張志鵬 劉帥 張玉瓊 熊影 韓偉靜 陳同生 王爽?

1) (華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院,廣州 510631)

2) (松山湖材料實驗室,東莞 523808)

3) (中國科學(xué)院物理研究所,北京 100190)

基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控是生命體調(diào)節(jié)基因表達的重要過程,是保證遺傳信息可控傳遞和維持基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵步驟.單分子技術(shù)的發(fā)展為分子水平上探索基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控動力學(xué)機制提供了新的研究范式,有力地推動了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律方面的研究進展.本文著重介紹了依據(jù)單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控技術(shù)發(fā)展起來的操控超螺旋DNA 的技術(shù),借助超螺旋DNA 的“放大”特點,實現(xiàn)了對DNA 雙螺旋動態(tài)打開過程的高通量、單堿基精度的測量;隨后,介紹了單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控技術(shù)在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控動力學(xué)研究中的應(yīng)用情況,通過實時監(jiān)測轉(zhuǎn)錄泡結(jié)構(gòu),實現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄起始、延伸和終止等階段的動力學(xué)表征,建立了一系列新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型;最后,介紹了單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控和單分子熒光成像技術(shù)聯(lián)用方案,為研究復(fù)雜體系中的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控動力學(xué)機制提供了新的范式和范例.

1 引言

生物物理學(xué)是物理學(xué)與生命科學(xué)相互交叉的一個重要學(xué)科,旨在運用物理學(xué)思維或方法解決生命現(xiàn)象中的物理學(xué)或生物學(xué)問題,從物理學(xué)角度理解生命現(xiàn)象和規(guī)律,推動物理學(xué)與生命科學(xué)的共同發(fā)展.

20 世紀(jì)50 年代,弗朗西斯·克里克、詹姆斯·沃森、羅莎琳德·富蘭克林等物理學(xué)家發(fā)現(xiàn)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)生命體的遺傳物質(zhì)[1,2],承載著遺傳信息,開啟了在分子水平上從物理學(xué)角度理解生命現(xiàn)象和規(guī)律的新學(xué)科——分子生物物理學(xué).在此基礎(chǔ)上,進一步提出了分子生物學(xué)中心法則(central dogma of molecular biology)[3],闡述了分子水平上遺傳信息傳遞的方向性,指出了生命現(xiàn)象中的若干重要生命過程,包括DNA復(fù)制——負責(zé)遺傳信息的自身擴增,基因轉(zhuǎn)錄和翻譯——負責(zé)遺傳信息從DNA 到RNA 再到蛋白質(zhì)的傳遞規(guī)律,奠定了分子水平上理解生命現(xiàn)象的基礎(chǔ),成為了分子生物物理學(xué)的重要組成部分.

法國生物學(xué)家雅克·莫諾,首次發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)受其他蛋白質(zhì)表達水平調(diào)控的現(xiàn)象[4,5],建立了蛋白質(zhì)參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的分子模型,并提出了基因轉(zhuǎn)錄過程以信使RNA(messenger RNA)為媒介來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達,這一觀點既印證了分子生物學(xué)中心法則,也推動了分子水平上基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的發(fā)展.隨后,人們借助多學(xué)科研究方法探索基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的動力學(xué)過程,包括運用X 射線衍射(X-ray diffraction,XRD)或冷凍電子顯微鏡(cryogenic electron microscopy,cryo-EM)方法解析基因轉(zhuǎn)錄過程關(guān)鍵蛋白質(zhì)——RNA 聚合酶(RNA polymerase,RNAP)及其與其他生物大分子形成的復(fù)雜復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)[6-10]、應(yīng)用傳統(tǒng)生物化學(xué)方法檢測基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的生物大分子的生物學(xué)功能[11-14]、以及應(yīng)用單分子方法解析基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)生物大分子的運行機制[15-20]等,從多學(xué)科角度建立了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的分子機制和模型,深化了對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的理解.

