魯毅　劉梅　段靖　賈琳　賈奕揚(yáng)　李燕思

【摘要】目的：建立十味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用TLC法對板藍(lán)根、黃芩、防風(fēng)等主要成分進(jìn)行定性鑒別。采用高效液相色譜法測定以（R，S）-告依春作為指標(biāo)成分進(jìn)行定量測定。色譜柱為：InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.02%磷酸溶液（5∶95，V/V），流速為1.0 mL·min-1。檢測波長為245 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：薄層色譜分離度良好，斑點(diǎn)清晰；（R，S）-告依春在進(jìn)樣量0.040～0.400 μg范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999，n=5），精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的RSD≤1.20%。平均加樣回收率為100.83%，（RSD=1.17%，n=6），并確定每袋15 g顆粒劑中，（R，S）-告依春含量不得少于0.62 mg。結(jié)論：建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)增加了含量測定，操作方便，結(jié)果準(zhǔn)確，精密度好，專屬性強(qiáng)，可用于十味板藍(lán)根顆粒質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】十味板藍(lán)根顆粒；（R，S）-告依春；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法

【中圖分類號】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）21-0036-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.21.zgmzmjyyzz202318009

Research of Study on the Quality Standard of Compound Isatidis Radix GranulesLU YiLIU MeiDUAN JingJIA LinJIA YiyangLI Yansi*

Department of Pharmacy， the air force Hospital from eastern theater of PLA ，Nanjing 210002，ChinaAbstract：Objective To establish standard of Compound Isatidis Radix Granules. Methods Isatidis Radix，Scutellaria baicalensis Georgi，Saposhnikoviae Radix as index components were qualitative identified by TLC.（R，S）-goitrin as index compent was quantitatively analyzed by HPLC. The InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）column was used with the mobile phase of methanol -0.02%phosphoric acid（5∶95，V/V）at the flow rate of 1.0 mL·min-1. The detection wave-length was set at 245 nm，and the column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Results TLC spots were clear，and separated nicely. Particle size，moisture，dissolubility and content uniformity test were conformed to the specification.（R，S）-goitrin showed a good linear relationship within the range of 0.040-0.400 μg（r=0.999，n=5）. The average recovery was 100.83%（RSD=1.17%，n=6）；the RSDs of precision，stability and repeatability tests were no more than 1.20%. The content of（R，S）-goitrin was initially determined no less than 0.62 mg. Conclusion The content determination is a worthy addition to the established quality standard. The method is easy，simple，accurate and stable in results with good specificity，which is applicable to quality control of Compound Isatidis Radix Granules.

Keywords：Compound Isatidis Radix Granules；（R，S）-goitrin；Quality Standard；Thin Layer Chromatography；High Performance Liquid Chromatography

十味板藍(lán)根顆粒為東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院自制制劑，2003年經(jīng)南京軍區(qū)聯(lián)勤部衛(wèi)生部批準(zhǔn)為非標(biāo)準(zhǔn)制劑，2017年再次取得軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑批準(zhǔn)文號：總制字（2017）F516007。該制劑由板藍(lán)根、大青葉、金銀花、連翹等十味中藥材組成，其功能主治為疏風(fēng)、發(fā)汗解表、清熱解毒利咽［1］；用于感冒引起的發(fā)熱、惡寒、頭痛、流涕、咽痛等癥［2］，其制劑可能與其抗病毒活性緊密相關(guān)［3］。為了提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文采用薄層色譜法對（R，S）-告依春、大青葉、黃芩、防風(fēng)進(jìn)行定性鑒別，按顆粒制劑通則進(jìn)行檢查，采用高效液相色譜法測定對（R，S）-告依春進(jìn)行含量測定，完善了十味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對保證其質(zhì)量具有重要意義。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1260 高效液相色譜儀（安捷倫公司）、UV-1700紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）、CPA225D型電子分析天平（德國賽多利斯公司）、超聲波清洗器、硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）

1.2試藥十味板藍(lán)根顆粒（規(guī)格：15 g/袋，東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院，批號190331、190401、190402），（R，S）-告依春對照品（批號111753-201204）、靛玉紅對照品（批號110117-200204）、黃芩苷對照品（批號110715-201318）、防風(fēng)對照品（批號120947-201409）、除陰性對照品由東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院自制外，其余對照品均購自中國生物制品研究所。甲醇為色譜純，其它試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別

