劉其酉，張巧毅，林元山

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南長沙 410128）

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是一種同型乳酸發(fā)酵菌（Payot 等，1999）；在營養(yǎng)缺失和環(huán)境惡劣的條件下可以形成芽孢，具有很強的抗逆性和長時間的商品貨架期（Hyronimus 等，2000），在畜牧業(yè)中廣泛應用，常作為飼料添加劑，可以改善畜禽腸道健康（朱明明等，2022 ；牛自康等，2019）。凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢具有高度抗逆性，不僅能順利通過動物的胃腸道，還能耐受加工過程中的高溫、高壓、高機械剪切力等環(huán)境，減少生產(chǎn)和保存期間的菌體損失（Bagkar 等，2021 ；Haldar 等，2020）。因此，在工業(yè)生產(chǎn)中，生產(chǎn)的主要目標是其芽孢體。目前凝結(jié)芽孢桿菌工業(yè)化發(fā)酵水平芽孢數(shù)為3.0×109CFU/mL（涂家霖等，2021），無法滿足現(xiàn)在日益增長的對凝結(jié)芽孢桿菌的需求，限制了該菌種適用面。本試驗通過三步法逐步進行優(yōu)化，平衡培養(yǎng)條件，提高凝結(jié)芽孢桿菌的生物量和芽孢數(shù)，縮短整個產(chǎn)芽孢周期，為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 菌種：湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物工程研究所篩選保藏的凝結(jié)芽孢桿菌（Lys 274）。

種子培養(yǎng)基：玉米淀粉10 g/L，葡萄糖2 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L（固體培養(yǎng)基，添加瓊脂20 g/L）。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：玉米淀粉20 g/L，酵母膏20 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加需要的碳源、氮源和無機鹽。

1.2 儀器與設(shè)備 電子分析天平（CAV812），高壓蒸汽滅菌鍋（ES-315），振蕩培養(yǎng)箱（ZQLY-180N），三用電熱恒溫水箱（HHW21.420A Ⅱ），722 型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)方法 初始培養(yǎng)條件：pH=7.0、裝液量100 mL、棉球塞封口、接種量為2%（v/v ：體積比）、35℃，200 r/m 培養(yǎng)44 h。

1.3.2 計數(shù)方法 活菌數(shù)測定：參照周德慶（1986）的方法，以十倍稀釋法進行涂布計數(shù)。芽孢數(shù)測定：80℃水浴加熱10 min，再以10 倍稀釋法進行涂布計數(shù)。

1.3.3 發(fā)酵條件單因素優(yōu)化 分別將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH 設(shè)置為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，8.0（1 M HCl 和NaOH 調(diào)pH）；培養(yǎng)溫度設(shè)置為28、30、32、35、37、40℃，其余按初始條件培養(yǎng)。

1.3.4 培養(yǎng)基碳氮源優(yōu)化 選取葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油和糊精替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源（5 g/L）培養(yǎng)；選取酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、黃豆粉、玉米蛋白粉、硫酸銨、硝酸銨替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基氮源（10 g/L）培養(yǎng)；選取結(jié)果較優(yōu)秀的碳源和氮源進行混合正交試驗。

1.3.5 培養(yǎng)基金屬離子優(yōu)化 在優(yōu)化的復合培養(yǎng)基中分別加入CaCl22 g/L，MgCl22 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO42 g/L，MnSO4·H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eCl2·4H2O 0.2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L，以優(yōu)化的發(fā)酵條件進行培養(yǎng)。選擇能促進產(chǎn)芽孢的金屬離子進行正交試驗優(yōu)化，并對優(yōu)化結(jié)果進行驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線繪制 每2 h 測定發(fā)酵液的OD600數(shù)值，繪制凝結(jié)芽孢桿菌Lys 274 的生長曲線。由圖1 可知，Lys 274 在0 ～8 h 為生長停滯期；10 ～18 h 為生長對數(shù)期；20 ～40 h 為菌體生長的相對穩(wěn)定期，并于22 h 達到第一個高峰，32 h后Lys 274 由于營養(yǎng)不足，顯微鏡觀察菌體開始轉(zhuǎn)向芽孢化，導致OD600的吸光值再次升高，直至42 h 達到最高峰，然后開始呈下降趨勢，進入衰亡期。確定凝結(jié)芽孢桿菌Lys 274 的種子液培養(yǎng)基培養(yǎng)時間為20 h，培養(yǎng)44 h 進行生物量和芽孢涂布計數(shù)為適宜。

