楊欣,危英,李星

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴陽(yáng) 550025; 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,貴陽(yáng) 550025; 3.貴州百靈制藥股份有限責(zé)任公司,安順 550001)

中國(guó)自發(fā)生新型冠狀病毒肺炎后,全國(guó)各地提出了新冠肺炎防治的中藥處方,金銀花是其中使用頻次較高的中藥之一[1]。金銀花為忍冬科(Caprifoliaceae) 植物忍冬的帶初開的花或干燥花蕾。具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效,廣泛用于喉痹、癰腫疔瘡、丹毒、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等,分布廣泛,如貴州、河南、山東等地。主要化學(xué)成分有揮發(fā)油類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、有機(jī)酸類、三萜皂苷類及其他類成分。臨床上常用于呼吸道及肺炎、皮膚疾病等疾病的治療[2]。

蛋白酶的異常表達(dá)和活化與疾病有關(guān),利用抑制劑抑制蛋白酶的活性可達(dá)到治療相關(guān)疾病的目的,組織蛋白酶L(Cathepsin L,CTSL)具有木瓜蛋白酶家族的氨基酸序列,以酶原的形式貯存于溶酶體中,是一種有效的內(nèi)肽酶,與溶酶體蛋白的降解有關(guān)[3]。該酶參與多種生物學(xué)和疾病發(fā)生發(fā)展過程,通過激活新型冠狀病毒的刺突蛋白,在病毒入侵過程中起著重要的作用,是篩選抗新型冠狀病毒藥物的重要靶點(diǎn)[4]。人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)蛋白酶是HIV病毒全基因編碼,裂解HIV病毒的前體多肽,公認(rèn)為篩選抗HIV-1藥物的重要靶點(diǎn)[5]。雖然冠狀病毒的編碼與人類免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus,HIV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)蛋白酶的酶分類不同,但是臨床研究結(jié)果顯示一些HIV蛋白酶抑制劑,如奈非那韋(Nelfifinavir)、阿扎那韋(Atazanavir)、達(dá)蘆那韋(Darunavir)等能顯著抑制病毒的復(fù)制,加強(qiáng)病毒感染后藥物的治療效果。

現(xiàn)通過分子對(duì)接結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析金銀花與HIV-1和CTSL蛋白酶的結(jié)合情況,主要基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET) 技術(shù)分析金銀花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物和85% 醇提物抑制HIV-1和CTSL蛋白酶的活性,為抗病毒藥物的開發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

2019年5月金銀花藥材采自貴州省安順市,由貴州中醫(yī)藥大學(xué)陳德媛教授(生藥學(xué)專家)鑒定為金銀花(LonicerajaponicaThunb.),植物標(biāo)本存放在貴州中醫(yī)藥大學(xué)科研樓322(標(biāo)本號(hào)為L(zhǎng)J2019.04)。

1.2 試劑

100%甲醇(分析純,北京索萊寶科技有限公司);SensoLyte? 520 HIV-1試劑盒Fluorimetric (AS-71147),SensoLyte? 520 Cathepsin L試劑盒Fluorimetric (AS-72218) 購(gòu)于美國(guó)圣何塞 AnaSpec。

1.3 儀器及軟件

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100D-WD,日本東京理化公司),電子分析天平(MS205DU,梅特勒托利多公司),酶標(biāo)儀(Synergy II,美國(guó)伯騰公司),384孔板(批號(hào):31018008,康寧公司),DMSO(D8370,索萊寶公司),Mili-Q系統(tǒng)超純水(Advantage A10,美國(guó)密理博公司),SYBYL (2.1.1,美國(guó)Tripos公司)

2 方法

2.1 金銀花活性成分篩選

金銀花的化學(xué)成分基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)篩選。TCMSP平臺(tái)收錄的中藥種類繁多,中藥成分信息主要來(lái)自文獻(xiàn)挖掘和數(shù)據(jù)庫(kù)整合,針對(duì)每味中藥,在互聯(lián)網(wǎng)上查找了與其相關(guān)的已發(fā)表的文獻(xiàn)和書籍,并參考了 TCM@taiwan、TCMD、TCMID等多個(gè)中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù),獲取到每味中藥的可靠的成分信息,可以下載化合物的三維結(jié)構(gòu)。

設(shè)置TCMSP相關(guān)指標(biāo):分子量(molecular weight,MW)、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)、類藥性(drug likeness,DL)篩選金銀花化學(xué)成分[6]。基于TCMSP在Herb name中查找金銀花的化學(xué)成分。相關(guān)參數(shù)設(shè)置為:OB≥30%,DL≥0.18,MW≤500,保存為mol2格式。

