黃秋凌 雷 婷 何子昕 寧 娜 陳新陽 林瑞珍 黨 蕾△

1廣州白云山中一藥業(yè)有限公司時尚中藥研究院,廣州 510530

2廣東省中醫(yī)院藥學部,廣州 510120

消渴丸是由葛根、地黃、黃芪、天花粉、玉米須、南五味子、山藥等7味中藥和格列本脲組成的中西藥復合制劑,具有滋腎養(yǎng)陰、益氣生津之功效。消渴丸中所含地黃、黃芪、玉米須和葛根富含多糖成分,經(jīng)現(xiàn)代藥理學研究證明其具有調(diào)控血糖的作用[1-2]。但目前對消渴丸中多糖的研究或含量測定尚無報告,因此本研究對消渴丸中多糖含量的測定條件進行探究。本研究主要利用多糖含量測定中最常用的苯酚-硫酸法[3-4],對消渴丸中多糖含量的測定條件進行優(yōu)化,并對該方法的精密度、重復性、加樣回收率等進行研究,以期建立快速、準確的消渴丸中多糖含量的測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要實驗儀器:Cary100 UV-VIS紫外分光光度計(安捷倫科技中國有限公司);TG16-WS臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(密理博中國有限公司);ZKF030電熱真空干燥箱(廣州滬瑞明儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司);Sartorius BS 224 S型十萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司);METTLER TOLEDO XP26百萬分之一電子天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司)。

消渴丸粉末由廣州白云山中一藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供,生產(chǎn)批號:XS0001、XS0002、XS0003、X01051、X01052、X01053;D-無水葡萄糖購自于中國食品藥品檢定研究院,批號:110833-201707;無水乙醇、濃硫酸、苯酚等均為分析純;蒸餾水由實驗室自制。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 取烘干至恒重的D-無水葡萄糖標準品5 mg,精密稱定,置于50 mL容量瓶中,加蒸餾水溶解并稀釋到刻度,搖勻即得每毫升含葡萄糖0.1 mg的對照品。

1.2.2 樣品前處理 稱取消渴丸粉末和量取無水乙醇以1∶40(g:mL)的料液比,在90℃水浴中加熱回流提取1 h,靜置15 min,以4500 rpm離心10 min,過濾,將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,殘渣中加入30 mL蒸餾水后充分搖勻,隨后置于90 ℃水浴中加熱回流1 h,再以4500 rpm離心10 min,過濾;合并上清液,加蒸餾水定容至刻度,搖勻。精密量取上述溶液2 mL于離心管中,向離心管中加入18 mL無水乙醇,充分混勻,于4 ℃靜置1 h,以4500 rpm離心15 min,棄上清液;再向離心管中加入10 mL 95%乙醇溶液,充分混勻,以4500 rpm離心15 min,棄上清液,沉淀中加入熱水10 mL溶解,并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,定容至刻度,搖勻,作為供試品溶液。

1.2.3 標準曲線制作 精密吸取1.2.1中制備的標準溶液0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL置于25 mL具塞玻璃試管中,分別加蒸餾水補至2.0 mL,加入1.0 mL 5%苯酚溶液及5.0 mL濃硫酸溶液,混勻,置于80 ℃水浴中加熱15 min,取出,放置冷卻至室溫。以水為參照,于490 nm波長處測定吸光度值,平行測定3次。以葡萄糖濃度(C)為橫坐標,吸光度值(A)為縱坐標,繪制標準曲線,得出回歸方程和計算相關(guān)系數(shù)(R2)。

1.2.4 測定方法 精密吸取供試品溶液1.0 mL于具塞玻璃試管中,加水補至2.0 mL后,按照標準曲線的制備方法及測定條件,測定供試品的吸光度值。

1.2.5 精密度實驗 取X01053批次的消渴丸粉末1.0 g,共6份,精密稱定,按1.2.2制備及1.2.4測定方法測定吸光度值。根據(jù)1.2.3中標準曲線的回歸方程計算出供試品中的多糖濃度(C)和其相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.6 重復性實驗 取6批次(XS0001、XS0002、XS0003、X01051、X01052、X01053)的消渴丸粉末各1.0 g,精密稱定,按1.2.2制備及1.2.4測定方法測定吸光度值,平行測定3次,根據(jù)1.2.3中標準曲線的回歸方程計算出供試品中的多糖濃度(C)和其RSD。

