在載體疫苗應(yīng)用中的相對安全性[17-19],使NDV載體具有十分廣泛的應(yīng)用前景。

本研究利用NDV載體系統(tǒng)表達(dá)CAD抗菌肽,通過RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)檢測重組病毒CAD的表達(dá),并通過體外抑菌試驗(yàn)檢測重組NDV表達(dá)的CAD的抑菌活性,為CAD抗菌肽的臨床應(yīng)用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒 敘利亞幼地鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)、NDV全長克隆質(zhì)粒pTS09-C、輔助質(zhì)粒pVAX-NP、pVAX-P、pVAX-L,表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組痘病毒由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存;SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司;金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸桿菌ATCC25922由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑 LipofectamineTM3000試劑盒購自Thermo Fisher公司;TPCK-胰酶購自Sigma公司;雞源NDV陽性血清購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所;HA-tag多克隆抗體購自Proteintech公司;FITC標(biāo)記的羊抗雞IgG抗體和RBIT標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3CAD基因設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)以及NCBI中的CAD成熟肽的基因序列,在其羧基端加上HA-tag,具體氨基酸序列為KWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAKYPYDVPDYA,斜體表示HA-tag,具體基因序列為aag tgg aag ctg ttc aag aag atc gag aag gtg ggc cag cgc gtg cgc gac gcc gtg atc agc gcc ggc ccc gcc gtg gcc acc gtg gcc cac gcc acc gcc ctg gcc aag TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT,小寫字母表示CAD,大寫字母表示HA-tag,該基因序列由上海生物工程公司合成并連接到質(zhì)粒pUC57中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC57-CAD。

1.2 含CAD基因的NDV全長克隆質(zhì)粒的構(gòu)建以合成的pUC57-CAD為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增CAD片段。為了將AD以單獨(dú)編碼閱讀框的方式插入pTS09-C載體中,通過PCR擴(kuò)增將基因起始序列(GS)、基因終止序列(GE)和Kozak序列分別添加至CAD的N端[20]。以pTS09-C為模板,反向PCR擴(kuò)增載體大片段,并采用In-Fusion酶同源重組的方法,將包含有GE、GS和Kozak序列的CAD片段與載體大片段相連接。在50℃連接15 min后,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中,37℃培養(yǎng)18～24 h,挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR及酶切鑒定,并送至公司進(jìn)行測序分析,構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pTS-CAD。用于構(gòu)建質(zhì)粒的引物序列見表1。

表1 用于構(gòu)建重組質(zhì)粒pTS-CAD的引物序列

1.3 重組病毒的拯救與鑒定將痘病毒vTF7-3按照0.01 MOI的接種劑量預(yù)感染BHK-21細(xì)胞2 h。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法[17],將插入有CAD的重組質(zhì)粒和NP、P、L個輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,質(zhì)粒的量分別為1.250,0.313,0.313,0.625 μg。轉(zhuǎn)染6 h后,加入含有0.2 g/L TPCK胰酶的維持液[21]。每天觀察細(xì)胞狀態(tài),待細(xì)胞發(fā)生明顯病變,反復(fù)凍融細(xì)胞3次,收獲上清液,0.22 μm濾器過濾去除痘病毒。將其按照200 μL/枚的劑量接種9～11日齡SPF雞胚37℃孵育45 d后收取尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)[22]。血凝試驗(yàn)結(jié)果呈陽性的尿囊液,進(jìn)行RT-PCR,并送公司測序鑒定。拯救成功的重組病毒命名為rTS-CAD。

1.4 重組病毒的生長曲線測定將重組病毒以0.1 MOI接種BHK-21細(xì)胞,感染1 h后換含有0.2 g/L TPCK胰酶的DMEM維持液,37℃、5% CO2培養(yǎng),分別在12,24,36,48,60,72,84,96 h取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,測定其TCID50,并繪制重組病毒的生長動力學(xué)曲線。