2.2 受體和配體文件準(zhǔn)備

從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)RCSB (http://www.rcsb.org/pdb ) 獲取CTSL(PDB ID:3OF9)和HIV-1蛋白酶(PDB ID:1QBS)。利用 SYBYL 2.1.1 對(duì)蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行抽離配體、刪除水分子、加氫、修復(fù)側(cè)鏈氨基酸、加電荷、提取配體等前處理,保存?zhèn)溆?運(yùn)用 SYBYL 2.1.1 構(gòu)建金銀花配體庫(kù)并完成分子優(yōu)化,設(shè)置參數(shù):選擇 GasteigerHückel 電荷,采用 Tripos 力場(chǎng),最大迭代系數(shù)設(shè)置為10 000,其他參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值,優(yōu)化后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 分子對(duì)接分析

采用 SYBYL 2.1.1中的 Surflex-Docking 模塊探究蛋白結(jié)合口袋中的配體-受體相互作用。Surflex-Dock是SYBYL軟件中的分子對(duì)接模塊,它采用獨(dú)特的經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)和基于分子相似性的搜索引擎,將配體分子對(duì)接至蛋白的結(jié)合位點(diǎn)[7]。Surflex-Dock使用原型分子(protomol)表示蛋白的結(jié)合口袋,利用探針探測(cè)蛋白口袋表面疏水、氫鍵和靜電等性質(zhì),生成蛋白質(zhì)活性口袋的負(fù)像。結(jié)果以總分值(T_Score)為閾值進(jìn)行分析,其綜合考慮了極性、疏水、溶劑化等作用,數(shù)值越大說明小分子和大分子相互作用力越好。運(yùn)用 Ligplot1.4.5軟件對(duì)結(jié)合好的蛋白復(fù)合物相互作用力進(jìn)行分析,證實(shí)氫鍵在對(duì)接中起著重要的作用。

2.4 化學(xué)成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型

基于Cytoscape 3.6.1 (https://cytoscape.org/download.html)構(gòu)建化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型,Cytoscape 的核心是網(wǎng)絡(luò),包括節(jié)點(diǎn)(node)和邊(edge),每個(gè)節(jié)點(diǎn)可以是基因或蛋白質(zhì)等;節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接 (edge) 代表著這些節(jié)點(diǎn)之間的相互作用。

2.5 金銀花不同溶劑提取物的制備

新鮮金銀花置于45 ℃烘箱中烘干,并用藥材粉碎機(jī)打磨成粉末。分別取25 g藥材,粉碎,置于4個(gè)圓底燒瓶中,燒瓶中分別加入蒸餾水、30%甲醇、60%甲醇、85%甲醇各200 mL、超聲2 min后,加熱回流提取3次,第一、二次回流提取1 h,第3次回流0.5 h,合并提取液,減壓濃縮成浸膏,真空干燥,分別得水提取、30%醇提物、60%醇提物和85%的醇提物。

2.6 熒光法驗(yàn)證金銀花不同溶劑提取物抗RNA病毒蛋白酶的活性

根據(jù)文獻(xiàn)[8]的試驗(yàn)方法,使用CTSL 和 HIV 蛋白酶試劑盒評(píng)價(jià)金銀花不同溶劑提取物的活性。按照HIV-1蛋白酶試劑盒說明書進(jìn)行操作,8 μL 重組 HIV-1蛋白酶加入 2 μL 金銀花不同溶劑提取物,加入 10 μL HIV-1 蛋白酶底物啟動(dòng)反應(yīng),反應(yīng)混合物在37 ℃卵孵 30 min ;按照CTSL試劑盒說明書進(jìn)行操作,2 μL 金銀花不同溶劑提取物 和 8 μL 人重組組織蛋白酶加入384孔板,在室溫下預(yù)先暖孵10 min,每孔加入10 μL 新鮮組織蛋白酶底物溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。反應(yīng)混合物在37 ℃卵孵 30 min。每個(gè)樣本測(cè)試三次,分別在490 nm和520 nm下檢測(cè)樣本的熒光值。

2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 金銀花小分子配體庫(kù)

篩選金銀花21個(gè)活性成分,21活性成分有較好的口服吸收利用度,類藥性和分子量符合前面篩選的要求(表1),基于SYBYL優(yōu)化后保存SDF格式,用于后面的分子對(duì)接分析。綠原酸的口服吸收利用度為11.93%,雖然沒有達(dá)到30%,但是綠原酸是最為重要的清熱解毒活性物質(zhì),將納入研究。

