劉劼 陳偉 楊秋琳 穆根 高昊 申滔 楊思華 張振輝?

1)(華南師范大學(xué)信息光電子科技學(xué)院,廣州 510006)

2)(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院,激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510631)

生命體是一個(gè)高度有序化的結(jié)合體,細(xì)胞和組織的基本生物過程本質(zhì)上受生物分子構(gòu)象和排列的控制,其中生物分子的排列有序度、取向、螺旋和折疊等特征與生物組織的生理功能密切相關(guān).偏振成像可以獲取生命體或材料的微觀排列結(jié)構(gòu),取向和手性等構(gòu)象信息,在材料學(xué)檢測,生物影像領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,但其成像深度和解析偏振信息等方面存在困難.光聲成像以電磁波為激發(fā)源,以超聲為載體傳遞信息,成為一種結(jié)合光學(xué)高對比度和超聲深穿透性的無損成像方式,利用擴(kuò)散光子激發(fā)目標(biāo)并檢測由此產(chǎn)生的聲響應(yīng)可以打破光學(xué)擴(kuò)散極限的限制.近年來一種偏振光聲成像技術(shù)作為偏振光學(xué)成像的補(bǔ)充,在保證成像深度的同時(shí)可以獲取介質(zhì)的三維偏振信息,為組織的偏振測量提供了一種有效而直接的策略,預(yù)示著在生物成像和材料檢測兩方面的巨大潛力.本文總結(jié)了偏振光聲成像技術(shù)的發(fā)展,首先闡明了偏振光聲成像的物理原理和技術(shù)方法,隨后從生物組織成像和納米材料檢測兩個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域展開介紹了偏振光聲顯微成像、偏振光聲計(jì)算層析成像和偏振光聲納米材料分子成像的相關(guān)研究進(jìn)展,并且簡要論述了偏振光在組織中傳播時(shí)因顆粒尺寸、密度、排列等因素產(chǎn)生的退偏情況,最后展望了偏振光聲成像的應(yīng)用前景.

1 引言

生物醫(yī)學(xué)影像領(lǐng)域起始于1895 年德國物理學(xué)家威廉·倫琴發(fā)現(xiàn)X 射線[1],此后的一個(gè)世紀(jì)里得到了迅速的發(fā)展.在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)中,影像技術(shù)為科學(xué)家提供了可視化的手段用以揭示生物體內(nèi)部的復(fù)雜結(jié)構(gòu)以及動(dòng)態(tài)的生理過程,在臨床上影像技術(shù)進(jìn)一步輔助了醫(yī)生對病灶區(qū)域的醫(yī)療診斷,在基礎(chǔ)研究上,生物醫(yī)學(xué)影像為我們提供了用于探究生物體微觀層面生理機(jī)制的有利手段.影像技術(shù)主要分為臨床類及基礎(chǔ)研究類型,前者主要包括磁共振成像[2]、X 射線計(jì)算機(jī)層析成像[3]、超聲成像[4]、光學(xué)相干層析成像[5]和基于光學(xué)方法的內(nèi)窺鏡檢查等,后者則主要囊括共聚焦、多光子、偏振光、超分辨熒光顯微鏡[6,7]、電子顯微鏡、質(zhì)譜成像、熒光層析成像、生物發(fā)光、光聲成像等多種光學(xué)顯微鏡成像技術(shù)[8-10].

生物體是由生物分子有序組裝而成的復(fù)雜系統(tǒng),其分子取向、排列、螺旋和折疊等特征決定了生物組織的功能和性能.例如,大腦中的不同區(qū)域具有不同的構(gòu)象,與其神經(jīng)活動(dòng)密切相關(guān)[11];皮膚和心肌中的膠原纖維具有一定的方向性,與其力學(xué)特性密切相關(guān)[12];細(xì)胞分裂時(shí)微管、DNA 等分子的有序排列和組合,與其遺傳信息表達(dá)與傳遞密切相關(guān).生物體結(jié)構(gòu)的有序性是生命現(xiàn)象的基礎(chǔ),一旦發(fā)生異常,往往導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生.例如,腫瘤細(xì)胞基質(zhì)中膠原纖維的含量和有序性與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)[13];神經(jīng)退行性疾病和動(dòng)脈粥樣硬化中出現(xiàn)的淀粉樣斑塊,其分子具有明顯的各向異性特征[14,15];此外,肝纖維化、心肌壞死等疾病都伴隨著組織結(jié)構(gòu)各向異性的改變[16].因此,監(jiān)測生物體結(jié)構(gòu)有序性的動(dòng)態(tài)變化對于揭示生物發(fā)育規(guī)律和實(shí)現(xiàn)疾病早期診斷具有重要意義.

光是一種電磁波,其具有4 個(gè)基本的特性:強(qiáng)度、波長、相位和偏振.偏振是光的矢量特性,它反映了光的振動(dòng)方向,用于研究揭示介質(zhì)中的矢量信息.偏振光學(xué)成像技術(shù)是一種利用偏振光與介質(zhì)相互作用來探測介質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)特征的方法.這種方法可以利用入射偏振光與介質(zhì)中亞波長尺度的各向異性結(jié)構(gòu)(如散射粒子)產(chǎn)生的退極化效應(yīng),來獲取介質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)信息.然而,在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中,偏振光學(xué)成像技術(shù)還面臨著很多挑戰(zhàn),因?yàn)楣庠谏锝M織傳播存在較強(qiáng)的散射[17],這會(huì)導(dǎo)致信號的衰減和退極化,限制了成像深度和分辨率,增加了數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜度.例如:偏光顯微鏡和偏振相干拉曼散射成像只能對薄切片或透明培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行成像[18];穆勒矩陣成像技術(shù)雖然可以快速獲取塊狀樣品表面或內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息,但它是將一定厚度的樣品視為一個(gè)二維傳輸矩陣,在深度方向上不能區(qū)分不同層次的結(jié)構(gòu)特征;偏振熒光成像雖然可以利用熒光標(biāo)記物來增強(qiáng)信號和選擇性,但是熒光標(biāo)記物靶向分子存在非剛性和不均勻性,并且還可能對生物分子產(chǎn)生毒性或干擾作用[19].因此,需要發(fā)展新的成像技術(shù),能夠以清晰、靈敏、可量化的參數(shù)來描述深層介質(zhì)中微觀結(jié)構(gòu)的各向異性特征,實(shí)現(xiàn)在體三維、高對比度、多信息成像生物組織.

