丁晨夢(mèng),孫亞威,石蒙蒙,韓紫薇,許夕雅,呂晨哲,齊江坤,楊 寒,于林洋,李永濤,陳 陸

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450046)

偽狂犬病(pseudorabies,PR)是偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的豬、牛、羊等多種動(dòng)物的一種烈性傳染病,其主要特征為發(fā)熱、腦脊髓炎和繁殖障礙,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大[1-3]。豬是PRV的天然宿主,各年齡段的豬均易感,豬感染病毒耐過后可在體內(nèi)形成潛伏感染,當(dāng)受到外界環(huán)境應(yīng)激或者機(jī)體免疫力下降時(shí),可以引起復(fù)發(fā)性感染[4]。目前防控PR的主要策略仍是接種疫苗。2011年以來(lái),PRV變異株在我國(guó)豬群中暴發(fā)流行,傳統(tǒng)的Bartha-K61已無(wú)法提供完全保護(hù)[5-7]。

基因缺失疫苗是利用基因工程技術(shù)剔除特定的毒力基因或基因片段而獲得毒力減弱但仍保持良好免疫原性的突變株,基因缺失苗具有毒力不返強(qiáng),易與野毒區(qū)分的特點(diǎn)。gE、TK基因是PRV主要的毒力基因且增殖非必需基因,缺失后病毒毒力明顯降低,不影響病毒的復(fù)制和免疫原性[8-9]。主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC,在豬中稱為豬白細(xì)胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA))Ⅰ類分子與抗原多肽結(jié)合后形成MHCⅠ類分子復(fù)合物,進(jìn)一步將抗原遞呈到細(xì)胞表面,激活幼稚CD8+T細(xì)胞分化形成特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫功能。豬TAP是由TAP1和TAP2組成的異源二聚體,能選擇性吸附抗原肽,并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi),當(dāng)TAP表達(dá)受阻時(shí),會(huì)下調(diào)細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的展示[10]。PRV UL49.5編碼蛋白可影響TAP轉(zhuǎn)運(yùn)抗原肽的能力,導(dǎo)致MHCⅠ分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)滯留,從而下調(diào)細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的展示,達(dá)到減弱細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的清除作用,來(lái)逃避宿主的免疫監(jiān)視[11-12]。本試驗(yàn)在PRV ΔgE/TK的基礎(chǔ)上缺失UL49.5基因,構(gòu)建PRV ΔgE/TK/UL49.5基因缺失株,通過分析其生物學(xué)特性、測(cè)定UL49.5缺失株抗原遞呈能力及其安全性,為新型PRV基因缺失疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞和質(zhì)粒PRV YY流行株和PRV ΔgE/TK雙基因缺失株由本實(shí)驗(yàn)室保存;293T細(xì)胞、Vero細(xì)胞和PK-15細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC;pBluescript SK(-)質(zhì)粒、pEGFP質(zhì)粒、pcGlobin2-Cre質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、Hind Ⅲ、EcoRⅠ、SpeⅠ,rTaq DNA Polymerase、T4DNA ligase為TaKaRa公司產(chǎn)品;無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;2×DMEM高糖培養(yǎng)基為杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Lipofectamine 2000 Reagen為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物6周齡健康雌性昆明小鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 引物設(shè)計(jì)參照GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的PRV HN1201(KP722022.1)序列和pEGFP質(zhì)粒全序列,用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)用于左、右側(cè)同源臂擴(kuò)增、EGFP插入基因和基因缺失鑒定的引物(表1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.5 重組質(zhì)粒pSK-UL49.5L/R-EGFP的構(gòu)建與鑒定以PRV YY株病毒DNA為模板,利用引物UL49.5L-F/R和UL49.5R-F/R分別擴(kuò)增PRV UL49.5基因左、右側(cè)同源臂,雙酶切后定向克隆至pBluescript SK(-),獲得重組質(zhì)粒pSK-UL49.5L/R。利用引物EGFP-F/R擴(kuò)增EGFP片段,進(jìn)行雙酶切克隆至pSK-UL49.5L/R,構(gòu)建重組質(zhì)粒pSK-UL49.5L/R-EGFP。KpnⅠ、SpeⅠ酶切并測(cè)序鑒定。