1.5 致病性分析將重組病毒rTS-CAD做10倍梯度稀釋,取10-5～-9個稀釋度的病毒液分別接種SPF雞胚5枚,棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚,記錄雞胚的死亡時間,計(jì)算重組病毒的雞胚最小致死量的平均死亡時間(MDT/MLD)。

1.6 CAD在重組病毒中的表達(dá)鑒定為了檢測CAD的表達(dá),將BHK-21細(xì)胞在12孔板上培養(yǎng),待細(xì)胞長至80%～90%,在培養(yǎng)箱孵育1 h。孵育結(jié)束后,PBS洗2～3遍,再分別感染2 MOI的rTS-CAD,繼續(xù)孵育2 h,換上含有0.2 g/L TPCK-胰酶的維持液[23]。24 h后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,用0.5% Triton X-100透化細(xì)胞。以3% BSA進(jìn)行封閉處理后,分別用NDV陽性血清和鼠源HA-tag抗體檢測NDV蛋白和CAD抗菌肽的表達(dá),然后,以FITC標(biāo)記的兔抗雞抗體和RBIT標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體為二抗,最后以DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.7 CAD的抑菌活性測定

1.7.1微孔板抑菌試驗(yàn) 以金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸桿菌ATCC25922為試驗(yàn)菌株,過夜搖菌,菌落計(jì)數(shù)后稀釋至103CFU/mL,轉(zhuǎn)移至96孔板中,50 μL/孔 (103CFU/mL),從第1孔開始,依次2倍稀釋至第10孔,棄去50 μL混合物,每孔再加入100 μL感染有重組病毒的尿囊液/感染BHK-21細(xì)胞上清(圖1),陰性對照孔不加菌液,加入等體積的LB培養(yǎng)基,陽性對照孔為菌液對照孔,只加入培養(yǎng)基和等量菌液。每組設(shè)3個重復(fù),37℃溫箱培養(yǎng)18～24 h,在陽性對照和陰性對照正常的情況下,根據(jù)加樣孔培養(yǎng)基是否變混濁判斷結(jié)果,混濁孔記為“+”,澄清孔記為“-”再計(jì)算其抑制率,即存活率%=試驗(yàn)組菌液稀釋度/對照組菌液稀釋度×100%,抑制率%=100%-存活率%。

圖1 微孔板抑菌驗(yàn)示意圖

1.7.2DF-1細(xì)胞共培養(yǎng)法抑菌試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[23-24],驗(yàn)證其抗菌活性。將1.0 MOI的重組病毒rTS09-C和rTS-CAD分別接種于DF-1細(xì)胞,2 h后換成含有0.2 g/L TPCK-胰酶的DMEM維持液。在感染24 h時,加入103CFU/mL新鮮菌液100 μL,繼續(xù)培養(yǎng)。分別在12,24 h取培養(yǎng)液上清進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),并以TS09-C試驗(yàn)組為參照計(jì)算抑菌率(即細(xì)菌存活率%=rTS-CAD組菌落數(shù)/TS09-C組菌落數(shù)×100%,抑菌率%=100%-存活率%)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pTS-CAD的構(gòu)建與鑒定按照構(gòu)建策略將外源基因插入至NDV載體的P基因和M基因之間(圖2),PCR擴(kuò)增CAD片段,大小為150 bp,再利用反向PCR將pTS09-C進(jìn)行載體線性化,長度為18 326 bp,電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增片段的大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。以同源重組的方法連接兩個PCR片段,獲得pTS-CAD重組質(zhì)粒。在菌液PCR正確情況下,提取質(zhì)粒并對兩種重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ酶切鑒定,結(jié)果與預(yù)期一致(圖4)。將重組質(zhì)粒送往公司測序,測序結(jié)果與預(yù)期一致,表明重組質(zhì)粒pTS-CAD構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pTS-CAD的構(gòu)建示意圖