光聲成像技術(shù)(PA)是一種利用光致超聲現(xiàn)象進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)成像的方法,其發(fā)展始于1880 年Alexander Graham Bell 的光聲效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)[20].20世紀(jì)末,光聲成像技術(shù)隨著激光器和高靈敏度的聲學(xué)傳感器的出現(xiàn)而得到快速的推進(jìn),其在生物醫(yī)學(xué)影像領(lǐng)域表現(xiàn)出了巨大的潛力.光聲成像技術(shù)的原理是,當(dāng)組織受到電磁波的輻射時(shí),基態(tài)的電子會(huì)躍遷到激發(fā)態(tài),然后通過非輻射躍遷的方式釋放熱量導(dǎo)致組織溫度升高,使組織發(fā)生熱彈性膨脹效應(yīng)產(chǎn)生壓力波,其在2—3 個(gè)波長范圍內(nèi)會(huì)衰減消失[21],但同時(shí)伴隨產(chǎn)生的超聲波會(huì)傳播到組織表面被探測器捕獲,最后通過算法重建反演出組織內(nèi)部的吸收或彈性信息.光聲成像技術(shù)將光轉(zhuǎn)化為光聲信號(即聲波)在成像深度上有所突破.聲波是一種機(jī)械波,其在生物組織的散射程度遠(yuǎn)低于相同傳播距離下光的散射程度(2—3 個(gè)數(shù)量級),同時(shí)聲波在生物組織中的傳播速度遠(yuǎn)小于電磁波[22],因此光聲成像技術(shù)與傳統(tǒng)光學(xué)成像相比具有更深的檢測深度和三維體成像能力,與傳統(tǒng)聲學(xué)成像技術(shù)如超聲成像相比,具有高分辨率高對比度的優(yōu)勢[23-25].在臨床醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)影像領(lǐng)域上填補(bǔ)了“超聲看不清,光學(xué)看不深”的臨床檢測空白.近年來,光聲成像技術(shù)迅速發(fā)展,根據(jù)成像方式的不同可以分為光聲計(jì)算層析成像[26]、光聲顯微成像和光聲內(nèi)窺成像[27-29];根據(jù)檢測參數(shù)的不同可以分為光聲吸收成像[24,29,30],光聲血氧、血流、氧代謝成像[31,32],光聲彈性成像[33,34],光聲非線性參數(shù)成像[21,35](如圖1 所示).

圖1 光聲成像技術(shù)概述[24,26-28,34,36-38]Fig.1.Schematic diagram of the photoacoustic imaging[24,26-28,34,36-38].

之上的光聲成像技術(shù)通常將生物組織的吸收系數(shù)視為各向同性,即視為標(biāo)量,丟失了各向異性生物分子與偏振光相互作用的特征信息.基于分子對光的矢量吸收,一種偏振光聲成像近幾年被提出并快速發(fā)展,其繼承了光聲成像的三維深層成像能力和偏振光學(xué)相應(yīng)的各向異性組分分析能力,可以對組織深層偏振信息進(jìn)行提取并無標(biāo)記表征其相關(guān)分子構(gòu)象的特征.本文將從偏振光聲成像的原理,技術(shù)發(fā)展兩個(gè)方面闡述該技術(shù)的發(fā)展歷程.

2 偏振光聲成像原理

當(dāng)入射光照射分子或發(fā)色團(tuán)時(shí),從基態(tài)|φa〉到激發(fā)態(tài)|φb〉的量子躍遷過程是電磁波與分子的電、磁偶極躍遷矩之間的共振耦合.分子的空間固定躍遷偶極矩(TDMs)是電躍遷偶極矩(ETDM)Uab和磁躍遷偶極矩(MTDM)Mabφb〉的組合,這里的和分別為電偶極子和磁偶極子.電子的躍遷概率一方面取決于電磁波的頻率是否等于躍遷偶極矩的振蕩頻率,另一方面取決于躍遷偶極矩與電矢量E、磁矢量B之間的夾角.引入分子與電磁波電場E和磁場B之間相互作用的哈密頓算符·B,并合理地忽略高階相互作用項(xiàng),根據(jù)量子力學(xué)中的費(fèi)米黃金法則,發(fā)色團(tuán)的光吸收強(qiáng)度可以表達(dá)為[39]

其中,E和B分別為電場強(qiáng)度和磁感應(yīng)強(qiáng)度,分別是沿E和B方向的單位向量,E·,B·,γ 是特定的分子常數(shù).非螺旋結(jié)構(gòu)的分子或無手性的發(fā)色團(tuán)在線性偏振光照射下其磁偶極矩與電磁波的相互作用可以忽略,此時(shí)發(fā)色團(tuán)的光吸收主要由電躍遷偶極矩貢獻(xiàn).在這種情況下,等式(1)右側(cè)的第2 項(xiàng)、第3 項(xiàng)和第4 項(xiàng)可以忽略.如圖2(a)所示,展現(xiàn)了單個(gè)分子的矢量吸收模型,其中單個(gè)分子(或單個(gè)生色團(tuán))的躍遷電偶極矩U具有特定的方向,當(dāng)發(fā)色團(tuán)與線偏振光相互作用時(shí),光吸收概率與電矢量和躍遷偶極矩之間的夾角θ相關(guān):

