李開敏，劉育辰，劉 剛，張永萍，王 波

（貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025）

肝臟是人體內(nèi)新陳代謝最活躍的器官，參與物質(zhì)代謝并具有解毒作用［1］，易受到化學毒素、病原微生物、酒精等因素誘導，引發(fā)脂肪肝、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等多種肝?。?］。中藥因其具有多成分、多靶點的特點，在保肝方面發(fā)揮重要作用。研究顯示，血人參乙酸乙酯部位具有體外肝損傷保護作用［3-5］。本研究采用H2O2及油酸誘導HepG2 細胞損傷，用于篩選血人參乙酸乙酯部位具有保肝作用的化合物［6-7］。

血人參含有原花青素類鞣質(zhì)、黃酮苷類等成分［3-4，8-13］，現(xiàn)代藥理研究表明其具有保肝、抗氧化、抗癌、抗病毒、降血糖等作用［14］。血人參目前執(zhí)行的質(zhì)量標準為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》 （2003 年版）［15］，但僅有性狀描述，缺少質(zhì)量控制的化學方法。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS） 廣泛應(yīng)用于化學成分研究［16-22］，具有靈敏度高、分辨率高、掃描范圍廣等特點，可有效識別復雜中藥材中的各類成分及其化學結(jié)構(gòu)［23］。本研究以血人參主要藥效部位-乙酸乙酯部位為研究對象，采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)，通過在線數(shù)據(jù)庫匹配、色譜峰的碎片裂解規(guī)律分析、參考相關(guān)文獻和對照品比對，并根據(jù)色譜峰、質(zhì)譜分子離子峰和碎片離子等信息，對化學成分進行結(jié)構(gòu)鑒定和分析，以期為進一步的血人參藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

1 材料

Acquity UPLC I-CLASS 超高效液相色譜儀、XEVO G2-XS Q-TOF 飛行時間質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）； 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； 酶標儀（multiskan FC 型，美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

原花青素A1（批號CYK-Z1810251，純度≥98%）、原花青素A2（批號JKCYK-Z2004091，純度≥98%）、兒茶素（批號ST01600120，純度≥98%）、原花青素B1（批號CYK-Z0382，純度 ≥ 98%）、原花青素 B2（ 批號CHB180902，純度≥98%）、原花青素B3（批號CYKZ0384，純度≥98%）、表兒茶沒食子酸酯（批號BP0539，純度≥98%）、柚皮素-7-O-葡萄糖苷 （批號BP3263，純度≥98%）、根皮苷（批號BP1089，純度≥98%） 對照品均購自武漢瓊格生物科技有限公司； 表兒茶素 （批號CHB180831，純度≥98%） 對照品購自成都克洛瑪生物科技有限公司。谷胱甘肽（GSH）、油紅（北京索萊寶生物科技有限公司，批號630R059、331K057）； H2O2（國藥集團化學試劑有限公司，批號20091021）； 油酸 （美國Sigma-Aldrich 公司，批號20150316215）。血人參購自貴陽德昌祥藥業(yè)有限公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學王波老師鑒定為豆科木藍屬植物茸毛木藍IndigoferastachyodesLindl.的干燥根。乙腈、甲酸為色譜純（美國Tedia 公司）； 水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法

2.1 色譜條件 Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1% 甲酸（B），梯度洗脫（0 ～2 min，2% A； 2 ～4 min，2% ～8% A； 4 ～9 min，8% ～25%A； 9～14 min，25% ～30%A； 14 ～20 min，30% ～65% A； 20 ～27 min，65% ～98% A； 27 ～32 min，98% ～2%A）； 體積流量0.4 mL/min； 柱溫35 ℃； 進樣量1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 ESI 離子源； 負離子模式； 錐孔電壓25 V； 毛細管電壓2.5 kV； 離子源溫度120 ℃； 脫溶劑溫度400 ℃； 脫溶劑氣體積流量1 000 L/h； 采集方式為MSE； 采集時間32 min； 掃描范圍m/z100～1 200。

2.3 細胞液制備及細胞株處理 將10 個對照品用DMSO制成相應(yīng)濃度，加入細胞時用培養(yǎng)液按1 ∶1 000 比例稀釋，即得。人肝癌HepG2 細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL） 中培養(yǎng)，條件為37 ℃、5%CO2、飽和濕度，再用含0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA 溶液消化傳代。