1.pTS09-C 載體線性化反向PCR擴(kuò)增;2.CAD片段擴(kuò)增

M1.DL5000 DNA Marker; M2.DL15000 DNA Marker;1.pTS-CAD BamHⅠ單酶切產(chǎn)物

2.2 重組病毒的拯救及其鑒定通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pTS-CAD和3種輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞,48 h后可見明顯的細(xì)胞病變,部分出現(xiàn)皺縮變圓,脫落現(xiàn)象。將細(xì)胞裂解后接種9～11日齡SPF雞胚,血凝試驗(yàn)檢測陽性尿囊液血凝效價為26。如圖5所示,利用鑒定引物將陽性的尿囊液進(jìn)行NDV PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出大小為1 258 bp的DNA片段。PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行測序鑒定,結(jié)果與預(yù)期一致,表明rTS-CAD重組病毒拯救成功。

M.DL2000 DNA Marker;1.TS09-C鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物;2.rTS-CAD鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 重組病毒的生物學(xué)特性為了研究在NDV TS09-C株的P和M基因之間插入CAD基因是否改變其生物學(xué)特性,測定了重組病毒的雞胚增殖滴度、生長曲線和致病性。結(jié)果顯示,重組病毒rTS-CAD與親本TS09-C株具有相似的增殖特性,感染BHK-21細(xì)胞后于60～96 h達(dá)到平臺期,滴度為106.99TCID50/mL(圖6);其雞胚增殖滴度為109.75EID50/mL。重組病毒rTS-CAD的MDT/MLD值大于120 h,保持了其弱毒特性。上述結(jié)果表明,CAD基因的插入未改變TS09-C株的弱毒和增殖特性。

圖6 重組病毒rTS-CAD在BHK-21細(xì)胞的生長曲線

2.4 CAD抗菌肽在重組病毒rTS-CAD中的表達(dá)鑒定間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示,感染rTS-CAD的細(xì)胞內(nèi)可同時檢測到NDV蛋白(綠色熒光)和CAD(紅色熒光),但在感染TS09-C株的細(xì)胞孔中僅檢測到NDV(綠色熒光),未檢測到紅色熒光(圖7),表明重組病毒rTS-CAD可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)CAD抗菌肽。

2.5 重組病毒表達(dá)的CAD的抑菌活性檢測

2.5.1微孔板法抑菌試驗(yàn) 在金黃色葡萄球菌抑制試驗(yàn)中,重組病毒尿囊液中表達(dá)的CAD抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑制率為79.6%,其感染細(xì)胞上清中的CAD對金黃色葡萄球菌的抑制率為91.7%(表2)。在大腸桿菌抑制試驗(yàn)中,重組病毒尿囊液中表達(dá)的CAD抗菌肽對大腸桿菌的抑制率為89.8%,其感染細(xì)胞上清中的CAD對大腸桿菌的抑制率為87.5%(表3)。

表2 重組病毒表達(dá)的CAD尿囊液和感染細(xì)胞上清對金黃色葡萄球菌(ATCC29213)的抑制作用

表3 重組病毒表達(dá)的CAD尿囊液和感染細(xì)胞上清對對大腸桿菌(ATCC25922)的抑制作用

2.5.2DF-1細(xì)胞共培養(yǎng)法抑菌試驗(yàn) 感染rTS-CAD重組病毒的DF-1細(xì)胞與細(xì)菌共培養(yǎng),如圖8所示,培養(yǎng)12 h后,對金黃色葡萄球菌的抑制率為74.5%,對大腸桿菌的抑制率為35.0%;共培養(yǎng)24 h,對金黃色葡萄球菌的抑制率達(dá)到77.7%,對大腸桿菌的抑制率提高至45.0%。結(jié)果表明,重組病毒感染DF-1后表達(dá)的CAD展示出一定的抑菌活性。