圖2 分子矢量吸收原理示意(a) 單個(gè)發(fā)色團(tuán)各向異性吸收示意圖,E,U 和M 分別為入射光的電矢量,發(fā)色團(tuán)的電躍遷偶極矩(ETDM)和磁躍遷偶極矩(MTDM),θ 為E 與U 之間的夾角,Δθn 為單分子躍遷偶極矩取向的擺動(dòng)范圍;(b),(c) 分別表示線偏振光和圓偏振光激發(fā)各向異性分子的電子能級躍遷示意圖Fig.2.Schematic of molecular vector absorption principle:(a) Schematic diagram of anisotropic absorption of a single chromophore,E, U and M are the electric vector of incident light,the electric transition dipole moment(ETDM) and the magnetic transition dipole moment(MTDM) of the chromophore,respectively,and θ is the angle between E and U,Δθn is the swing range of the single molecule transition dipole moment orientation;(b),(c) schematic diagrams of electronic energy level transitions of anisotropic molecules excited by linearly polarized light and circularly polarized light,respectively.

等式(2)表明吸收概率與角度θ之間滿足余弦平方的函數(shù)關(guān)系,當(dāng)入射光的電矢量方向與電躍遷偶極矩方向一致時(shí),電子吸收光子發(fā)生躍遷的概率最大[40],如圖2(b)所示.而對于光的電矢量方向垂直于電躍遷偶極矩方向時(shí),則情況相反,此時(shí)吸收概率最小.電子吸收概率受到角度θ的調(diào)制,并且單分子躍遷偶極矩取向的擺動(dòng)角 Δθn越小調(diào)制程度越大,即分子結(jié)構(gòu)的各向異性越明顯,Δθn等于180°,代表此分子對光的吸收特征為各向同性.另一方面,具有手性的光學(xué)活性分子或發(fā)色團(tuán)與圓偏振光相互作用時(shí),電磁感應(yīng)電荷同時(shí)產(chǎn)生線性電荷位移和電荷旋轉(zhuǎn),即一個(gè)光學(xué)活性躍遷實(shí)際上將有一個(gè)允許的電躍遷偶極矩(即線性電荷位移)和一個(gè)允許的磁躍遷偶極矩(電荷旋轉(zhuǎn)).分子的圓二向色性與所謂的旋轉(zhuǎn)強(qiáng)度有關(guān)[41],旋轉(zhuǎn)強(qiáng)度R0是電躍遷偶極矩和磁躍遷偶極矩點(diǎn)乘的虛數(shù)部分.

式中,ηth,Γ和I0分別表示光熱轉(zhuǎn)換效率、Grüneisen 參數(shù)和局部光通量.μα(|φa〉→|φb〉) 表示吸收系數(shù),它滿足如下公式:

通過考慮線偏振光與單軸分子的相互作用,μα(|φa〉→|φb〉)可以表示為

進(jìn)一步分析在激發(fā)光照射范圍內(nèi)存在多個(gè)分子吸收體的情況,如圖3 所示,這時(shí)躍遷電偶極矩是多個(gè)分子躍遷電偶極矩Un的矢量和,即,躍遷電偶極矩的分布具有一個(gè)彌散角Δθ.當(dāng)激光照射范圍內(nèi)分子取向一致的情況下Δθ越小,表現(xiàn)出更強(qiáng)的各向異性吸收特性,當(dāng)分子取向有序度越差時(shí)Δθ越大,則各向異性吸收特性越弱.為了研究激發(fā)區(qū)域內(nèi)多個(gè)分子的線二向色性,分別定義了平行躍遷偶極矩矢量i和垂直躍遷偶極矩矢量j.Un表示單個(gè)分子的躍遷偶極矩,所以平行和垂直方向的平均躍遷偶極矩可以表示為[42]

圖3 光激發(fā)范圍內(nèi)多個(gè)躍遷電偶極矩分布示意圖,Δθ 代表平均躍遷電偶極矩彌散角度,Δθ 越大代表多分子排列有序度越小[42]Fig.3.The schematic diagram of the distribution of multiple transition electric dipole moments in the photoexcitation range,where Δθ represents the average diffusion angle of the transition electric dipole moment,and the larger Δθ represents the smaller order of the multiple molecules[42].

其中,使用μ//,μ⊥分別表示平行躍遷偶極矩方向和垂直躍遷偶極矩方向上的光吸收系數(shù),因此,μ//,μ⊥可以分別表示為

則(4)式可以表示為[43,44]