王爽,中國科學(xué)院物理研究所副研究員.2008 年于吉林大學(xué)獲得材料物理學(xué)士學(xué)位,2014 年于中國科學(xué)院物理研究所獲得凝聚態(tài)物理博士學(xué)位.2015 年至2019 年在法國法國雅克莫諾研究所(Institut Jacques Monod)和巴黎高等師范學(xué)院(Ecole Normale Superieure)從事博士后研究.目前主要研究方向是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的單分子動力學(xué),相關(guān)研究成果發(fā)表在Nat.Commun.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA和Nucleic Acids Res.等期刊,主持國家自然科學(xué)基金項目2 項,中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進會員項目1 項.

2 單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控技術(shù)

單分子方法是近些年發(fā)展起來的物理學(xué)方法[21,22],通過實時觀測單個生物大分子的運動學(xué)行為、微觀結(jié)構(gòu)變化以及隨時間和空間的演變等物理學(xué)參量,來刻畫生命現(xiàn)象和過程,為揭示生命的奧秘提供分子動力學(xué)方面的實驗依據(jù).單分子技術(shù)分為單分子力學(xué)操控技術(shù)和單分子熒光成像兩大類.其中單分子力學(xué)操控技術(shù)包括磁鑷(magnetic trap)[23-25]、光鑷(optical trap)[26-28]和原子力顯微鏡(atomic force microscopy)[29-31]等技術(shù),這些操控技術(shù)通常以微球或探針等為媒介標(biāo)記生物大分子,借助磁場、光場或原子間相互作用來操控生物大分子,通過測量生物大分子的末端距離,來表征生物大分子微觀結(jié)構(gòu)變化的信息,從而可以用來研究生物大分子之間相互作用所引起的微觀結(jié)構(gòu)變化,以及受外力調(diào)控和響應(yīng)等.單分子熒光成像技術(shù)通過對感興趣的生物大分子標(biāo)記熒光探針,再利用多種顯微成像技術(shù)對熒光探針進行成像,進而追蹤生物大分子隨時間和空間分布的信息,該類技術(shù)包括單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(single-molecule F?rster resonance energy transfer,smFRET)[32-34]、單分子熒光共定位技術(shù)(colocalization single-molecule spectroscopy,CoSMoS)[35,36]和高分辨成像技術(shù)(super-resolution imaging,SRI)[37-39]等.單分子熒光成像技術(shù)適用于離體和原位測量生物大分子的時空分布.單分子技術(shù)是探索生物大分子之間相互作用關(guān)系的有力研究手段,并且單分子力學(xué)操控技術(shù)和熒光成像技術(shù)可以聯(lián)合使用,同步觀測生物大分子復(fù)合物的力學(xué)相互作用和各分子組分隨時間或空間分布等信息,為了研究復(fù)雜生物大分子體系的運行機制提供更加全面的信息[40-42].

如圖1 所示,單分子磁鑷技術(shù)以微米級的超順磁性微球(后文簡稱為磁球)為媒介,借助生物素——鏈霉親和素或地高辛——抗地高辛等抗原抗體相互作用,把生物大分子(一般是DNA)的一端連接磁球,另一端連接在微流體樣品池的玻璃表面[21,43].通過施加磁鐵來對超順磁性微球施加拉力,其受力方向沿磁場梯度方向,拉力范圍在零點幾至上百皮牛(pN,piconewton,1 pN=10-12N),涵蓋了生物體內(nèi)許多力學(xué)相互作用尺度,適用于諸多生物大分子之間力學(xué)相互作用的研究[44-47].磁鑷的測量精度決定于磁球的定位精度,受拉力大小的影響,拉力越大,精度越高,甚至達到亞納米精度.磁鑷能夠同時操控視野里的所有磁球樣品,數(shù)目可達到100 以上,具備高通量測量的優(yōu)勢.此外,磁鑷也可以通過旋轉(zhuǎn)磁鐵來旋轉(zhuǎn)磁球進而旋轉(zhuǎn)所連接的生物大分子,實現(xiàn)對生物分子的旋轉(zhuǎn)操控.

圖1 單分子磁鑷操控技術(shù)示意圖Fig.1.Schematic for single-molecule magnetic trap.

