于輝　孫鵬鵬　田真　張秀婷

【摘要】目的：確立了木芙蓉花的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：通過外觀特征鑒定、顯微鑒別和薄層色譜法（TLC）等對木芙蓉花進(jìn)行定性鑒別；根據(jù)2020年版《中國藥典》四部通則中的檢查內(nèi)容分別對不同批次木芙蓉花的水分和水溶性浸出物含量進(jìn)行測定；并利用高效液相色譜法（HPLC）測定對木芙蓉花中有效成分蕓香苷進(jìn)行含量測定。結(jié)果：木芙蓉花的外觀性狀和顯微特征清晰可辨；TLC斑點(diǎn)清晰、分離效果佳；10批木芙蓉花水分含量平均值為10.10%，水溶性浸出物平均值為41.53%。蕓香苷含量在0.0188～0.9412 μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系（r=0.999），平均加樣回收率為101.5%，RSD為1.16%。結(jié)論：方法準(zhǔn)確可信，操作簡便可行，為木芙蓉花的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】木芙蓉花；薄層色譜法；高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

【中圖分類號】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）21-0031-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.21.zgmzmjyyzz202318008

Study on the Quality Standard of Hibiscus mutabilis flowersYU Hui1SUN Pengpeng2TIAN Zhen1ZHANG Xiuting3*

1.Shandong Drug and Food Vocational College， Weihai 264200， China;

2.Zibo Institute for Food and Drug Control， Zibo 255000， China;3.Qilu Medical University，? Zibo 255300， ChinaAbstract：Objective In this study， the quality standard control method of Hibiscus mutabilis flowers was established. Methods Microscopic identification and TLC were adopted in the qualitative identification of Hibiscus mutabilis flowers. The contents of water and water-soluble extractive were determined according to the methods of Chinese Pharmacopoeia. The content of rutin was determined by HPLC. Results The microscopic features of Hibiscus mutabilis flowers were identified. The characteristic spots of the rutin reference substance could be clearly displayed by TLC. The average contents of water and water -soluble extract in ten batches of Hibiscus mutabilis flowers were 10.10% and 41.53%， respectively. The content of rutin was determined by high-performance liquid chromatography. rutin showed a good linear relationship in the 0.0188-0.9412μg （r=0.999 6） ，with an average recovery of 101.5% and RSD of 1.16%. Conclusion This method is accurate and reliable， and the operation is simple and feasible， which provides a theoretical basis for the quality control of Hibiscus mutabilis flowers.

Keywords：Flowers of Hibiscus Mutabilis L.; TLC; HPLC; Quality Standard

木芙蓉花為錦葵科、木槿屬植物落葉小喬木或灌木木芙蓉Hibiscus mutabilis L.的新鮮或干燥花，又名芙蓉花、木蓮、拒霜花、地芙蓉、華木。木芙蓉花主要采摘于夏、秋兩季剛剛開放的花朵，曬干或烘干后入藥［1］。木芙蓉花主產(chǎn)地在中國山東、河北、安徽等省區(qū)，原產(chǎn)于中國湖南，為成都市市花，現(xiàn)東南亞各國和日本也都有栽培［2］?！侗静輬D經(jīng)》和《本草綱目》有明確記載，木芙蓉花“味辛平，無毒”，主治“一切大小癰疽、腫毒惡瘡”［3］。清熱解毒、涼血止血、消腫排膿為木芙蓉花的主要功效［4］。木芙蓉花的化學(xué)成本一般可以分為黃酮類、苷類成分、香豆素類成分等，其中黃酮類含量最高，種類也最多，大約有25個(gè)。同時(shí)黃酮類成分也是木芙蓉花的主要藥效成分，在抗炎、耐病毒、強(qiáng)心、利膽、止痛和鎮(zhèn)定等方面發(fā)揮重要功能 ［5］。

通過對木芙蓉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)行《中國藥典》2020年版只對木芙蓉葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了收載，木芙蓉花僅有衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥材第一冊）且標(biāo)準(zhǔn)較為粗疏，僅做性狀鑒別［6］，目前對木芙蓉花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鮮有報(bào)道。中藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系到藥材的采集、炮制、制劑、成分提取等方面，并且對臨床使用起著重要指導(dǎo)作用。本試驗(yàn)采集10批產(chǎn)地不同的木芙蓉花， 考查其顯微特征、薄層色譜特征、水分、水溶性浸出物等方面；此外，木芙蓉花中含有蕓香苷等黃酮類化合物［7］，其有較高的藥用價(jià)值，是治療糖尿病、高血壓、心血管疾病等多種疾病的良藥，此外它還有抗菌和抗放射作用［8］。故本研究選擇采用高效液相色譜法測定蕓香苷含量，為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立和規(guī)范使用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料、儀器與試藥