2.4 氧化損傷造模 參考文獻［24］ 報道，HepG2 細胞接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后加入無毒濃度的樣品預孵育12 h，設(shè)陽性藥物對照組（GSH）、溶劑對照組、模型組，每個濃度設(shè)3 ～4 個平行孔。12 h 后在96 孔板中避光加入H2O2（終濃度400 μmol/L） 培養(yǎng)12 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT 液（0.5 mg/mL） 100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去MTT 液，每孔加入DMSO 150 μL，混和振蕩器振蕩，在酶標儀570 nm 波長處測定光密度（OD） 值，計算細胞存活率。

2.5 油酸誘導的脂肪堆積模型及油紅O 染色 參考文獻［25］ 報道，HepG2 細胞接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后加入無毒濃度的樣品、油酸（240 μmol/L），設(shè)非諾貝特陽性藥物對照組（20 mol/L）、溶劑對照組、模型組，繼續(xù)作用于細胞24 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 胎牛血清，30 s后棄去，重復3 次，再加入100 μL 4%多聚甲醛固定細胞，靜置40 min，棄去多聚甲醛，每孔加入100 μL 胎牛血清，30 s 后棄去，重復3 次，每孔加入100 μL 油紅染料，置于暗處避光，染色1 h 后棄去染料，每孔加入100 μL 胎牛血清，30 s 后棄去，重復3 次，每孔再加入50 μL 異丙醇，振蕩10 min，在酶標儀532 nm 波長處測定OD 值，計算抑制率，公式為抑制率＝ ［（模型組OD 值-給藥組OD值） /模型組OD 值］ ×100%。

2.6 供試品、對照品溶液制備

2.6.1 供試品溶液 精密稱定藥材粉末2 g，置于150 mL量瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，回流提取4 h，濾過，濃縮得浸膏，等量蒸餾水溶解浸膏成混懸狀，依次用等量石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層揮干，50% 甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的溶液，50% 甲醇稀釋5 倍，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.6.2 對照品溶液制備 精密稱取原花青素A1、原花青素A2、兒茶素、原花青素B1、原花青素B2、原花青素B3、原花青素B4、表兒茶素、表兒茶沒食子酸酯、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、根皮苷對照品各1 mg，50%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL 的溶液，即得。

3 結(jié)果

3.1 成分鑒定 將血人參供試品溶液和混合對照品溶液按“2.1” 和“2.2” 項下檢測條件進行UPLC-Q-TOF-MS 分析，得負離子模式下的總離子流圖，見圖1。色譜分離血人參乙酸乙酯樣品得到了比較良好的總離子流色譜圖，各峰的分離度均較良好； 負離子掃描模式下檢測質(zhì)量精度良好，能滿足通過精確質(zhì)量數(shù)去鑒定分子式、碎片元素組成的要求。根據(jù)血人參化學成分的保留時間（tR） 和質(zhì)譜信息，并結(jié)合對照品、相關(guān)文獻、數(shù)據(jù)庫和二級質(zhì)譜碎片信息進行比對，共鑒定和推測出了27 個化合物，其中原花青素類鞣質(zhì)18 個，黃酮苷類4 個。經(jīng)二次質(zhì)譜實驗，20 min以前以原流動相梯度洗脫，得到與原來一致的總離子流圖，增加有機相比例后，未見有意義的成分，因此對照品負離子模式下的總離子流圖時間為20 min。保留時間23.95、24.17、24.33、24.83、25.91 min 可能為脂肪酸類化合物，由于該類成分質(zhì)譜碎片信息有限，幾乎無碎片離子，只能確定分子離子，是否有支鏈及不飽和脂肪酸的雙鍵位置無法確定?；衔镨b定結(jié)果見表1。