DNA 作為生命的遺傳物質(zhì),其所承載的遺傳信息在復(fù)制和傳遞等過程中,涉及到DNA 結(jié)構(gòu)改變.生理條件下,基因組DNA 是處于負超螺旋狀態(tài)的,負超螺旋是沿著DNA 右手螺旋的反方向旋轉(zhuǎn)DNA 而形成,反之,則形成正超螺旋DNA.人們研究了旋轉(zhuǎn)操控對DNA 結(jié)構(gòu)的影響和調(diào)控,探索生理條件下超螺旋DNA 的力學(xué)性質(zhì).借助單分子磁鑷技術(shù)通過旋轉(zhuǎn)磁鐵來旋轉(zhuǎn)操控磁球,進而操控DNA 形成正或負超螺旋,再通過改變拉力來測量超螺旋DNA 長度變化,解析了超螺旋DNA 的力學(xué)性質(zhì),發(fā)現(xiàn)增大拉力可以使負超螺旋DNA 變性,即DNA 雙螺旋被打開[45,48].單分子磁鑷技術(shù)可以對DNA 施加可控的超螺旋和拉力,是模擬生理條件下DNA 超螺旋結(jié)構(gòu)簡單有效的研究方法.

超螺旋DNA 具有一種測量精度“放大效應(yīng)”.當(dāng)拉力F＜ 0.5 pN 時,通過旋轉(zhuǎn)磁鐵來操控線性DNA,如圖2 所示,DNA 長度隨磁鐵逆時針或順時針旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的增加而減小,并呈現(xiàn)出兩段DNA長度線性變化區(qū)域(灰色),即DNA 長度等比例地隨磁鐵旋轉(zhuǎn)圈數(shù)發(fā)生變化,說明在DNA 上逐步形成均勻大小的超螺旋[49].兩段DNA 長度線性變化區(qū)域左右對稱,其斜率在50—60 nm/turn,即單個超螺旋的尺寸.若通過操控磁鐵將DNA 旋轉(zhuǎn)狀態(tài)調(diào)節(jié)到兩個線性變化區(qū)域內(nèi),在磁鐵旋轉(zhuǎn)圈數(shù)保持不變的情況下,如果DNA 雙螺旋被打開,則根據(jù)(1)式可以得出DNA 的超螺旋數(shù)目會發(fā)生相應(yīng)的變化:

圖2 單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控DNA 超螺旋Fig.2.Manipulation of DNA supercoils via single-molecule magnetic trap.

其中,ΔLk是環(huán)繞數(shù)(linking number),即磁鐵旋轉(zhuǎn)圈數(shù),當(dāng)磁鐵不旋轉(zhuǎn)時,ΔLk=0;ΔTw是扭轉(zhuǎn)數(shù)(twist number),即DNA 雙螺旋數(shù)目;Wr是纏繞數(shù)(writhenumber),即DNA超螺旋數(shù)目.若ΔTw=-1,即打開1 個自然螺旋,由(1)式可以得出Wr=+1,即產(chǎn)生1 個正超螺旋,那么從圖2可以看到,在負超螺旋的線性區(qū)域內(nèi)將發(fā)生DNA長度增大,而在正超螺旋的線性區(qū)域內(nèi)將發(fā)生DNA 長度減小,其變化幅度δ=50—60 nm.在生理條件下,DNA 一般處于B 型構(gòu)象,每一個自然螺旋的物理尺寸約為3.4 nm,包含10.5 對堿基(base pair,bp),那么超螺旋DNA 打開1 對堿基將產(chǎn)生5—6 nm 的長度變化,即通過DNA 超螺旋結(jié)構(gòu)特性,將DNA 堿基對打開的長度變化從0.34 nm放大為5—6 nm.當(dāng)拉力F=0.3 pN,DNA 長度為2 kb(kilo base pair)時,超螺旋DNA 的布朗漲落σ 約為40 nm,漲落的特征時間τ 約為0.1 s.若數(shù)據(jù)采集時間為T,則該測量時間內(nèi)磁球的布朗漲落降低為σ/(T/τ)1/2.若設(shè)定該值為5 nm,則得到T=6.4 s,即時間分辨率為6.4 s 時,上述超螺旋DNA 將給出單堿基的空間測量精度[50].減小線性DNA 長度,可以在保證單堿基空間測量精度的同時,提高時間分辨率[51].