1.1材料木芙蓉花10批，分別采購自浙江省杭州市、廣東省清遠(yuǎn)市、廣東省深圳市、河北省安國市、四川省成都市、河南省周口市、云南省昆明市及購自安徽亳州藥材市場。經(jīng)鑒定，十批藥材皆為錦葵科植物木芙蓉（Hibiscus mutabilis L.）的干燥花。具體信息見表1。

1.2儀器設(shè)備U3000高效液相色譜儀（戴安集團(tuán)公司）、BX-41生物顯微鏡（日本Nikon公司）WFH-204B紫外分析儀紫外燈（杭州齊威儀器公司）、WT-B天平（杭州萬特衡器公司）、KQ-300DA超聲波清洗器（深圳市華策技術(shù)公司）、HH-S14A恒溫水浴鍋（鄭州市亞榮儀器設(shè)備公司）；DHG-9070A烘箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3試劑與試藥蕓香苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200707）；甲醇（色譜純，國藥集團(tuán)生化藥物試劑股份公司，批號：20220106）；冰醋酸（色譜純，國藥集團(tuán)生化藥物試劑股份公司，批號：20211206）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)股份公司，批號：20220120）；4%CH3COOHNa硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）；乙酸乙酯（國藥集團(tuán)生化藥物試劑公司，批號：20220305）；甲酸（國藥集團(tuán)生化藥物試劑公司，批號：20211210）；硫酸（國藥集團(tuán)生化藥物試劑公司，批號：20200313）；丙酮（國藥集團(tuán)生化藥物試劑公司，批號：20210901）；三氯甲烷（國藥集團(tuán)生化藥物試劑公司，批號：20211016）。

2方法與結(jié)果

2.1性狀鑒別將木芙蓉干燥花置于白色工作臺上，輕輕將失水皺縮的花瓣展開，測量花瓣的長和寬，觀察花瓣正反面顏色、形狀以及表面特征，留意木芙蓉花的氣味；將花瓣摘除，觀察并測量花柱和雄蕊的性狀。

2.1.1性狀特征如圖1所示，本品多呈皺縮團(tuán)狀或鐘狀，完全展開的花瓣呈倒三角型形，長3.0～5.0 cm，寬1.5～3.0 cm；表面有縱向紋理，呈放射狀，為淺黃色，靠近邊緣處有分叉；花瓣顏色以紫色為主調(diào)，深淺不一，偶見淺黃色，內(nèi)面基部呈黃綠色，花瓣數(shù)15～25瓣；花萼5裂，長1～1.5 cm，表面被星狀柔毛覆蓋，闊卵形狀裂片；雄蕊多數(shù)，聯(lián)合成管狀，包裹花柱，長1.0～1.5 cm，花藥柄長0.3～0.7 cm。柱頭呈黃綠色，柱頭頭狀，子房5室，花柱先端5裂。氣微香，味甘淡。注：木芙蓉花外觀顏色和形狀與花期和品種有關(guān)。其中花期決定花瓣顏色，開花初起為白色或淡黃色，花盛開時(shí)顏色變深至紫色，采收受花期影響顏色不一致；而花瓣數(shù)量與品種相關(guān)，藥用一般為重瓣木芙蓉。

2.2顯微鑒別取少許60目過篩的木芙蓉花粉末放置于干燥透明的載玻片上，攤平放置，觀察粉末色澤，再滴入1～2滴水合氯醛試液，置于燃燒著的酒精燈上，加熱使其透化，反復(fù)以上動(dòng)作1～2次，直至透化完全，然后滴入1～2滴稀甘油使其分散，用蓋玻片敷蓋好，最后放置于顯微鏡下，觀察其粉末顯微特征。結(jié)果如圖2所示。