3.2 裂解規(guī)律研究

3.2.1 原花青素類化合物 原花青素又稱為縮合單寧［26］，是一類由黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)單元通過C-C 鍵縮合形成的不同聚合度的混合物，按照黃烷-3-醇之間連接方式的不同，分為A 型和B 型，前者由一個碳鍵C4→C8或C4→C6和一個醚鍵C2→O→C7連接形成，后者通過一個碳鍵C4→C8或C4→C6連接形成［27］。其聚合度、單體結(jié)構(gòu)單元以及黃烷間連接類型和位置的變化導致原花青素分子之間存在相當大的結(jié)構(gòu)復雜性和異構(gòu)性［28］。在血人參中共檢測出原花青素單聚體，二聚體和三聚體三種類型。單聚體以化合物2 為例，其保留時間5.18 min，在負離子模式下準分子離子峰為m/z289.071 7 ［M-H］-，分子式為C15H14O6，根據(jù)二級質(zhì)譜圖母離子失去一分子H2O 得到m/z271.061 2 離子，再失去一個中性分子C3O2得到m/z203.075 1 離子，母離子失去一個中性分子CO2得到m/z245.089 8 離子，母離子失去二分子C2H2O 得到m/z205.061 7 離子，結(jié)合對照品比對及文獻［29-31］ 鑒定該化合物為兒茶素?；衔? 的準分子離子峰m/z289.071 7 ［M-H］-與化合物2 相同，其二級質(zhì)譜裂解碎片也一致，推測二者為同分異構(gòu)體，根據(jù)對照品及文獻［32］ 比對，確定化合物7 為表兒茶素。其在負離子模式下的質(zhì)譜及裂解方式見圖2～3。

圖2 兒茶素低能量通道（A）、高能量通道（B） 質(zhì)譜圖

在血人參乙酸乙酯部位中檢測到原花青素二聚體有A型和B 型，2 種類型原花青素的裂解主要是黃烷間連接鍵的斷裂、逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)（RDA 反應(yīng)，發(fā)生在C2和O，C3和C4鍵的斷裂）、C 環(huán)開環(huán)后失去1 個間苯三酚單元。A 型原花青素以化合物19 為例，準分子離子峰為m/z575.120 3 ［M-H］-，產(chǎn)生的二級碎片離子有m/z449.087 9［M-H-C6H5O2］-、RDA 反應(yīng)得到m/z425.073 8 ［M-HC9H10O3］-、黃烷單元間的共價鍵斷裂和醚鍵斷裂分別得到m/z289.071 9 ［catechin-H］-、m/z285.045 4 ［M-Hcatechin］-。根據(jù)對照品及文獻［33］ 報道，推測其為原花青素A2，化合物13 ～14、19 的準分子離子峰均為m/z575.120 3 ［M-H］-，主要質(zhì)譜裂解碎片一致，推測三者為同分異構(gòu)體； B 型原花青素以化合物5 為例，其保留時間為5.85 min，在負離子模式下準分子離子峰為m/z577.314 1 ［M-H］-，碎片離子主要有C4-C8鍵斷裂脫去一分子兒茶素289.071 9 ［M-H-catechin］-，再失去一分子C6H8O3得到碎片離子m/z161.033 2 ［M-H-C6H8O3］-，C環(huán)開環(huán)后，脫掉C2、C3失去一個間苯三酚單元形成碎片離子m/z451.103 8 ［M-H-C6H6O3］-、RAD 反應(yīng)得到碎片離子425.089 4 ［M-H-C8H8O3］-及進一步脫水后得到碎片離子m/z407.075 7 ［M-H-C8H8O3-H2O］-，根據(jù)對照品及文獻［33-36］ 報道比對，鑒定化合物5 為原花青素B 型二聚體類化合物原花青素B2，化合物1、3～5、8、10、20 的準分子離子峰均為m/z577.314 1 ［M-H］-，主要質(zhì)譜裂解碎片一致，推測7 種化合物為同分異構(gòu)體，其質(zhì)譜及裂解途徑見圖4～6。