1.6 重組病毒PRV ΔgE/TK/UL49.5的構(gòu)建與鑒定通過同源重組和Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建重組病毒PRV ΔgE/TK/UL49.5。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PRV ΔgE/TK株基因組與重組質(zhì)粒pSK-UL49.5L/R-EGFP共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染6 h后換液,待出現(xiàn)80%細(xì)胞病變時(shí)收毒,進(jìn)行蝕斑純化,直至熒光顯微鏡下觀察的蝕斑均為綠色熒光,使用引物UL49.5-F/R對(duì)重組病毒PRV ΔgE/TK/UL49.5/EGFP+株進(jìn)行PCR鑒定。

將pcGlobin2-Cre質(zhì)粒與PRV ΔgE/TK/UL49.5/EGFP+株基因組共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染6 h后換液,待出現(xiàn)80%細(xì)胞病變時(shí)收毒,經(jīng)蝕斑純化挑取不帶綠色熒光的蝕斑,直至顯微鏡下觀察到的蝕斑均不表達(dá)綠色熒光,使用引物UL49.5-F/R對(duì)重組病毒PRV ΔgE/TK/UL49.5株進(jìn)行PCR鑒定。

1.7 重組病毒PRV ΔgE/TK/UL49.5株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定將PRV ΔgE/TK/UL49.5株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳至第20代,每隔1代提取病毒DNA用引物gD-F/R進(jìn)行PCR鑒定及測(cè)序。PCR反應(yīng)條件:95℃ 5 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,擴(kuò)增34個(gè)循環(huán);72℃ 5 min;4℃保存。

1.8 重組病毒PRV ΔgE/TK/UL49.5株一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定將PRV YY、PRV ΔgE/TK和PRV ΔgE/TK/UL49.5以MOI=0.01的病毒量接種于6孔細(xì)胞板的Vero單層細(xì)胞,設(shè)正常Vero細(xì)胞作為陰性對(duì)照,3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。接毒后6,12,24,36,48,60,72 h收獲病毒,進(jìn)行滴度測(cè)定,Reed-Muench法計(jì)算TCID50,繪制一步生長(zhǎng)曲線。

1.9 PRV UL49.5基因缺失對(duì)細(xì)胞總SLAⅠ和TAP轉(zhuǎn)錄水平的影響將PRV ΔgE/TK/UL49.5、PRV ΔgE/TK、PRV YY和pUL49.5重組質(zhì)粒接種于PK-15細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照,在感染后6,12,18,24 h收取細(xì)胞,提取RNA,取3 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用引物SLAⅠ-qF/R擴(kuò)增SLAⅠ,利用引物TAP1-qF/R和TAP2-qF/R擴(kuò)增TAP1和TAP2,豬β-actin基因作為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算SLAⅠ和TAP相對(duì)表達(dá)量。

1.10 小鼠安全性試驗(yàn)將32只6周齡健康雌性昆明小鼠隨機(jī)分為4組,每組8只,第1,2和3組分別經(jīng)后肢肌肉接種1×106TCID50的PRV YY、PRV ΔgE/TK和PRV ΔgE/TK/UL49.5,第4組接種DMEM溶液,每天觀察并記錄小鼠的臨床情況。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pSK-UL49.5L/R-EGFP的酶切鑒定pSK-UL49.5L/R-EGFP經(jīng)KpnⅠ、SpeⅠ雙酶切后,電泳結(jié)果顯示有2條帶,分別為2 880和3 296 bp;經(jīng)KpnⅠ單酶切后,目的條帶為6 176 bp,與預(yù)期結(jié)果一致(圖1),測(cè)序結(jié)果正確,證明重組質(zhì)粒pSK-UL49.5L/R-EGFP構(gòu)建成功。