粉末顏色呈紫紅或暗紫色，偶見土黃色?；ü谒奖砥ぜ?xì)胞呈長方形或不規(guī)則狀，垂直周壁呈微波狀扭曲，氣孔為直軸式，邊緣具有許多以4～7個(gè)單細(xì)胞非腺毛組成的放射狀腺毛，其壁平滑。薄壁細(xì)胞呈多邊形或矩形，可見螺紋導(dǎo)管。

花粉粒呈球狀，外壁有大量尖刺突起?；ǚ勰覂?nèi)壁細(xì)胞加厚，呈棱形，外表面為多角形，呈肋條狀壁加厚；花絲細(xì)胞呈長條形，具螺紋狀導(dǎo)管。

完整的腺毛細(xì)長呈圓錐形，腺頭略成三角形，2～3細(xì)胞，腺柄7～11個(gè)細(xì)胞，內(nèi)含大量淡黃色分泌物。草酸鈣簇晶較小，呈長方塊狀、菱形以及多邊形狀，棱角微尖。

2.3薄層色譜鑒別黃酮類成分是木芙蓉花的主要活性成分，本研究以蕓香苷作為黃酮類成分的代表性成分對木芙蓉花進(jìn)行定性質(zhì)量控制。

2.3.1對照品溶液的制備蕓香苷對照品10 mg，加15 mL甲醇，放入超聲波清洗儀中輔助溶解，放入20 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即為對照品溶液。

2.3.2供試品溶液的制備稱取木芙蓉花藥材粉末0.5 g放入100 mL錐形瓶中，加入30 mL甲醇，塞緊，放入超聲波清洗儀中超聲30 min（300 W，40 kHz），濾過，蒸干濾液，加水15 mL將殘?jiān)芙?，加?0 mL氯仿，振搖提取，棄去下部氯仿溶液，水液層加入水飽和正丁醇25 mL，振搖提取，棄去下部水溶液，分取上部正丁醇溶液，放在水浴鍋上加熱蒸干，最后加2 mL甲醇溶解殘?jiān)?，即得供試品溶液?/p>

2.3.3檢測方法依次吸取對照品溶液和10批木芙蓉花供試品溶液1 μL，點(diǎn)于同一以4%CH3COOHNa為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-丙酮（15∶2∶3∶7）為展開劑，直接展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇液，置于提前預(yù)熱好105 ℃的烘箱中加熱至呈現(xiàn)清晰斑點(diǎn)，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果如圖3所示。由圖可知，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的黃綠色熒光斑點(diǎn)。

2.4水分和水溶性浸出物檢查根據(jù)2020版《中國藥典》［9］四部通則0832水分測定法第二法（烘干法）測定10批樣品，主要操作如下：取木芙蓉花供試品3 g，取干燥至恒重的扁形稱量瓶，將木芙蓉花藥材平鋪于中，供試品厚度要低于5 mm，精密稱定，將瓶蓋打開，用烘箱烘干干燥5 h，溫度設(shè)為100～105 ℃，蓋好瓶蓋，移放至玻璃干燥器中，放涼冷卻30 min，精密稱定，再烘干干燥1 h，溫度依舊為上述溫度，載放入玻璃干燥器中冷卻，稱重，當(dāng)連續(xù)兩次稱重的差異小于5 mg時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中含水量（%）。

按2020年版《中國藥典》方法測定，10批木芙蓉花中水含量為8.73%～11.80%，平均值為10.10%；水溶性浸出物含量為 33.17%～49.80%，平均值為41.53%。結(jié)果見表1。

2.5含量測定

2.5.1系統(tǒng)適應(yīng)性考察色譜條件色譜柱：Diamonsil C18（ODS）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸溶液（35∶65）；流動(dòng)速率：1 mL·min-1；檢測波長：257 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按蕓香苷峰計(jì)算應(yīng)不得低于2000。系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖如圖4所示，橫坐標(biāo)為時(shí)間（min），縱坐標(biāo)為吸收度值（A）。

2.5.2對照品溶液的制備取對照品蕓香苷（蘆?。?0 mg，精密稱定，至100 mL容量瓶，加入適量甲醇，用超聲波清洗儀（功率：300 W，頻率40 kHz）溶解，定容至刻度線，搖勻，即得蕓香苷對照品溶液。

2.5.3供試品溶液的制備分別取不同批次的木芙蓉花粉末1 g，精密稱定，至100 mL圓底燒瓶，精密加入50%甲醇溶液50 mL，稱定其重量，回流提?。?0 min），放涼，稱重，補(bǔ)足失重，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL容量瓶中，50%甲醇定容至刻度線，即得木芙蓉花供試品溶液。