除了單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控技術(shù)以外,光鑷也被用于實現(xiàn)對生物大分子的旋轉(zhuǎn)操控研究中,通過加工微納米尺度的圓柱體來標(biāo)記生物大分子,借助線偏振光操控圓柱體旋轉(zhuǎn),進而實現(xiàn)對生物大分子的旋轉(zhuǎn)操控[18].此外,單分子操控技術(shù)也用于探索DNA 的力學(xué)性質(zhì).通過對單個DNA 分子拉伸,解析DNA 長度隨拉力而變化的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)DNA 從普通的右手螺旋的B 型結(jié)構(gòu)向過拉伸的S 型DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[44,52],展示了拉力調(diào)控下的DNA 相變規(guī)律等.

3 單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控技術(shù)研究基因轉(zhuǎn)錄動力學(xué)

基因轉(zhuǎn)錄是分子生物學(xué)中心法則的重要步驟之一,主要由蛋白質(zhì)分子機器——RNAP 負責(zé)將蘊含在基因組DNA 上的遺傳信息轉(zhuǎn)換成RNA序列,作為后續(xù)蛋白質(zhì)翻譯步驟的模板,高效可控的基因轉(zhuǎn)錄過程不但決定了后續(xù)蛋白質(zhì)的表達水平,也影響著基因組的穩(wěn)定性[53].轉(zhuǎn)錄過程中,RNAP作用于基因組DNA,在其內(nèi)部打開DNA 雙螺旋形成轉(zhuǎn)錄泡結(jié)構(gòu),以其中一條DNA 單鏈為模板開始合成RNA,實現(xiàn)遺傳信息從DNA 向RNA 的傳遞.隨著RNAP 沿基因組DNA 進行一維運動,轉(zhuǎn)錄泡和RNA 合成位點也隨之位移,從而將完整的基因信息轉(zhuǎn)變成RNA 序列.RNAP 的運動行為,包括與DNA 作用產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄泡結(jié)構(gòu)以及沿基因組DNA 的一維運動等,與其基因轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)功能密切關(guān)聯(lián),體現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄分子機器的物理學(xué)行為和生物學(xué)功能的交叉耦合.此外,基因轉(zhuǎn)錄過程不僅包括基本的RNAP/DNA 相互作用,還涉及與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和其他生命過程相關(guān)的生物大分子之間的相互作用,例如與基因組上發(fā)生的復(fù)制過程的關(guān)鍵蛋白質(zhì)——DNA 聚合酶(DNA polymerase)之間的相互作用等[54,55].

3.1 轉(zhuǎn)錄起始動力學(xué)

基因轉(zhuǎn)錄過程一般分為起始、延伸和終止3 個階段,每個階段表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄泡結(jié)構(gòu).如前所述,單分子磁鑷操控的超螺旋DNA 具備單堿基精度、高通量檢測DNA 雙螺旋打開的功能,因此,嘗試運用該方法通過測量轉(zhuǎn)錄泡的動態(tài)變化過程,來研究轉(zhuǎn)錄各個階段的運行機制.

在轉(zhuǎn)錄起始階段,一般認(rèn)為RNAP 搜索、識別并結(jié)合啟動子(promoter)區(qū)域,形成封閉復(fù)合物(RNAP-promoter closed complex,RPc),由于此過程中未打開DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu),因此超螺旋DNA長度無變化(如圖3)[49].進一步,RNAP 特異性作用于啟動子區(qū)域進而打開DNA 雙螺旋形成轉(zhuǎn)錄泡結(jié)構(gòu),稱為開放復(fù)合物(RNAP-promoter open complex,RPo),在負超螺旋DNA 上表現(xiàn)為DNA 長度增加約50 nm,而在正超螺旋DNA 上表現(xiàn)為DNA長度降低約80 nm.兩個數(shù)值存在差別,說明引起DNA 長度變化的因素除了DNA 雙螺旋打開還有DNA 彎折,進而得出DNA 彎折引起DNA 長度降低15 nm,RPo 狀態(tài)將打開1.2 個DNA 雙螺旋,即約13 bp[49].真核體系中,TFIIH 因子負責(zé)解旋6 個堿基的DNA 雙鏈,對應(yīng)超螺旋DNA 長度變化約30 nm,隨后招募真核RNA 聚合酶,形成開放復(fù)合物RPo[56].