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌Lys 274 生長曲線

2.2 發(fā)酵條件單因素優(yōu)化 由圖2 可知，在初始條件下，培養(yǎng)的凝結(jié)芽孢桿菌生物量為2.70×108CFU/mL 和芽孢數(shù)為6.15×107CFU/mL，芽孢率達22.78%。確定最適培養(yǎng)條件為初始pH=6.0、37 ℃培養(yǎng)44 h。優(yōu)化后得到5.15×108CFU/mL 的生物量和1.15×108CFU/mL 的芽孢數(shù)，芽孢率達22.33%。

圖2 發(fā)酵條件對凝結(jié)芽孢桿菌Lys 274 菌體數(shù)和芽孢數(shù)的影響

2.3 培養(yǎng)基碳源、氮源優(yōu)化 由圖3 可知，確定最適碳氮源質(zhì)量百分比為1% ：2%，選擇玉米淀粉、葡萄糖、乳糖為培養(yǎng)基的混合碳源；選擇酵母膏、牛肉膏、蛋白胨（具有加快菌株生長速率效果）為培養(yǎng)基的復合氮源。

圖3 碳源、氮源單因素對凝結(jié)芽孢桿菌Lys 274 菌體數(shù)和芽孢數(shù)的影響

將11 因素2 水平[L12（211）] 正交試驗進行變形設(shè)計混合正交試驗表[L12（22×44）] 設(shè)計培養(yǎng)基，具體試驗設(shè)計和試驗結(jié)果見表1。綜合分析，選擇最優(yōu)方案：A1D2E3C3B2F2進行驗證，得到4.2×109CFU/mL 的生物量和4.7×108CFU/mL的芽孢數(shù)，芽孢率11.19%。

表1 混合正交試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

2.4 金屬離子對菌體數(shù)和芽孢數(shù)的影響 由圖4 可知，選擇MnSO4、FeCl2、KH2PO4進行[L9（34）] 正交試驗設(shè)計培養(yǎng)基，試驗設(shè)計和試驗結(jié)果見表2。綜合考慮選擇芽孢數(shù)的最優(yōu)方案為B2A3C3作為最終優(yōu)化，經(jīng)試驗驗證最終得到5.60×109CFU/mL 的生物量和4.47×109CFU/mL 的芽孢數(shù)，芽孢率達79.21%。

表2 金屬離子正交試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

圖4 金屬離子對凝結(jié)芽孢桿菌Lys 274 菌體數(shù)和芽孢數(shù)的影響

3 結(jié)論

本試驗通過三步法依次確定凝結(jié)芽孢桿菌Lys 274 最適的生長條件，碳氮源組成及比例和金屬離子的種類及數(shù)量，階段性提高Lys 274 的生物量和芽孢數(shù)。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：玉米淀粉10 g/L、葡萄糖2 g/L、乳糖5 g/L、酵母膏20 g/L、蛋白胨15 g/L、牛肉膏5 g/L、磷酸二氫鉀4 g/L，硫酸錳0.2 g/L、氯化亞鐵0.4 g/L，培養(yǎng)條件為：裝液量50 mL、pH 6.0、八層紗布封口、37℃培養(yǎng)44 h。搖瓶發(fā)酵可得到5.60×109CFU/mL的生物量和4.47×109CFU/mL 的芽孢數(shù)，芽孢率達79.21%，對比初始條件培養(yǎng)的凝結(jié)芽孢桿菌，生物量提高20.74 倍，芽孢數(shù)提高72.68 倍。