3 偏振光聲成像技術(shù)的發(fā)展與分類

偏振光聲成像技術(shù)2012 年首次被提出后沉寂了一段時(shí)間[45],直到2018 年Lihong V.Wang 團(tuán)隊(duì)和華南師范大學(xué)邢達(dá)/楊思華團(tuán)隊(duì)[43,44]針對偏振光聲的采集方式和提取參數(shù)進(jìn)行了開拓式的研究,分別提出了偏振光聲計(jì)算層析成像和定量式偏振光聲顯微成像技術(shù),之后的幾年該技術(shù)得到了光聲成像領(lǐng)域的重視,相繼有香港城市大學(xué)王立代團(tuán)隊(duì)和香港理工大學(xué)賴溥祥團(tuán)隊(duì)[46]合作,于2019 年提出了一種光纖延時(shí)的偏振光聲成像系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了單次掃描即可重建偏振光聲圖像;2021年,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院劉成波團(tuán)隊(duì)[47,48]發(fā)展了一種手持偏振光聲探測成像方法,演示了大視野量化各向異性生物組織結(jié)構(gòu);2021年,華盛頓大學(xué)的Song Hu 團(tuán)隊(duì)[49]發(fā)表了利用剛果紅染色實(shí)現(xiàn)了偏振光聲技術(shù)可視化腦中淀粉樣蛋白的研究;2022年,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院楊軍團(tuán)隊(duì)[50]報(bào)道了偏振光聲成像三維定量化分子排列各向異性度結(jié)果,同年華南師范大學(xué)楊思華/邢達(dá)團(tuán)隊(duì)提出了光聲穆勒矩陣成像技術(shù)[39],建立了單分子矢量吸收模型,實(shí)現(xiàn)了同時(shí)量化各向異性度、分子取向和分子手性的能力;此外,蘇州大學(xué)的劉莊團(tuán)隊(duì)[51]也開展了關(guān)于無背景磁控偏振光聲分子成像的相關(guān)研究.2023年,華南師范大學(xué)張振輝/石玉嬌團(tuán)隊(duì)[42]再次演示了偏振光聲成像定量識別膠原纖維各向異性度用于精準(zhǔn)評估皮膚燒傷程度的工作,同時(shí)提出了角分辨偏振光聲顯微鏡,用于二維材料晶軸取向的識別[52];韓國Chulhong Kim 團(tuán)隊(duì)[53]針對偏振光聲成像準(zhǔn)確提取分子取向進(jìn)行了詳細(xì)的研究,理論得出最少需要3 束偏振態(tài)不同的激發(fā)光重建出分子的取向,實(shí)際成像中4—6 束偏振態(tài)不同的激發(fā)光能更準(zhǔn)確反演分子取向;偏振光聲成像技術(shù)的進(jìn)展的歷程如圖4 所示.

圖4 國內(nèi)外偏振光聲成像技術(shù)的發(fā)展Fig.4.Development of polarized photoacoustic imaging technology at home and abroad.

偏振光聲成像能特異性地檢測生物分子或材料的構(gòu)象、排列信息,使其在生物組織成像和納米材料檢測兩個(gè)領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力,本文將從生物成像和納米材料檢測兩個(gè)方面介紹偏振光聲技術(shù)的最新發(fā)展.

3.1 偏振光聲技術(shù)-各向異性生物組織成像

3.1.1 偏振光聲顯微成像

2012年,Lihong V.Wang 團(tuán)隊(duì)[45]首次提出了一種基于偏振光聲技術(shù)的線二向色性光聲顯微鏡系統(tǒng),在其實(shí)驗(yàn)光路的搭建中,利用半波片(HWP)以及偏振分束器(PBS)實(shí)現(xiàn)了兩束正交偏振光的生成,兩束激光經(jīng)光電調(diào)制器(EOM)的調(diào)制后實(shí)現(xiàn)了兩束激光的能量和延時(shí)調(diào)控,對阿爾茲海默癥小鼠腦組織切片進(jìn)行了成像.基于淀粉樣蛋白的線二向色性特征并結(jié)合剛果紅對淀粉樣蛋白進(jìn)行特異性標(biāo)記,以532 nm 的脈沖激發(fā)光進(jìn)行偏振光聲成像,驗(yàn)證了偏振光聲成像能高對比提取矢量吸收物質(zhì)的線二向色性特征,結(jié)果如圖5(a)—(g)所示.在該工作中,作者使用兩束電矢量相互垂直的線偏振光激發(fā)樣品,分別得到水平偏振激發(fā)產(chǎn)生的光聲信號P1和垂直偏振激發(fā)產(chǎn)生的光聲信號P2,定義線二向色性:

圖5 線二向色性光學(xué)分辨率光聲顯微鏡及實(shí)驗(yàn)結(jié)果[45,49](a) 線二向色性光學(xué)分辨率光聲顯微鏡(DOR-PAM)系統(tǒng)原理圖;(b) 腦切片的光學(xué)顯微鏡照片,用剛果紅(CR)和中性紅(NR)雙染色APP/PS1 小鼠腦切片;(c) 圖(b)中藍(lán)色區(qū)域的放大圖和箭頭分別表示CR 染色的淀粉樣斑塊和NR 染色的背景細(xì)胞;(d),(e) 在兩種正交偏振光照射下獲得的DOR-PAM 圖像;(f),(g) 分別為圖(d)和圖(e)的總和差值,圖(g) 中的差異檢測消除了非二向色背景,并突出了淀粉樣斑塊的線二向色性對比;(h) 二向色性-血氧血流多參數(shù)雙對比PAM 原理圖,框形插圖給出了為同時(shí)二向色性和多參數(shù)PAM 成像設(shè)計(jì)的激光激勵(lì)方案,其中AOM 為聲光調(diào)制器,FC 為光纖耦合器,PM-SMF 為保偏單模光纖,BPF 為帶通濾波器,DM 為二向鏡,EOM 為電光調(diào)制器,OL 為物鏡,CL 為矯正鏡,UT 為超聲波換能器,WT 為水箱,DAQ 為數(shù)據(jù)采集,水平/垂直極化;(i)—(k) 10 月齡的小鼠活體腦多參數(shù)PAM 圖像,包括活體鼠腦血紅蛋白的總濃度(CHb)、血紅蛋白氧飽和度(sO2)和血流成像;(l) 二向色性PAM 圖像顯示剛果紅(CRD)染色的淀粉樣斑塊和血管壁沉積物的分布;(m) 圖(l)中矩形框區(qū)域放大圖;(n) 圖(l)中矩形框區(qū)域共聚焦圖像,比例尺為200 μmFig.5.The DOR-PAM system and experimental results[45,49]:(a) Schematic of the DOR-PAM system;(b) optical microscopic photo of the brain section;(c) close-up of the boxed area in Fig.(b),the blue and black arrows indicate the CR-stained amyloid plaque and the NR-stained background cells,respectively;(d),(e) the DOR-PAM images acquired with each of the two orthogonally polarized optical irradiations,respectively;(f),(g) the summation and subtraction of Fig.(d) and Fig.(e),respectively,the differential detection in Fig.(f) eliminates the non-dichroic background and highlights the dichroic contrast of the amyloid plaque;(h) schematic of dual-contrast PAM,the boxed inset illustrates the laser excitation scheme designed for simultaneous dichroism and multi-parametric PAM,where AOM is the acousto-optic modulator;FC is the fiber coupler,PM-SMF is the polarization-maintaining single-mode optical fiber,BPF is the bandpass filter,DM is the dichroic mirror,EOM is the electro-optic modulator,OL is the objective lens,CL isthe correction lens;UTis the ultrasonic transducer,WTisthe water tank,DAQ isthedataacquisition,H/Vpol,horizontal/vertical polarization;(i)-(k) multi-parametric PAMimagesof a 10-month-old APP/PS1mousebrain in vivo,including the CHb,sO2,and blood flow speed;(l) dichroism PAM image showing the distribution of CR stained amyloid plaques and deposits in the vessel wall;(m) close-up of the boxed area in Fig.(l);(n) confocal image of the boxed area in Fig.(l).Scale bars:200 μm.