圖4 原花青素A2 低能量通道（A）、高能量通道（B）質(zhì)譜圖

圖5 原花青素B2 低能量通道（A）、高能量通道（B）質(zhì)譜圖

圖6 原花青素A2、B2 裂解規(guī)律

三聚體以化合物6 為例，其保留時間為6.11 min，在負離子模式下準分子離子峰為m/z863.181 0 ［M-H］-，產(chǎn)生的碎片離子有m/z711.129 3 ［M-H-C6H5O2］-，繼續(xù)失去一分子catechin 得到碎片離子m/z411.074 0 ［M-Hcatechin］-； 黃烷單元間的共價鍵斷裂得到m/z289.071 9［catechin-H］-和m/z573.101 6 ［M-H-catechin］-，并失去一個小分子得到m/z451.103 8 ［M-H-C6H5O2］-，碎片離子m/z289.071 9 ［catechin-H］-失去一分子CO2得到m/z245.086 6 ［M-H-CO2］-。根據(jù)以上裂解方式結(jié)合文獻［35］，鑒定化合物6 為肉桂鞣質(zhì)D1或其異構(gòu)體，分子式為C45H36O18?；衔?、9、11 ～12 的準分子離子峰均為m/z863.181 0 ［M-H］-，主要質(zhì)譜裂解碎片一致，推測四者為同分異構(gòu)體，其在負離子模式下的質(zhì)譜及裂解方式見圖7～8。

圖7 肉桂肉質(zhì)D1 或其異構(gòu)體低能量通道（A）、高能量通道（B） 質(zhì)譜圖

化合物17 （tR＝7.58 min） 分子式為C22H18O10，在負離子模式下準分子離子峰均為m/z441.081 3 ［M-H］-，其裂解途徑主要是酯鍵的斷裂產(chǎn)生2 個碎片離子m/z271.068 0 ［M-H-Gallic acid］-、m/z169.020 5 ［M-Hcatechin］-，在質(zhì)譜中出現(xiàn)的離子m/z169 是特征性離子，此離子的存在說明結(jié)構(gòu)中有沒食子酸根的存在，該裂解特征與文獻［37］ 報道一致，根據(jù)對照品比對，鑒定化合物17 為表兒茶沒食子酸酯，化合物18 與其均具有相同的分子離子峰，其二級質(zhì)譜裂解碎片一致，推測二者為同分異構(gòu)體，推測其為兒茶沒食子酸酯。其質(zhì)譜及裂解途徑見圖9～10。

圖9 表兒茶沒食子酸酯的低能量通道（A）、高能量通道（B） 質(zhì)譜圖

圖10 表兒茶沒食子酸酯裂解規(guī)律

3.2.2 黃酮苷類化合物 黃酮類化合物廣泛存在于自然界，是一類基本母核為2-苯基色原酮的化合物，大部分以游離形式、與糖結(jié)合成苷類或以碳糖基的形式存在。由于黃酮類化合物具有相同的母核，該類化合物有相似的裂解規(guī)律［38］。在血人參中共鑒定出4 個黃酮苷類化合物，質(zhì)譜裂解規(guī)律主要表現(xiàn)丟失其糖基而得到苷元的離子峰，因此化合物15～16、21 ～22 被鑒定為黃酮苷類成分，其中化合物21～22 經(jīng)對照品比對及文獻［39-40］ 報道，分別鑒定為柚皮素-7-O-葡萄糖苷（21）、根皮苷（22），而化合物15～16 表現(xiàn)為與柚皮素-7-O-葡萄糖苷一樣的質(zhì)譜裂解規(guī)律，因此鑒定為柚皮素-7-O-葡萄糖苷同分異構(gòu)體，分別為柚皮素-5-O-葡萄糖苷或其異構(gòu)體、柚皮素-4＇-O-葡萄糖苷或其異構(gòu)體。其質(zhì)譜及裂解規(guī)律見圖11～12。

圖11 根皮苷低能量通道（A）、高能量通道（B） 質(zhì)譜圖

圖12 根皮苷裂解規(guī)律

3.2.3 化合物對H2O2誘導HepG2 細胞損傷的保護作用400 μmol/L H2O2作用于HepG2 細胞12 h 后，對人肝細胞產(chǎn)生顯著損傷，細胞存活率低于空白對照組（P＜0.01）；原花青素B2對H2O2導致的HepG2 細胞損傷有保護作用，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）； 陽性對照藥（GSH） 亦表現(xiàn)顯著肝細胞損傷保護活性（P＜0.05），見表2。