M.DL15000 DNA Marker;1.KpnⅠ、SpeⅠ雙酶切;2.KpnⅠ單酶切

2.2 重組病毒PRV ΔgE/TK/UL49.5/EGFP+株的鑒定PRV ΔgE/TK株基因組與重組質(zhì)粒pSK-UL49.5-LR-EGFP進(jìn)行同源重組,經(jīng)過蝕斑純化,直至病變細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光(圖2)。利用引物UL49.5-F/R進(jìn)行PCR鑒定,PRV ΔgE/TK株擴(kuò)增條帶為853 bp,PRV ΔgE/TK/UL49.5/EGFP+株因缺失UL49.5基因474 bp片段,插入EGFP基因長(zhǎng)1 521 bp,擴(kuò)增條帶為1 900 bp。電泳結(jié)果與預(yù)期一致(圖3),證明重組病毒PRV ΔgE/TK/UL49.5/EGFP+株構(gòu)建成功。

2.3 重組病毒PRV ΔgE/TK/UL49.5株的鑒定質(zhì)粒pcGlobin2-Cre與PRV ΔgE/TK/UL49.5/EGFP+株基因組進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,經(jīng)蝕斑純化,直到病變細(xì)胞均不表達(dá)綠色熒光(圖4)。利用引物UL49.5-F/R進(jìn)行PCR鑒定,PRV ΔgE/TK株擴(kuò)增條帶為853 bp,PRV ΔgE/TK/UL49.5株缺失了UL49.5基因474 bp,擴(kuò)增條帶為379 bp。電泳結(jié)果與預(yù)期一致(圖5),證明重組病毒PRV ΔgE/TK/UL49.5株構(gòu)建成功。

A.熒光視野;B.明場(chǎng)視野

M.DL2000 DNA Marker;1.PRV ΔgE/TK/UL49.5株;2.PRV ΔgE/TK株;3.陰性對(duì)照

2.4 重組病毒PRV ΔgE/TK/UL49.5株遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)對(duì)不同代次PRV ΔgE/TK/UL49.5株用引物gD-F/R擴(kuò)增出的目的條帶為529 bp,與預(yù)期結(jié)果一致(圖6),測(cè)序結(jié)果顯示gD基因均未見堿基突變,證明PRV ΔgE/TK/UL49.5株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

M.DL2000 DNA Marker;1～10.PRV ΔgE/TK/UL49.5株;11.PRV YY株;12.陰性對(duì)照

2.5 重組病毒PRV ΔgE/TK/UL49.5株一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定PRV ΔgE/TK/UL49.5、PRV ΔgE/TK和PRV YY株在Vero細(xì)胞上最高滴度分別為106.55,106.64和106.99TCID50/0.1 mL(圖7)。與PRV YY和PRV ΔgE/TK株相比,PRV ΔgE/TK/UL-49.5株增殖速度較慢,但最高病毒滴度相似,說明UL49.5基因的缺失對(duì)PRV的生長(zhǎng)特性有一定的影響,但仍具有良好的體外增殖能力。

2.6 PRV UL49.5基因缺失對(duì)細(xì)胞總SLAⅠ轉(zhuǎn)錄水平的影響pUL49.5對(duì)SLAⅠ分子的轉(zhuǎn)錄下調(diào)從轉(zhuǎn)染后6 h時(shí)隨時(shí)間的推移逐漸明顯。PRV ΔgE/TK/UL49.5株對(duì)SLAⅠ分子轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)作用在12 h時(shí)顯著低于PRV YY株(P=0.011),18 h時(shí)極顯著低于PRV YY株(P=0.001)(圖8)。說明PRV UL49.5對(duì)細(xì)胞總SLAⅠ轉(zhuǎn)錄水平有明顯的下調(diào)作用,PRV ΔgE/TK/UL49.5株感染后對(duì)細(xì)胞總SLAⅠ轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)作用降低。

ns為差異不顯著(P>0.05);*為差異顯著(P<0.05);**為差異極顯著(P<0.01)。下同

2.7 PRV UL49.5基因缺失對(duì)細(xì)胞TAP轉(zhuǎn)錄水平的影響pUL49.5對(duì)TAP1分子的轉(zhuǎn)錄水平有極顯著的抑制作用。從12 h開始,PRV ΔgE/TK/UL49.5株對(duì)TAP1分子轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用極顯著低于PRV YY和PRV ΔgE/TK株(圖9A)。pUL49.5對(duì)TAP2分子的轉(zhuǎn)錄水平有顯著抑制作用(圖9B)。pUL49.5對(duì)TAP1轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用高于TAP2,說明UL49.5主要作用于TAP1。PRV ΔgE/TK/UL49.5株對(duì)TAP2轉(zhuǎn)錄水平不僅沒有抑制作用反而有促進(jìn)作用,可能與UL49.5編碼蛋白阻止抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TAP構(gòu)象變化有關(guān),具體機(jī)制尚不清楚。說明PRV UL49.5對(duì)TAP轉(zhuǎn)錄水平有明顯的抑制作用,即可通過抑制TAP的轉(zhuǎn)錄影響TAP對(duì)抗原肽的轉(zhuǎn)運(yùn)。