圖3 單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控方法研究轉(zhuǎn)錄動力學(xué) (a) 研究方法示意圖;(b) 典型轉(zhuǎn)錄曲線(起始(RPitc)、延伸(RDe)和終止)Fig.3.Transcription kinetics characterized via single-molecule magnetic trap: (a) Schematic of the methodology;(b) a typical transcription trajectory showing initiation (RPitc),elongation (RDe) and termination.

隨后,RNAP 嘗試?yán)萌芤褐械暮塑杖姿?nucleoside triphosphate,NTP)開始合成RNA,表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄泡尺寸逐步增大.Revyakin等[57]運用單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控方法,依次增加NTP 的種類,在正、負超螺旋狀態(tài)下都觀察到了轉(zhuǎn)錄泡尺寸逐漸增大的現(xiàn)象,稱為轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物(RNAP-promoter initiation complex,RPitc);若提供全部4 種NTP,則可以觀察到轉(zhuǎn)錄泡尺寸從RPo 狀態(tài)持續(xù)增大,隨后突然減小到1 個自然螺旋的大小,說明RNAP 進入轉(zhuǎn)錄延伸狀態(tài)(RNAP-DNA elongation,RDe),直到轉(zhuǎn)錄泡最終恢復(fù)初始狀態(tài),說明發(fā)生轉(zhuǎn)錄終止(termination).另外,單分子熒光方法發(fā)現(xiàn)處于RPitc 狀態(tài)的RNAP 的上游結(jié)構(gòu)域與DNA 位置固定不動,而下游結(jié)構(gòu)域與DNA 之間發(fā)生相對位移,位移程度隨NTP 種類增加而增大,與單分子磁鑷的結(jié)果一致,共同證明了轉(zhuǎn)錄起始階段的DNA 蜷縮模型[57,58].這一模型也暗示,下游DNA 打開并累積到RNAP 內(nèi)部的過程會導(dǎo)致RNAP 內(nèi)部的應(yīng)力積累,可能阻礙RPitc 狀態(tài)的RNAP 向前運動,而促使RNAP 向后運動,發(fā)生轉(zhuǎn)錄回溯現(xiàn)象(backtracking).為了證明這一可能性,Wang等[59]運用單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控方法實時追蹤了轉(zhuǎn)錄起始的動力學(xué)過程,觀測到了一個區(qū)別于RPitc 的RNAP 狀態(tài),其表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄泡尺寸縮小并持續(xù)相當(dāng)長的時間,說明RNAP 發(fā)生了轉(zhuǎn)錄回溯,并且該回溯狀態(tài)的RNAP 受GreA 因子調(diào)控,使其轉(zhuǎn)錄泡尺寸恢復(fù)到RPitc 狀態(tài).

3.2 轉(zhuǎn)錄延伸動力學(xué)

RNAP 經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄起始階段的一系列中間態(tài)過程(包括DNA 蜷縮和轉(zhuǎn)錄回溯等)后,進入到轉(zhuǎn)錄延伸階段,持續(xù)地轉(zhuǎn)錄基因序列,晶體結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示延伸階段的轉(zhuǎn)錄泡尺寸穩(wěn)定在10 bp 左右,約等于1 個自然螺旋大小[60].單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控方法也適用于操控和測量轉(zhuǎn)錄延伸過程的轉(zhuǎn)錄泡尺寸,并能夠根據(jù)轉(zhuǎn)錄泡尺寸變化及相關(guān)的時間參量,來解析轉(zhuǎn)錄延伸的動力學(xué)機制.Zhang等[61]借助單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控方法,實時追蹤了延伸階段轉(zhuǎn)錄泡的動態(tài)變化過程,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄泡尺寸與晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)果一致,并且受轉(zhuǎn)錄因子NusA 調(diào)控,表現(xiàn)為延伸過程中轉(zhuǎn)錄泡尺寸增大約2 bp,而轉(zhuǎn)錄因子NusG 抵消了NusA 的這一效應(yīng),說明NusA 和NusG 因子之間存在競爭相互作用,這一結(jié)果與冷凍電鏡結(jié)果一致[62].