2.1.1十味板藍(lán)根顆粒（R，S）-告伊春鑒別取十味板藍(lán)根顆粒1 g，研細(xì)，加80%甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，制備供試品溶液［4］；同法制備去板藍(lán)根的陰性對照品溶液；另?。≧，S）-告伊春對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，制備對照品溶液。參照《中國藥典》2020版薄層色譜法（第四部通則0502）［4］59試驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μL、對照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）作為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視。供試品譜圖與對照藥品譜圖在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。如圖1所示。

2.1.2十味板藍(lán)根顆粒黃芩苷鑒別取十味板藍(lán)根顆粒20 g，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）的混合溶液50 mL，加熱回流30min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?5 mL使溶解，取上清液作為供試品溶液；同法制備黃芩對照藥材溶液和去黃芩苷的陰性對照品溶液；另取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，制備黃芩苷對照品溶液，參照《中國藥典》2020版薄層色譜法（第四部通則0502）［4］59，吸取上述供試品溶液，對照藥材溶液各4 μL及上述對照品溶液2，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑，預(yù)飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液顯色。供試品譜圖與對照藥材譜圖在相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在與對照品譜圖相應(yīng)的位置上，顯3個(gè)相同的暗色斑點(diǎn)。如圖2所示。

2.1.3十味板藍(lán)根顆粒防風(fēng)鑒別取十味板藍(lán)根顆粒20 g，研細(xì)后加丙酮50 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，制備供試品溶液；同法制備去防風(fēng)的陰性對照品溶液；另取防風(fēng)對照藥材1 g，加丙酮20 mL，同法制成防風(fēng)對照藥材溶液；參照《中國藥典》2020版薄層色譜法（第四部通則0502）［4］59試驗(yàn)，吸取供試品溶液20 μL、對照藥材10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（4∶1）為展開劑，展開兩次，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品譜圖與對照藥材譜圖相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。如圖3所示。

2.2檢查

2.2.1粒度的測定除另有規(guī)定外，照粒度測定法，雙篩分法［4］146測定，3批次十味板蘭根顆粒檢查不能通過一號篩與可以通過五號篩的總和不超過15%，均符合規(guī)定。

2.2.2水分的測定照水分測定法，照《中國藥典》2020版四部通則0832（烘干法）［4］114-115測定：3批次十味板蘭根顆粒水分檢查結(jié)果均不超過8%，符合規(guī)定。

2.2.3溶化性的測定取供試品10 g，加熱水200 mL，攪拌5 min，立即觀察，3批次十味板蘭根顆粒全部溶化，有輕微渾濁，符合規(guī)定。

2.2.4裝量差異的測定照《中國藥典》2020版四部通則0104顆粒劑項(xiàng)下“裝量差異”檢查法［4］6-7測定。取每批次十味板藍(lán)根供試品10袋，共30袋。分別稱定每袋內(nèi)容物的重量，與標(biāo)示裝量相比較，裝量差異限度在標(biāo)示裝量的±5%以內(nèi)，超出裝量差異限度的不得多于2袋，并不得有1袋超出限度1倍［4］，3批次十味板蘭根顆粒檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

2.3含量測定

2.3.1色譜條件色譜柱：InertSustain C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：甲醇-0.02%磷酸溶液（5∶95，V/V）；檢測波長：245 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；在該條件下，理論塔板數(shù)按（R，S）-告依春峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.3.2溶液的配制對照品溶液的制備：取（R，S）-告依春對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液。供試品溶液的制備：取十味板藍(lán)根顆粒約15 g，精密稱定，置圓底瓶中，精密加入甲醇溶液100 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放冷，稱重，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。陰性對照溶液的制備：依據(jù)十味板藍(lán)根顆粒配方比例，制備缺板藍(lán)根藥材的陰性對照樣品，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制成陰性對照溶液［6］。

2.3.3專屬性試驗(yàn)按以上色譜條件分別?。≧，S）-告依春對照品溶液、十味板藍(lán)根顆粒供試品溶液、缺板藍(lán)根陰性對照溶液10 μL進(jìn)樣，陰性對照色譜中，在（R，S）-告依春相應(yīng)的出峰時(shí)間處無干擾峰出現(xiàn)。如圖4所示。