圖8 DF-1細(xì)胞上驗(yàn)證重組病毒表達(dá)的CAD對細(xì)菌的抑制作用

3 討論

隨著抗生素濫用所導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥問題日益突出,尋找新型抗菌藥物逐漸成為研究熱點(diǎn)?？咕囊蚱洫?dú)特的抗菌機(jī)制,使其在抑菌/殺菌的同時不易產(chǎn)生耐藥性。但是,天然抗菌肽的產(chǎn)量低,其生產(chǎn)應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。因此,通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽,可解決其生產(chǎn)成本高昂的問題,提升了抗菌肽在細(xì)菌病治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

當(dāng)前用于表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌以及桿狀病毒。在利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽時,其易形成包涵體,純化難度高、表達(dá)量低,抗菌肽對宿主菌可能存在一定的殺傷作用,因此大多采用融合方式,在抗菌肽的氨基端或羧基端融合一個可溶性蛋白,如SUMO、CLEP、Trx等[25-27]。彭建等[28]構(gòu)建GST表達(dá)載體利用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行融合表達(dá)Cec4,最終親和純化出0.117 g/L的蛋白。ZHANG等[29]利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)AD,從培養(yǎng)上清中純化出0.026 g/L的重組AD。牛軍波等[7]利用畢赤酵母表達(dá)AD串聯(lián)體,確定了AD不僅對常見致病菌有抑制作用,而且可以在高溫處理后仍具有抑菌活性。此外,AD在30 U/mL的胰蛋白酶下仍具有抑菌活性,并表明AD不具有溶血活性[30]。黃亞東等[31]同樣利用桿狀病毒表達(dá)載體,在Sf9細(xì)胞和苜蓿丫紋夜蛾幼蟲中成功表達(dá)AD,其表達(dá)產(chǎn)物具有抑菌活性,但未純化出抗菌肽。以上這些生產(chǎn)系統(tǒng)均需要對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,且純化難度較大,一定程度上限制了這些表達(dá)的抗菌肽的應(yīng)用效果。

NDV作為疫苗開發(fā)和基因傳遞的載體,已被廣泛應(yīng)用于多種活載體疫苗和藥物的研發(fā)[32-33],具有良好的應(yīng)用基礎(chǔ)和前景。本研究將CAD插入至NDV TS09-C弱毒株,獲得了重組病毒rTS-CAD株,該重組病毒可以高效表達(dá)CAD,表明利用NDV作為載體表達(dá)CAD的方法是可行的。目前養(yǎng)雞場都會定期免疫新城疫疫苗來預(yù)防新城疫,若將重組病毒rTS-CAD通過雞呼吸道免疫,重組病毒rTS-CAD可以在病毒增殖的同時表達(dá)CAD,從而對細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用,進(jìn)而增強(qiáng)局部組織抵抗細(xì)菌和NDV感染能力。因此,利用NDV載體表達(dá)CAD或其他抗菌肽在預(yù)防和控制呼吸系統(tǒng)疾病方面具有較好的應(yīng)用前景。

本研究選擇NDV TS09-C弱毒株的反向遺傳操作系統(tǒng)[11],在P蛋白和M蛋白之間引入CAD的ORF。通過病毒拯救,成功獲得了重組病毒rTS-CAD,該病毒能夠在雞胚中高效增殖,并具有一定的抑菌作用。在微孔板法抑菌試驗(yàn)中,重組病毒表達(dá)的CAD抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑制率為79.6%～91.7%;對大腸桿菌的抑制率為87.5%～89.8%。在細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)中,重組病毒表達(dá)的CAD抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑制率可以達(dá)到74.5%～77.7%;對大腸桿菌的抑制率為35.0%～45.0%。這些結(jié)果為后續(xù)將開展重組病毒在雞體內(nèi)的抑菌效果試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ),也為抗菌肽在家禽細(xì)菌病防控中的應(yīng)用提供了新的思路和方法。另外,具有調(diào)節(jié)免疫、促中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞的趨化等功能[3]。本研究構(gòu)建的重組病毒rTS-CAD可能具有改善NDV弱毒疫苗的功能和提高NDV疫苗免疫效果的潛力。