表1 金銀花化學(xué)成分篩選

3.2 受體和配體優(yōu)化

3.2.1 配體優(yōu)化

基于SYBYL對(duì)金銀花活性成分進(jìn)行優(yōu)化,圖1為未優(yōu)化的活性成分3D結(jié)構(gòu),對(duì)小分子配體進(jìn)行基于Tripos力場(chǎng)的能量最小化計(jì)算,優(yōu)化分子結(jié)構(gòu),獲得合理構(gòu)象(圖2)。

圖1 金銀花優(yōu)化前的3D分子結(jié)構(gòu)

圖2 金銀花優(yōu)化后的3D分子結(jié)構(gòu)

3.2.2 受體優(yōu)化

基于PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載CTSL蛋白酶結(jié)構(gòu),通過SYBYL去水、加全氫、加電子,選擇Ligand(A/IOX5O1)模式形成口袋(圖3);基于PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載HIV-1蛋白酶結(jié)構(gòu),選擇Ligand(A/DMP323)模式形成口袋,如圖4所示。

圖3 組織蛋白酶L的蛋白結(jié)構(gòu)及結(jié)合口袋

圖4 HIV-1蛋白酶的蛋白結(jié)構(gòu)及結(jié)合口袋

3.3 分子對(duì)接分析

金銀花與HIV-1和CTSL蛋白酶分子對(duì)接結(jié)果得到T_Score、Crash和Polar 等參數(shù)值為對(duì)接成功,按默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分子對(duì)接后,每個(gè)小分子輸出20種構(gòu)象(表2)。陽(yáng)性對(duì)照藥Pepstatin A(22)與HIV-1 蛋白酶的T_Score為 10.2,說Pepstatin A與HIV-1 蛋白酶結(jié)合能力較好。金銀花20個(gè)活性成分與HIV-1 蛋白酶有較好的結(jié)合(T_Score >5),11個(gè)化學(xué)成分有強(qiáng)烈的結(jié)合(T_Score >7),其中六氫番茄紅素與HIV-1 蛋白酶結(jié)合最好,圖5是六氫番茄紅素與HIV-1 蛋白酶結(jié)合口袋;陽(yáng)性對(duì)照藥Cathpsin L 抑制劑(23)與CTSL蛋白酶的T_Score值為 8.5,說明Cathpsin L抑制劑與CTSL結(jié)合能力較好。金銀花中9個(gè)活性成分與CTSL活性有較好的結(jié)合(T_Score >5),3個(gè)活性成分有強(qiáng)烈的結(jié)合(T_Score >7),其中Mandenol 與CTSL結(jié)合最好,圖6是Mandenol 與CTSL結(jié)合口袋。運(yùn)用 Ligplot1.4.5軟件對(duì)結(jié)合好的蛋白復(fù)合物相互作用力進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)金銀花化學(xué)成分與HIV-1和CTSL蛋白酶分別形成46個(gè)和10個(gè)氫鍵。

圖5 六氫番茄紅素與HIV-1蛋白酶結(jié)合口袋

圖6 Mandenol與CTSL結(jié)合口袋

表2 分子對(duì)接結(jié)果分析

3.4 化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型

基于Cytoscape軟件構(gòu)建了化學(xué)成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型,HIV-1 蛋白酶和CTSL為靶節(jié)點(diǎn)(target node),節(jié)點(diǎn)的連通度越高,節(jié)點(diǎn)越大,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)金銀花抗HIV-1蛋白酶和CTSL的作用具有整體性,9個(gè)化學(xué)成分能同時(shí)影響HIV-1 蛋白酶和CTSL的活性(表3),將采用實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證分子對(duì)接的結(jié)果。

表3 化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

3.5 金銀花不同溶劑提取物抗HIV-1和組織蛋白酶L活性

從分子對(duì)接分析發(fā)現(xiàn)金銀花整體抗HIV-1蛋白酶的作用可能比CTSL作用要強(qiáng),制備金銀花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物和85% 醇提物,為了有效地證實(shí)分子對(duì)接篩選結(jié)果,明確金銀花不同提取工藝制備的制劑,其藥效的差異性,為后面深入研究提供理論依據(jù)。通過熒光法分析發(fā)現(xiàn)金銀花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物和85% 醇提物具有抗HIV-1的活性。金銀花水提物、30%、60%、85% 醇提物半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值依次為0.147、0.015、0.05、0.121 mg/mL(表4)。通過熒光法分析發(fā)現(xiàn)金銀花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物、85% 醇提物沒有強(qiáng)烈的抗組織蛋白酶L的活性(表4),也充分證明了分子對(duì)接篩選的結(jié)果。