2021年,華盛頓大學(xué)Song Hu 團(tuán)隊(duì)[49]沿用上述偏振顯微方法并結(jié)合光聲血紅蛋白濃度、血氧飽和度、血流成像技術(shù)針對剛果紅染色后的小鼠腦進(jìn)行了多參數(shù)成像,結(jié)果如圖5(h)—(n)所示,該工作推動(dòng)了偏振光聲顯微成像對活體樣品的研究.但上述兩個(gè)工作,其激發(fā)光只有2 束電矢量正交的線偏振光,不足以量化目標(biāo)樣品的線二向色性.基于此,2018 年華南師范大學(xué)楊思華/邢達(dá)團(tuán)隊(duì)[43]提出了一種斯托克斯矢量表示方式的偏振光聲顯微鏡(PPAM).其原理與實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示,該工作中作者利用4 束電矢量相差45°的線偏振光定量化樣本結(jié)構(gòu)排列的各向異性度(線二向色性).其借用光學(xué)中用斯托克斯矢量描述激光偏振態(tài)的表示方式:

圖6 定量式偏振光聲顯微鏡的原理裝置和實(shí)驗(yàn)結(jié)果[43](a) 分子矢量吸收原理示意;(b) DOA 值與偏振光聲信號調(diào)制強(qiáng)度的關(guān)聯(lián);(c) PPAM 裝置圖;(d) PPAM 三維成像螳螂蝦復(fù)眼的各向異性特征Fig.6.Theoretical setup and experimental results of a quantitative polarized photoacoustic microscopy(PPAM)[43]:(a) Schematic diagram of molecular vector absorption principle;(b) the correlation between the DOA value and the modulation intensity of polarized photoacoustic signals;(c) PPAM device diagram;(d) the anisotropic characteristics of the compound eyes of praying mantis and shrimp in PPAM three-dimensional imaging.

其中IH和IV分別表示為水平線偏振態(tài)以及垂直方向的線偏振光分量,IP和IM分別表示為45°以及-45°下的線偏振光分量,IR和IL分別表示右旋以及左旋圓偏振光分量.描述光的線偏振度的參數(shù)可以定義為

由于光聲信號(即超聲波)的線偏振度的描述方式與(1)式和(2)式具有相似性,因此生物分子的各向異性度可以被描述為

實(shí)驗(yàn)層面,該工作通過對兩種各向異性度不同的樣品聚氯乙烯(PVA)以及聚乙烯醇(PVC)在二維平面下的DOA 成像,證實(shí)了DOA 參數(shù)量化樣品分子排列各向異性度的能力,實(shí)驗(yàn)中直觀地對兩種材料的各向異性度DOA 進(jìn)行量化展示.除了在二維平面下的各向異性度檢測,作者在三維空間下基于PPAM 對蝦姑復(fù)眼各向異性進(jìn)行檢測.實(shí)驗(yàn)中展示了PPAM 對蝦姑復(fù)眼的三維空間下的偏振光聲成像圖,其中在深度0.4—1.0 mm 處的R1-7細(xì)胞DOA 較高,此外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分別在460,520以及580 μm 的深度下對R1-7 的各向異性度進(jìn)行了量化的檢測.結(jié)果在3 種不同深度下的R1-7 細(xì)胞所展示的DOA 存在差異,這一結(jié)果在過去非定量檢測的偏振光聲顯微鏡中是難以實(shí)現(xiàn)的.相比傳統(tǒng)光學(xué)偏振顯微鏡,定量檢測的偏振光聲顯微鏡提高了活體成像的深度.相比非定量檢測的偏振光聲顯微鏡技術(shù),其對各向異性度的量化能夠提供更多的生物組織信息,同時(shí)使各類生物組織各向異性特征得到更精確的表征.