2.5.4線性關(guān)系考查精密吸取對照品溶液1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、2 mL，分別置于50 mL、25 mL、10 mL、5 mL、5 mL容量瓶中，加乙醇稀釋成不同濃度的對照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。以蕓香苷（蘆?。┻M(jìn)樣量（X）對峰面積積分值（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=2.0×107X-189379（r=0.9996，n=6）。結(jié)果表明，蕓香苷（蘆丁）進(jìn)樣量在0.0188～0.9412 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5.5精密度試驗(yàn)按上述色譜條件對照品溶液反復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示，蕓香苷峰面積RSD=0.677%（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.5.6穩(wěn)定性試驗(yàn)在上述色譜要求條件下，取同一供試品溶液適量，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時(shí)進(jìn)樣測定。測得出蕓香苷峰面積積分值的RSD=0.519%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)，其穩(wěn)定性良好。

2.5.7重復(fù)性試驗(yàn)分別精密稱取同一批木芙蓉花樣品對其進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)（購自安徽亳州藥材市場，樣品4號）適量，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件的要求測定。結(jié)果，RSD= 0.859%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的木芙蓉花藥材樣品（蕓香苷含量為0.0373 mg·g-1）適量，共10份，分別精密加入一定量的蕓香苷對照品，按“2.5.3 ”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定蕓香苷含量，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

2.5.9樣品含量測定取適量各個(gè)批次木芙蓉花樣品，精密稱定，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定，計(jì)算出每批木芙蓉花藥材中的蕓香苷含量。經(jīng)計(jì)算10批樣品中，蕓香苷（蘆?。┖孔罡邽?8.9 μg·g-1，最低為11.9 μg·g-1，平均值為27.38 μg·g-1。結(jié)果見表4。

3討論

3.1薄層鑒別試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藥材本身色素等成分大極性成分以及其他各種非極性成分會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此需要適當(dāng)對藥材進(jìn)行進(jìn)一步脫色、分離處理，查閱相關(guān)研究［10］發(fā)現(xiàn)甲醇相比乙醇對蕓香苷的溶解效果更好，故將提取溶劑換為甲醇。超聲提取和回流提取對供試品制備基本無差別，但超聲提取較方便，故選擇超聲提取。

3.2含量測定比較了超聲提取法和熱回流法兩種供試品溶液制備方法，熱回流法效率明顯高于超生提取法，因此選擇回流法作為供試品提取方法。通過查閱文獻(xiàn)［11-12］ ，同時(shí)測定木芙蓉花的蕓香苷含量有多種流動(dòng)相選擇，通過試驗(yàn)，最終確定了在該條件下測定二者含量，其分離效果好，基線平穩(wěn)，重復(fù)性好，達(dá)到了含量測定的目的。本法重復(fù)性好、操作簡便，可為木芙蓉花質(zhì)量控制提供依據(jù)。

3.3不同批次木芙蓉花質(zhì)量比較通過對不同產(chǎn)地批次的木芙蓉花的外觀形狀、顯微、薄層色譜、水分、灰分、蕓香苷（蘆丁）含量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，各產(chǎn)地的木芙蓉花基原一致，定性鑒別、一般雜質(zhì)等質(zhì)量檢查結(jié)果較為統(tǒng)一。但是花作為入藥部分，在外觀鑒別、含量測定方面會出現(xiàn)差異。通過對10批次的藥材研究發(fā)現(xiàn)，9號木芙蓉花的外觀形狀，顯微粉末特征、蕓香苷（蘆?。┖烤c其他批次有明顯差異，初步分析其原因，主要是該批次花朵顏色整體較淺，查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)木芙蓉花的花期決定其顏色，而顏色深淺恰好與木芙蓉花中的黃酮成分（黃酮醇苷及花色素）含量有關(guān)，因此在對木芙蓉花采集方面建議在花盛開時(shí)采收。

此外，研究木芙蓉花中蕓香苷（蘆?。┖棵黠@少于木芙蓉葉中其含量，但是也有文獻(xiàn)表明，木芙蓉花中總黃酮的含量高于葉，因此在木芙蓉花的含量測定指標(biāo)方面是否需要增加其他的有效成分指標(biāo)，尚需進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-02-03編輯：陶希睿）