2.3.4線性關(guān)系考察精密吸取已配制好的（R，S）-告依春對照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。精密稱取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.3.1項(xiàng)下規(guī)定色譜條件測定（R，S）-告依春峰面積，以對照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為：Y=3590X-15.03（r=0.999，n=5）。結(jié)果表明，（R，S）-告依春質(zhì)量在0.040～0.400 μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5精密度試驗(yàn)分別精密吸取5份（R，S）-告依春對照品溶液各10 μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測量峰面積，結(jié)果RSD為0.20%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取十味板藍(lán)根顆粒（批號：190401）適量制備供試品溶液，在室溫條件下靜置，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h時(shí)，分別測定（R，S）-告依春含量。結(jié)果，（R，S）-告依春峰面積的RSD為1.20%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取取十味板藍(lán)根顆粒（批號：190401）6份，按2.3.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，2.3.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定（R，S）-告伊春峰面積。結(jié)果，峰面積平均值為296.43027，RSD為0.60%（n=6），表明以上方法重復(fù)性良好。

2.3.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱取6份已知（R，S）-告依春含量的十味板藍(lán)根顆粒供試品（批號：190401；含量：0.791 mg），每份均加入精密量取的（R，S）-告依春對照品0.979 mg，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下方法檢測峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.3.9供試品含量測定按2.3.2項(xiàng)下方法制備十味板藍(lán)根顆粒供試品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件，分別測定3批十味板藍(lán)根顆粒供試品（批號190331、190401、190402）的（R，S）-告依春平均含量，測得平均值為0.78 mg。見表2。

3討論

十味板藍(lán)根顆粒由十味中藥組成，成分復(fù)雜，其中板藍(lán)根味苦、寒，歸心、胃經(jīng)；功效為清熱解毒，涼血利咽，為方中君藥［3］；近年來越來越多的研究［7-10］表明板藍(lán)根具有抗內(nèi)毒素、免疫調(diào)節(jié)、抗菌消炎、耐缺氧及抗疲勞等藥理作用。（R，S）-告依春（C5H7NOS）作為板藍(lán)根中的主要抗病毒成分，2020年版《中國藥典》中采用HPLC法測定板藍(lán)根中（R，S）-告依春的含量對其進(jìn)行質(zhì)量控制［4］，國內(nèi)外一些文獻(xiàn)［11-15］中也收載了類似的定性定量分析方法，故筆者選擇（R，S）-告伊春作為十味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制含量測定指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)建立了十味板藍(lán)根顆粒中（R，S）-告依春、黃芩、防風(fēng)的薄層色譜鑒定方法，以及（R，S）-告依春的高效液相色譜定量測定方法。方法穩(wěn)定、可靠、簡便、重復(fù)性好，對科學(xué)、有效評價(jià)十味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量具有重要意義。

十味板藍(lán)根顆粒在劑型的質(zhì)量控制上應(yīng)符合藥典關(guān)于顆粒制劑的要求。本研究按照2020年版《中國藥典》（四部）附錄顆粒劑制劑通則的要求制訂檢查，項(xiàng)目包括粒度、水分、溶化性、裝量差異等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3批次十味板藍(lán)根顆粒的檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

根據(jù)2020年版《中國藥典》（一部）分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求［4］480-483，（R，S）-告伊春含量限（幅）度的制訂，根據(jù)3批次十味板藍(lán)根顆粒樣品的實(shí)際測定結(jié)果，按其平均值的±20%限度。本研究測定的（R，S）-告伊春含量平均值為0.78 mg/袋，下調(diào)20%為0.62 mg，而本次實(shí)驗(yàn)3批次樣品的（R，S）-告伊春含量均高于該量，因此初步確定十味板藍(lán)根顆粒告伊春含量限度為0.62 mg/袋。

本實(shí)驗(yàn)選用甲醇、70%甲醇、水作為提取溶劑進(jìn)行比較，提取方法及含量測定方法相同，甲醇作為提取溶劑含量較高，雜質(zhì)峰較少，因此選擇甲醇作為溶劑。提取方法采用超聲提取30 min，加熱回流30 min、60 min、90 min。研究中發(fā)現(xiàn)，加熱回流60 min、90 min時(shí)，提取較完全，因此本研究選用甲醇作為提取溶劑、加熱回流提取60 min。參考文獻(xiàn)［16］選用甲醇-水（7∶93）、流速1 mL/min作為流動(dòng)相，分離效果較差，本研究降低甲醇比例，選擇甲醇-水（5∶95）作為流動(dòng)相，（R，S）-告依春與其他組分可完全分離，達(dá)到較佳的結(jié)果。該法簡便快捷，測定結(jié)果穩(wěn)定可靠，且重現(xiàn)性好，為十味板藍(lán)根顆粒質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究初步建立了十味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，檢查項(xiàng)目均符合相關(guān)要求，色譜特征明顯，含量測定方法操作方便，專屬性強(qiáng)，含量限度設(shè)定合理，可用于十味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制。參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-02-08編輯：陶希睿）