基于上述工作原理,科研工作者們又相繼提出了更精確的各向異性提取方法,分子取向重建原理并完善發(fā)展了偏振掃描系統(tǒng).Wang 等[50]提出了一種高次諧波的光聲信號檢測的偏振光聲顯微成像技術(shù),偏振光聲顯微鏡,使用高次諧波方法能夠在二維和三維空間下同時(shí)適用,克服了上述定量式偏振光聲無法在三維成像中量化各向異性和檢測光軸的取向.該工作中分析了激光穿過多層各向異性物質(zhì)的情況,既定1/2 波片的旋轉(zhuǎn)頻率為f,則第一層各向異性物質(zhì)產(chǎn)生的光聲信號交流部分(矢量吸收導(dǎo)致的光聲信號)的振蕩頻率等于2f,而由于第一層各向異性吸收的影響使得第二層的激光通量不再保持不變,而是一個(gè)滿足振蕩頻率為2f的參量,所以第二層各向異性吸收導(dǎo)致的光聲信號的震蕩頻率將變?yōu)?f,以此類推于激光穿越到n層各向異性物質(zhì)將會(huì)產(chǎn)生對應(yīng)的頻率為2nf的高頻震蕩信號.因此,頻率2nf的缺失可以用來區(qū)分第n層的各向異性和各向同性物體,另外通過高次諧波的初始相位可以用來檢測n層的光軸,并通過其強(qiáng)度來表征第n層的各向異性.為了驗(yàn)證提出的方法,實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)的雙重聚焦型偏振光聲顯微鏡分別在2D 和3D 各向異性體模上進(jìn)行成像,其結(jié)果如圖7 所示,A,B,C,D,E 是在3 個(gè)各向異性樣品的不同位置上選擇的5 個(gè)代表性像素.A,D,E 分別是從第1 層、第2 層和第3 層各向異性樣品上的非重疊區(qū)域中選擇的.B 和C 分別來自第2 層和第3 層線性偏振器上的重疊區(qū)域.

圖7 高次諧波的偏振光聲信號檢測技術(shù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果[50](a) 線性偏振激光在不同層產(chǎn)生的光聲信號,黃色箭頭表示激光的電矢量方向,白色箭頭表示光軸的方向;(b) 三維各向異性樣品照片;(c) 在非重疊區(qū)域的歸一化光聲振幅;(d) 在重疊區(qū)域的歸一化光聲振幅;(e) 在非重疊區(qū)域的歸一化光聲信號振蕩的頻域分布;(f) 重疊區(qū)域的歸一化光聲信號振蕩的頻域分布Fig.7.High order harmonic polarized photoacoustic signal detection technology and experimental results[50]:(a) Photoacoustic signal generated by the linearly polarized laser at different layers,the yellow arrow indicates the polarization angle of the laser,and the white arrow indicates the orientation of the optical axis;(b) 3D anisotropy phantom;(c) normalized photoacoustic amplitude at the non-overlapping area;(d) normalized photoacoustic amplitude at the overlapping area;(e) spectrum of the normalized photoacoustic amplitude at the non-overlapping area;(f) spectrum of the normalized photoacoustic amplitude at the overlapping area.

在偏振光聲系統(tǒng)和分子取向提取方面,香港城市大學(xué)王立代團(tuán)隊(duì)和香港理工大學(xué)賴溥祥團(tuán)隊(duì)[46]合作提出了一種基于保偏光纖和激光分束的線性偏振光聲顯微鏡成像技術(shù).該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)光路中初始激光經(jīng)過兩個(gè)偏振分束器以及半波片將激光分為三束偏振態(tài)不同的激光,這種由同一束激光分離出的激光具有很高的同步性,能夠有效降低激光的能量波動(dòng),提高成像質(zhì)量.這項(xiàng)技術(shù)通過3 束偏振角分別為0°,45°,90°的激光同時(shí)入射在樣品上產(chǎn)生光聲信號,來提取DOA 參數(shù),簡化了激發(fā)光的數(shù)量,并成功提取了分子排列取向的分布,其實(shí)驗(yàn)裝置和結(jié)果如圖8 所示.分子取向方位角θ:

圖8 光纖延時(shí)單次掃描的偏振光聲技術(shù)[46](a) 光纖延時(shí)線二向色性系統(tǒng)示意圖;(b) 電矢量方向?yàn)?°,45°和90°的三束線偏振光分別激發(fā)得到的光聲圖像;(c),(d) 計(jì)算得到的線二向色性圖像和分子取向圖像Fig.8.Polarized photoacoustic technology for fiber delay single scan[46]:(a) Schematic of the dual-fiber single-shot dichroism ORPAM system;WT,water tank;(b) PA images of three linear polarizers excited with polarized light at 0°,45°,and 90°;(c),(d) calculated dichroism image and polarization angle of the three linear polarizers.

通過(16)式計(jì)算出的分子取向角度范圍為-45°—45°,而不是-90°—90°(或0°—180°),這是由關(guān)于0°中心對稱的數(shù)據(jù)引起的數(shù)據(jù)簡并,這源于光聲信號幅度的標(biāo)量特性,因此,兩個(gè)取向相互垂直的分子不能被區(qū)分.

從單分子躍遷偶極矩物理模型出發(fā)通過斯托克斯矢量的表示方法,Zhang 等[39]再次提出了光聲穆勒矩陣成像的概念,并解決了分子取向簡并的問題,實(shí)現(xiàn)了0—180°分子取向成像.為完整表征各向異性分子矢量吸收特征,該工作中引入6束偏振態(tài)分別為0°,90°,45°和-45°線偏振光和左、右旋圓偏振光作為激勵(lì)光束,并將樣品視為三維光學(xué)吸收矩陣.與將樣品塊視為二維光傳輸矩陣的光學(xué)穆勒矩陣不同,所提出的偏振光聲矩陣成像技術(shù)能夠提供具有明確物理意義的樣品內(nèi)在偏振特性的三維解析成像.在偏振光聲矩陣成像理論模型中,6 束激發(fā)光的極化狀態(tài)可以被描述為斯托克矢量通過依次激發(fā)樣品得到不同偏振激光束下產(chǎn)生的光聲信號幅值,偏振光聲矩陣可以表示為

其中SPA和MPA分別表示偏振光聲矩陣和樣品的光吸收矩陣,MPA包含了樣品完備的吸收特征,通過計(jì)算可以表示為

結(jié)果表明,MPA的第1 行表示受激分子在不同偏振光束下的確切吸收信息.