A.PRV UL49.5對(duì)細(xì)胞TAP1水平的影響;B.PRV UL49.5對(duì)細(xì)胞TAP2水平的影響

2.8 小鼠安全性試驗(yàn)PRV ΔgE/TK、PRV ΔgE/TK/UL49.5和空白對(duì)照組小鼠均健康存活,且精神與食欲正常;PRV YY組在攻毒后第3天開始陸續(xù)出現(xiàn)接種部位瘙癢、食欲減退、間歇性興奮、出血及死亡等PR典型的癥狀,攻毒后1周內(nèi)全部死亡。結(jié)果表明,UL49.5基因缺失后可顯著降低對(duì)小鼠的致病性,PRV ΔgE/TK/UL49.5對(duì)6周齡雌性昆明小鼠具有安全性。

3 討論

近年來(lái),PRV變異株在我國(guó)暴發(fā)流行,造成仔豬發(fā)病死亡,母豬繁殖障礙,育肥豬呼吸系統(tǒng)疾病,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在PR的預(yù)防中,PRV基因缺失弱毒疫苗發(fā)揮了重要的作用,目前已經(jīng)構(gòu)建了多種雙基因及多基因的PRV變異株基因缺失弱毒苗,如rPRVXJ-delgI/gE缺失株[13],PRV rHN1201TK-/gE-/gI-/11k-/28k-缺失株[14]等,初步證實(shí)這些弱毒活疫苗在PR的預(yù)防中有較好的作用。

UL49.5是復(fù)制非必需基因,在PRV中保守,UL49.5編碼蛋白可影響TAP轉(zhuǎn)運(yùn)抗原肽的能力,導(dǎo)致MHCⅠ分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)滯留,從而下調(diào)細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的展示,減弱細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的清除作用參與免疫逃逸。本試驗(yàn)采用同源重組和Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建了PRV ΔgE/TK/UL49.5株,該缺失株能夠在Vero細(xì)胞上穩(wěn)定傳代,具有良好的增殖能力,接種小鼠是安全的。胡艷芬等[15]證實(shí)了rPRV-gE-/TK-/gN-中g(shù)N基因的缺失在一定程度上減弱了病毒的毒力,對(duì)小鼠具有安全性。PRV ΔgE/TK/UL49.5株UL49.5基因缺失后顯著降低了細(xì)胞SLAⅠ和TAP轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)作用,表明PRV UL49.5通過抑制抗原從細(xì)胞質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn),從而影響多肽到達(dá)細(xì)胞表面被CD8+分子識(shí)別。KOPPERS-LALIC等[16]研究表明PRV UL49.5編碼蛋白通過抑制TAP來(lái)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)抗原肽的轉(zhuǎn)運(yùn),從而干擾MHC Ⅰ分子在細(xì)胞表面的展示。PRV ΔgE/TK/UL49.5株對(duì)SLAⅠ分子轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)作用相對(duì)PRV對(duì)其下調(diào)程度較弱,說明PRV對(duì)SLAⅠ的抑制作用存在其他的途徑,這符合文獻(xiàn)報(bào)道的PRV pUL56、PRV US3蛋白可以下調(diào)SLAⅠ分子[17-18]。本試驗(yàn)PRV UL49.5編碼蛋白對(duì)TAP轉(zhuǎn)錄水平有抑制作用,導(dǎo)致感染細(xì)胞SLAⅠ轉(zhuǎn)錄水平有顯著的下調(diào)作用,具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)構(gòu)建PRV ΔgE/TK/UL49.5基因缺失株,對(duì)其進(jìn)行了初步的研究,為新型PRV基因缺失疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。