1.2.7 加樣回收率實驗 取X01053批次的消渴丸粉末1.0 g,共6份,精密稱定,按1.2.2制備及1.2.4測定方法測定吸光度值,平行測定3次,根據(jù)1.2.3中標準曲線的回歸方程計算出供試品中的多糖濃度(C),并計算其所含多糖質(zhì)量。另取6份上述已制備的消渴丸多糖供試樣品液1.0 mL,分別加入濃度為1000 mg/mL的葡萄糖溶液2.4 mL,平行測定3次,按1.2.4測定方法測定吸光度值,根據(jù)1.2.3中標準曲線的回歸方程計算出供試品中的多糖濃度(C)后,計算加樣回收率和其RSD。加樣回收率=[(測得混合后供試樣品液所含多糖質(zhì)量-測得供試樣品液所含多糖質(zhì)量)/加入葡萄糖質(zhì)量]×100%。

2 結(jié)果

2.1 最大吸收波長檢測結(jié)果

根據(jù)實驗方法,在紫外-可見分光光度計上200 nm～800 nm范圍內(nèi)掃描吸收曲線,測得消渴丸多糖溶液的最大吸收波長在490 nm。

2.2 標準曲線制備及線性考察

以葡萄糖濃度(C)為橫坐標,吸光度值(A)為縱坐標,繪制標準曲線。測定相關(guān)數(shù)據(jù)見表1,繪制圖見圖1。標準曲線:A=15.443C-0.0042,R2=0.9999。葡萄糖濃度在0～0.0510 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表1 標準曲線建立相關(guān)數(shù)據(jù)

圖1 標準溶液曲線圖

2.3 精密度考察結(jié)果

計算測得濃度的精密度實驗RSD值為0.90%,見表2。

表2 精密度實驗結(jié)果

2.4 重復性考察結(jié)果

計算測得濃度的重復性實驗RSD值為1.38%,見表3。

表3 重復性實驗結(jié)果

2.5 加樣回收考察結(jié)果

經(jīng)測定,該方法的平均加樣回收率為98.77%,RSD值為3.25%。見表4。

表4 X01053批次的加樣回收率實驗結(jié)果

3 討論

消渴丸由古代經(jīng)典名方“消渴方”和“玉泉散”化裁而來,用地黃、山藥、五味子以滋養(yǎng)肺陰、胃陰、腎陰,山藥、五味子配黃芪以補益肺氣、胃氣,又有固腎攝精之功,地黃配天花粉、玉米須、葛根以清肺熱、胃熱而生津[5]。經(jīng)現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn),組方中多種藥物具有調(diào)控血糖的作用[1-2]。消渴丸作為中西藥復合制劑,其中的格列本脲能更好地提高組方中中藥部分的降糖效果,實現(xiàn)中西藥合理配伍[6-7]。

前期的研究主要關(guān)注消渴丸中的小分子化合物在協(xié)同降糖中的作用和機制[8],并針對消渴丸中多個小分子化合物構(gòu)建了定量測定方法[9-10]。目前,多糖作為天然降糖物質(zhì)受到專家學者的重點關(guān)注[11-12],消渴丸中所含藥材如地黃、黃芪、玉米須和葛根中的多糖成分,已被證實具有良好的調(diào)控血糖作用,然而尚缺乏對消渴丸中多糖成分的含量測定研究。

本研究通過苯酚-硫酸比色法測定消渴丸中多糖含量,選擇最大的吸收波長,建立吸光度值-葡萄糖濃度的線性回歸方程,并進行精密度實驗、重復性實驗和加樣回收實驗。結(jié)果顯示,最大吸收波長為490 nm,吸光度值-葡萄糖濃度的線性回歸方程:A=15.443C-0.0042,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9999,線性范圍為0～0.0510 mg/mL。精密度實驗平均吸光度值為0.3656,RSD為0.90%,表明儀器精密性良好,檢測結(jié)果的隨機誤差較小;重復性實驗平均吸光度值為0.3796,RSD為1.38%,表明該方法重復性穩(wěn)定,檢測結(jié)果的隨機誤差較小;平均加樣回收率98.77%,RSD為3.25%。

綜上,通過精密度實驗、重復性實驗、加樣回收率實驗,表明采用苯酚-硫酸法測得的消渴丸中多糖含量準確度高、精密度良好、重復性穩(wěn)定、加樣回收率高,適用于消渴丸中多糖含量的測定。