其中,PAH,PAV,PAP,PAM,PAR,PAL分別表示偏振態(tài)為0°,90°,45°,-45°的線偏振激光,右旋和左旋圓偏振激光激發(fā)產(chǎn)生的光聲信號振幅.根據(jù)(19)式,可以定義一個(gè)反映分子總吸收的參數(shù):

分子或分子集團(tuán)的有序度變化反映了它們之間的相互作用、結(jié)構(gòu)和功能的特性.本項(xiàng)目從MPA提取了定量反映組織中分子排列有序程度的各向異性度(degree of anisotropy,DOA):

DOA 的范圍為0—1.當(dāng)DOA=1時(shí),光吸收是完全各向異性的,表明所有受激分子的躍遷偶極矩一致.在這種情況下,可以觀察到相應(yīng)的光聲信號幅值隨激發(fā)激光束偏振態(tài)的明顯變化.當(dāng)分子隨機(jī)分布時(shí),DOA=0,對應(yīng)的光聲信號幅度不會(huì)隨線偏振激發(fā)光的偏振角發(fā)生變化.進(jìn)一步地,受激發(fā)分子的躍遷偶極矩(OTDM)取向也可以通過矩陣MPA巧妙地得到:

根據(jù)(22)式計(jì)算出的OTDM角度范圍為-45°—45°,如圖9(a)的Ⅰ區(qū)域所示,而不是-90°—90°(或0°—180°),這是由關(guān)于0°中心對稱的數(shù)據(jù)引起的數(shù)據(jù)簡并,這源于光聲信號幅度的標(biāo)量特性,因此,圖9(a)所示的U1和U2兩個(gè)方向相互垂直的躍遷偶極矩不能被區(qū)分.為了提高分辨躍遷偶極矩的范圍,通過PAV和PAH之間的關(guān)系識別OTDM 取向的象限,若PAV＞ PAH時(shí),則OTDM 應(yīng)該出現(xiàn)在45°—135°的象限內(nèi),故在原始OTDM補(bǔ)償90°,將OTDM的取向范圍角度從-45°—45°擴(kuò)展到-45°—135°,如圖9(c),(d)所示.最后,將所有角度增大45°,以實(shí)現(xiàn)0°—180°的OTDM 成像.

圖9 實(shí)現(xiàn)0—180°分子躍遷偶極矩取向[39](a) OTDM 分布示意圖,E 和U 分別為入射光的電矢量和電躍遷偶極矩;(b) 計(jì)算機(jī)模擬的虛擬樣品OTDM 分布設(shè)置示意圖,這些樣品的DOA 值都設(shè)置為1;(c) 根據(jù)(21)式計(jì)算模擬得到的OTDM 成像結(jié)果;(d) 消除簡并效應(yīng)后得到的OTDM 成像結(jié)果Fig.9.Measurement of 0—180° molecular transition dipole moment orientation[39]:(a) OTDM distribution diagram,E and U are the electric vector and electric transition dipole moment of incident light respectively;(b) schematic diagram of OTDM distribution settings for virtual samples simulated by computer,with DOA values set to 1 for these samples;(c) calculate the simulated OTDM imaging results according to Eq.(21);(d) the OTDM imaging results obtained after eliminating the degeneracy effect.

除了分子的空間排列信息外,手性也是自然界和生命中分子最基本的特征之一.表征分子手性的圓二色性也可以通過矩陣MPA計(jì)算得到:

因此,通過建立矢量吸收矩陣偏振光聲成像理論模型,該工作獲取生物組織中分子各向異性度DOA、分子空間取向OTDM 及反映分子手性CD 三個(gè)定量參數(shù)表征分子構(gòu)象.之后該課題組還利用DOA參數(shù)量化了燒傷初始時(shí)刻的皮膚中膠原纖維的有序性,實(shí)現(xiàn)對燒傷嚴(yán)重程度的準(zhǔn)確評估[42].Park等[53]針對偏振光聲成像準(zhǔn)確提取分子取向進(jìn)行詳細(xì)的研究,得到分子取向的數(shù)學(xué)表達(dá)式:

其中,N為下標(biāo)對應(yīng)的偏振光聲信號的個(gè)數(shù),i和j為信號的元素指標(biāo).當(dāng)?a=?b時(shí),求解分子取向角的線性偏振光束的最小數(shù)目為3個(gè),例如,30°,60°和150°.此外,來自生物組織的PA 信號通常較弱,容易受到環(huán)境信號或干擾的影響,考慮到生物組織的弱各向異性吸收特征實(shí)際成像中4—6 束偏振態(tài)不同的激發(fā)光能更準(zhǔn)確反演分子取向,其結(jié)果如圖10 所示.

圖10 偏振光聲成像分子取向的準(zhǔn)確性與激發(fā)光電矢量數(shù)目的關(guān)聯(lián)[53](a) 線二向色性光聲顯微成像系統(tǒng)裝置示意圖(DS-PAM),其中FC 為光纖準(zhǔn)直器,L 為透鏡,BS 為分束器,PBS 為偏振分束器,RS 為旋轉(zhuǎn)臺,UST 為超聲波換能器,WT 為水箱,AMP 為放大器,PD 為光電探測器,PC 為電腦,DAQ 為數(shù)據(jù)采集;(b) 交叉導(dǎo)線的照片;(c) 常規(guī)光聲圖像;(d) 根據(jù)激發(fā)光偏振狀不同得到的一系列圖像;(e) 分子取向方位角;(f) 線二向色性圖Fig.10.The correlation between the accuracy of molecular orientation in polarized photoacoustic imaging and the number of excited photoelectric vectors[53]:(a) The DS-PAM system configuration,FC is fiber collimator,L is lens,BS is beam splitter,PBS is polarizing beam splitter,RS is rotary stage,UST is ultrasonic transducer,WT is water tank,AMP is amplifier,PD is photodetector,PC is personal computer,DAQ is data acquisition;(b) photograph of crossed wires,the red box indicates the FOV for DS-PAM;(c) conventional PAMAPimage;(d)series ofimages according to the polarization states;(e) azimuth and(f) dichroism mapping accordingto(i)-(iv)thenumber ofanglesapplied.