表2 各化合物對H2O2 誘導HepG2 細胞損傷的保護作用（±s）

表2 各化合物對H2O2 誘導HepG2 細胞損傷的保護作用（±s）

注： 與空白對照組比較，**P＜0.01； 與H2O2 比較，＃P＜0.05。

化合物濃度/（μmol·L-1）OD 值存活率/%空白對照組—0.852±0.022100.00 H2O2—0.638±0.061** 74.82 GSH200.740±0.014＃ 86.79原花青素B1100.703±0.05082.52兒茶素100.670±0.03778.63原花青素B3100.698±0.02881.91原花青素B2100.754±0.025＃ 88.48表兒茶素100.588±0.05569.01原花青素A1100.621±0.02872.85表兒茶素沒食子酸酯100.710±0.02683.37原花青素A2100.649±0.06276.16槲皮素-7-O-葡萄糖苷100.675±0.03179.20根皮苷100.681±0.03779.87

3.2.4 化合物對油酸誘導HepG2 細胞損傷的保護作用240 μmol/L 油酸作用于HepG2 細胞24 h 后，細胞內(nèi)形成顯著的脂質(zhì)沉積，脂滴含量升高（P＜0.01）； 根皮苷對油酸誘導的HepG2 細胞脂質(zhì)沉積呈現(xiàn)抑制活性，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）； 陽性對照藥（非諾貝特）對油酸誘導的HepG2 細胞脂質(zhì)沉積也表現(xiàn)出顯著的抑制作用（P＜0.05），見表3。

表3 各化合物對油酸誘導HepG2 細胞脂質(zhì)沉積的保護作用（±s）

表3 各化合物對油酸誘導HepG2 細胞脂質(zhì)沉積的保護作用（±s）

注： 與空白對照組比較，**P＜0.01； 與油酸比較，＃P＜0.05。

化合物濃度/（μmol·L-1）OD 值抑制率/%空白對照組—0.209±0.019—油酸—0.371±0.046**—非諾貝特200.309±0.021＃ 16.63原花青素B1100.384±0.033-3.58兒茶素100.373±0.027-0.45原花青素B3100.400±0.038-7.86原花青素B2100.342±0.0377.89表兒茶素100.347±0.0386.59原花青素A1100.363±0.0292.11表兒茶素沒食子酸酯100.374±0.032-0.88原花青素A2100.360±0.0312.89槲皮素-7-O-葡萄糖苷100.370±0.0170.39根皮苷100.258±0.058＃ 30.51

4 討論

本實驗在負離子模式下，采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對血人參中的化學成分進行了系統(tǒng)分析，根據(jù)信號峰的保留時間、質(zhì)譜圖信息、精確相對分子質(zhì)量信息及分子式，結(jié)合對照品，利用UNIFY 軟件及參考文獻共鑒定出22 個主要信號峰的成分，并總結(jié)了它們的裂解規(guī)律。其中化合物8、10～12、14～16、20、22 首次在血人參中發(fā)現(xiàn)。該方法具有快速、準確等特點，可對多種類型化合物進行定性鑒別，同時也進一步為血人參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、飲片炮制工藝研究及體內(nèi)外成分分析研究提供參考依據(jù)。此外，由于原花青素二聚體和三聚體上羥基的鏈接位置不同，導致該類成分中的同分異構(gòu)體較多，上述裂解規(guī)律也為原花青素二聚體和三聚體成分的結(jié)構(gòu)鑒定提供了重要依據(jù)，為今后原花青素類和黃酮苷的研究奠定了基礎(chǔ)，為中藥天然產(chǎn)物的鑒定提供了方法參考。本研究通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，原花青素B2對H2O2導致的HepG2 細胞損傷具有保護作用，根據(jù)文獻報道，原花青素B2可提高肝細胞增殖活力，其保肝作用機制可能調(diào)控修復基因HOGG1 表達有關(guān)［41-43］； 根皮苷對油酸誘導的人肝細胞脂質(zhì)沉積表現(xiàn)顯著抑制活性，這與文獻［25-44］ 報道一致，其體外保肝作用可能與提高脂肪氧化代謝基因的表達和降低膽固醇合成相關(guān)基因的表達有關(guān)。本研究結(jié)果為血人參的進一步利用開發(fā)提供科學的理論依據(jù)。