3.3 轉(zhuǎn)錄終止動力學(xué)

原核生命體系中的轉(zhuǎn)錄終止分為兩大類: 內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄終止(intrinsic transcription termination)和外源性轉(zhuǎn)錄終止(extrinsic transcription termination)[63].內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄終止依賴于基因組DNA 上的終止子(terminator)特征序列實現(xiàn),無須額外蛋白質(zhì)干預(yù);外源性轉(zhuǎn)錄終止則依賴于外源蛋白質(zhì)的干預(yù),這與真核生命體系的情況一致.在真核生命體系中,轉(zhuǎn)錄終止均依賴于蛋白質(zhì)干預(yù)來實現(xiàn),主要分為兩大類[64]: poly(A)依賴的轉(zhuǎn)錄終止過程,由poly(A)信號和Rat1/Xrn2 復(fù)合物共同執(zhí)行;Sen1 依賴的轉(zhuǎn)錄終止過程,由Nrd1,Nab3 和Sen1等蛋白質(zhì)復(fù)合物實現(xiàn),負責(zé)真核生命體內(nèi)短非編碼RNA(short non-coding RNA)的終止[65].值得一提的是,人類體內(nèi)存在與Sen1 同源的蛋白質(zhì)——Senataxin(SETX),具備類似的轉(zhuǎn)錄終止功能,并且與人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[12].

單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控方法適用于多物種基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的研究,除了上述介紹的原核體系的基因轉(zhuǎn)錄過程,單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控方法還適用于真核體系的轉(zhuǎn)錄過程研究.2015 年,Fazal等[66]運用單分子光鑷方法研究的真核轉(zhuǎn)錄起始過程,由于真核轉(zhuǎn)錄起始需要十多種轉(zhuǎn)錄因子輔助,因此該研究體系的效率很低.隨后,Wang等[67]構(gòu)建了一種特殊的DNA 泡結(jié)構(gòu),克服了離體研究真核轉(zhuǎn)錄起始效率低的技術(shù)瓶頸,將單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控方法推廣到真核轉(zhuǎn)錄研究體系,實現(xiàn)了高通量、高精度研究真核轉(zhuǎn)錄的動力學(xué)研究.由于該方法越過了真核轉(zhuǎn)錄起始過程,因此僅適用于研究真核轉(zhuǎn)錄延伸和終止等階段的動力學(xué)過程.進一步,Wang等[67]運用單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控方法在體外實驗中研究了Sen1 依賴的轉(zhuǎn)錄終止過程,發(fā)現(xiàn)Sen1 通過擴散、識別并與RNAP 形成相對穩(wěn)定的中間態(tài)復(fù)合物來實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止,并解析了該轉(zhuǎn)錄終止過程中的動力學(xué)參數(shù),該研究為單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控方法研究真核轉(zhuǎn)錄動力學(xué)提供了新的研究范例.

3.4 復(fù)雜體系的轉(zhuǎn)錄調(diào)控動力學(xué)

從空間分布考慮,轉(zhuǎn)錄是基因組DNA 上發(fā)生的一種生命過程,除了與基因組DNA 及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之間發(fā)生相互作用外,還不可避免地與同發(fā)生在基因組DNA 上的其他生命過程產(chǎn)生關(guān)聯(lián),即與其他在基因組DNA 上工作的蛋白質(zhì)機器發(fā)生相互作用,成為了一種相對復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式.RNAP 與其他蛋白質(zhì)分子機器相互作用廣泛存在于生命體中,涉及對復(fù)雜體系中多個蛋白質(zhì)組分的結(jié)構(gòu)變化、運動行為等參量的測量,很難借助單一的研究方法實現(xiàn).