表4 金銀花不同溶劑提取物抗HIV-1蛋白酶和CTSL活性(n=3)

4 討論

金銀花從古至今被譽(yù)為清熱解毒的良藥,能宣風(fēng)散熱,還可清熱解毒。目前,在食品行業(yè)有較多的金銀花產(chǎn)品,如金銀花糖、金銀花飲料、金銀花茶等,受到人們的喜愛。同時(shí),金銀花抗菌、降血脂、抗炎、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等生物活性表現(xiàn)出獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值,具有較好的應(yīng)用前景[10]。已經(jīng)有多項(xiàng)研究表明金銀花在抗病方面有較大的優(yōu)勢(shì),如金銀花提取物中的氯原酸銀花對(duì)呼吸道病毒(合胞病毒和柯薩奇)有明顯的抑制作用[11];王變利等[12]研究表明金銀花水提取對(duì)甲型流感病毒 H1N1 株有明顯抑制作用;賈偉等[13]研究表明金銀花多糖具有良好的抗甲型流感病毒的作用,能延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間,降低病毒感染小鼠的死亡率,減輕肺病變程度;王劍等[14]研究表明金銀花多糖抑制單純皰疹病毒、柯薩奇病毒 B3、柯薩奇病毒 B5等多種病毒;汪曉露等[15]研究表明中藥金銀花被廣泛運(yùn)用在 COVID-19 治療中,如金花清感顆粒、連花清瘟膠囊、熱毒寧注射液、雙黃連口服液等以金銀花為組成的中成藥被推薦在多個(gè) COVID-19 診療方案中。

金銀花的功能性成分主要有黃酮類、有機(jī)酸、揮發(fā)油、三萜皂苷類等。金銀花中最早分離得到的金銀花黃酮類化合物是木犀草素[16];有機(jī)酸類如綠原酸、異綠原酸、咖啡酸、棕櫚酸等,綠原酸是最為重要的清熱解毒活性物質(zhì),有機(jī)酸類成分是金銀花清熱解毒的物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)基于TCMSP金銀花的化學(xué)成分進(jìn)行篩選,這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的化學(xué)成分信息主要來(lái)自文獻(xiàn)挖掘和數(shù)據(jù)庫(kù)整合,針對(duì)每味中藥,在互聯(lián)網(wǎng)上查找了與其相關(guān)的已發(fā)表的文獻(xiàn)和書籍,并參考了 TCM@taiwan、TCMD、TCMID 等多個(gè)中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù),獲取到每味中藥的可靠的成分信息[17]。通過分子對(duì)接及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)金銀花具有抗HIV-1的活性,尚未發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)烈抑制組織蛋白酶L的活性。蛋白酶的異常表達(dá)和活化與疾病有關(guān),CTSL 已被公認(rèn)為是篩選抗新型冠狀病毒藥物的重要靶點(diǎn),在病毒入侵過程中扮演著重要的作用。臨床研究結(jié)果顯示一些HIV蛋白酶抑制劑已顯著抑制新冠病毒的復(fù)制,提升新冠病毒感染后藥物治療效果。

本文研究的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)主要基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET) 技術(shù),其是比較早發(fā)展起來(lái)的一門技術(shù),是一種能實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化激酶活性檢測(cè)方法。這種方法主要將“供體”和“受體”熒光分子連接在一起,如果“供體”光分子受到激發(fā)時(shí),能將非放射性的能量轉(zhuǎn)移到“受體”熒光分子上,并發(fā)生熒光信號(hào)[18-19]。通過熒光法分析發(fā)現(xiàn)金銀花水提物、30%醇提物、60%醇提物和85%醇提物具有抗HIV-1的活性,與篩選的結(jié)果具有一致性。目前本文研究存在著一定的局限性,如生理狀態(tài)下蛋白酶結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化信息難以獲得。因此,下一步本課題組將采用分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)能夠彌補(bǔ)這一不足,揭示蛋白酶構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化的過程,獲得其構(gòu)象變化過程中的能量信息等。

5 結(jié)論

通過分子對(duì)接及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)金銀花具有抗HIV-1的活性,尚未發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)烈抑制組織蛋白酶L的活性。金銀花抗HIV-1蛋白酶活性強(qiáng)于Cathepsin L蛋白酶。金銀花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物和85% 醇提物具有抗HIV-1的活性,其中30% 醇提物具有較好的抗HIV-1的作用。