為了解決復(fù)雜體系基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控動力學(xué)研究的難題,研究人員發(fā)展了單分子力學(xué)操控和單分子熒光成像技術(shù)聯(lián)用研究平臺[40,68-70](如圖4),通過實時觀測轉(zhuǎn)錄泡的動態(tài)變化來追蹤RNAP 的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)過程,同時觀測熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在時間和空間中的分布,解析轉(zhuǎn)錄因子與RNAP之間的相互作用與轉(zhuǎn)錄動力學(xué)過程的關(guān)聯(lián).Graves等[70]在體外實驗中構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)DNA 損傷修復(fù)(transcription-coupled DNA repair,TCR)的簡化體系,運用單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控實時展示RNAP 轉(zhuǎn)錄的動態(tài)過程,同時借助單分子熒光方法分別追蹤該轉(zhuǎn)錄動態(tài)過程中RNAP,RNA 和Mfd(TCR 調(diào)控因子)的動力學(xué)行為,發(fā)現(xiàn)RNAP存在于整個轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中,RNA 僅存在于轉(zhuǎn)錄延伸階段直到Mfd 出現(xiàn),Mfd 出現(xiàn)后與RNAP 形成穩(wěn)定的中間態(tài)復(fù)合物,并沿DNA 行走直至解離.進一步,Fan等[41]引入UvrA,UvrB 和UvrC 等下游TCR 調(diào)控因子,運用單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控和單分子熒光成像聯(lián)用的方法,研究了TCR 調(diào)控過程中Mfd 識別RNAP 后的動力學(xué)行為,發(fā)現(xiàn)UvrAB 被快速招募并解離Mfd/RNAP 復(fù)合物,隨后UvrAB 保持結(jié)合在Mfd/RNAP 解離位點(即DNA 損傷位置)附近,因而提高UvrAB 搜尋DNA 損傷的效率以及后續(xù)招募UvrC 切除損傷等過程.這兩項研究詳細闡述了Mfd,UvrA,UvrB和UvrC 等與RNAP 相互作用的動力學(xué)過程,從單個分子水平探索了TCR 調(diào)控機理,為深入研究復(fù)雜生命過程中的分子機理提供了單分子尺度的研究范例,是單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控和單分子熒光成像聯(lián)用的方法的重要應(yīng)用.

4 結(jié)論

本文主要介紹了單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控技術(shù)研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控動力學(xué)的方案.單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控技術(shù)通過實時監(jiān)測轉(zhuǎn)錄泡的動態(tài)變化來表征轉(zhuǎn)錄調(diào)控的動力學(xué)過程,具備單堿基測量精度和高的數(shù)據(jù)采集通量,是研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控動力學(xué)的有力研究手段.其測量的時間精度受限于磁球漲落,為秒的量級,這與一般生物反應(yīng)的時間尺度相當(dāng),但若能對該測量的時間精度進一步提高,將能夠更加精準(zhǔn)地測量生物反應(yīng)過程,或有望對更加快速的生物反應(yīng)過程進行觀測.原理上,縮短超螺旋DNA長度可以增大DNA 剛度,從而降低磁球漲落,進而提高其時間測量精度;另外,減小磁球尺寸也可以有效地降低磁球漲落,進而提高時間測量精度.此外,其他提高時間精度的方案也有待開發(fā).單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控技術(shù)與單分子熒光成像技術(shù)的聯(lián)合使用策略,將該研究手段的應(yīng)用范圍從簡單體系拓展到了更為復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系,可以勝任多種類因子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄動力學(xué)過程,也適用于DNA 雙鏈打開和旋轉(zhuǎn)相關(guān)的生物反應(yīng)過程,為理解復(fù)雜體系的生命現(xiàn)象和規(guī)律提供新的研究示例.本文介紹了單分子磁鑷旋轉(zhuǎn)操控技術(shù)和單分子熒光成像方法的聯(lián)合使用策略,該策略可進一步增加單分子熒光照明和成像波段,增加對復(fù)雜體系中更多組分的熒光成像,實現(xiàn)同時觀測復(fù)雜體系多個組分相互作用的功能.并且介紹了若干單分子技術(shù)的應(yīng)用示例,該示例解決了生命科學(xué)領(lǐng)域里的一系列重要科學(xué)問題,建立了新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型,為全面理解轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律奠定了分子機制基礎(chǔ).