基于偏振光聲顯微成像技術(shù)提取樣品各向異性度、分子取向和手性特征的原理和方法已經(jīng)被證實(shí),相信隨著偏振光聲顯微系統(tǒng)的完善,偏振光聲提供的生物組織各向異性特征參數(shù)將在多種疾病病理研究和早期診斷發(fā)揮作用.

3.1.2 偏振光聲計(jì)算機(jī)層析成像技術(shù)

傳統(tǒng)光聲斷層掃描技術(shù)與光聲顯微鏡及光聲內(nèi)窺鏡相比發(fā)展時(shí)間最早[9],相較于光聲顯微鏡,光聲層析掃描在實(shí)驗(yàn)裝置上主要的不同在光路末尾的透鏡以及傳感器的排列,光聲顯微鏡在光路末尾通常采用凸透鏡聚焦光束,提高局部小區(qū)域的成像對比度,光聲計(jì)算層析成像在光路末尾通常采用凹透鏡實(shí)現(xiàn)光束擴(kuò)束,提高成像范圍.在傳感器的設(shè)計(jì)上,光聲顯微鏡由于成像區(qū)域較小,對超聲傳感器數(shù)量上的要求相對較低,相反對于傳感器的性能參數(shù)有較高的要求;光聲斷層掃描成像由于成像范圍大,使用一個(gè)傳感器的接收范圍無法完全覆蓋,因此多個(gè)傳感器的不同排列使光聲斷層掃描成像擁有更多的可能.

2018年,基于偏振光聲成像,Lihong V.Wang團(tuán)隊(duì)[44]提出了對各向異性敏感的偏振光聲計(jì)算層析成像技術(shù)(DS-PACT).相比傳統(tǒng)的光聲計(jì)算層析成像,偏振光聲計(jì)算層析成像實(shí)現(xiàn)了對樣品各向異性程度和分子取向的檢測.實(shí)驗(yàn)中,傳感器的排列沿樣本在半徑5 cm 處呈環(huán)狀分布,這種環(huán)狀的傳感器陣列中的元件呈弧形,使成像平面上產(chǎn)生了19.8 mm 的軸向焦距.實(shí)驗(yàn)裝置如圖11(a)所示.

圖11 線二向色性光聲計(jì)算層析成像系統(tǒng)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果[44](a) 線二向色性光聲計(jì)算層析成像(DS-PACT)裝置圖;(b) 以0.625 Hz 的幀率獲得常規(guī)PACT 圖像序列,使入射光的偏振率旋轉(zhuǎn)為11.25°/s;(c) 歸一化PA 振幅的時(shí)間的函數(shù);(d) 傅里葉光譜位于0.0625 Hz 的峰值對應(yīng)于由調(diào)制極化引起的交流光聲信號;(e) 重建的DS-PACT 圖像;(f) 顏色編碼的分子取向方向角度圖;(g) 無散射介質(zhì)的樣品照片,樣品包含兩塊牛腱,它們相互垂直放置;(h)PA 振幅的調(diào)制深度隨著散射介質(zhì)厚度D 的變化曲線,高達(dá)15 mm,紅色實(shí)線表示與測量數(shù)據(jù)的指數(shù)擬合,黑色虛線表示噪聲水平;(i) 常規(guī)PACT 圖像;(j) 使用DSPACT 的振幅圖像;(k) 兩塊牛肌腱的方位角圖Fig.11.Linear dichroic photoacoustic computed tomography system and experimental results[44]:(a) Experimental setup of linear dichroism-sensitive photoacoustic computed tomography(DS-PACT);(b) a sequence of conventional PACT images is acquired at a frame rate of 0.625 Hz,rotating the polarization of the incident light at 11.25°/s;(c)normalized PA amplitude as a function of time at one representative spatial point.PA(t) is normalized with respect to its average;(d) Fourier spectrum of PA(t).The peak located at 0.0625 Hz corresponds to the alternating PA signals due to the modulated polarization;(e) DS-PACT image reconstructed by the amplitude of the lock-in term;(f) color-coded orientation angle map of the sample,which is reconstructed from the phase of the lock-in term;(g) photograph of the sample without any scattering medium.The sample contains two pieces of bovine tendon,which are placed perpendicular to each other;(h) modulation depth of the PA amplitude acquired with increasing thickness D of the scattering medium,up to 15 mm,the red solid line indicates the exponential fit to the measured data.The black dashed line represents the noise level;(i) conventional PACT images;(j) amplitude images using DSPACT;(k) orientation angle maps of the two pieces of bovine tendon.

后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對PVA 材料薄膜以及對離體的牛腱進(jìn)行了成像檢測,證實(shí)了偏振光聲計(jì)算層析成像技術(shù)能在6 個(gè)傳輸平均自由程內(nèi)表征生物樣品的各向異性特征.

2022年,Ren 等[47,48]設(shè)計(jì)了一種手持的偏振光聲斷層掃描探頭,加速了偏振光聲計(jì)算層析成像技術(shù)在臨床應(yīng)用領(lǐng)域的實(shí)際落地,實(shí)驗(yàn)裝置和結(jié)果如圖12 所示.該手持探頭可大致分為偏振光學(xué)系統(tǒng)、偏振光聲信號采集系統(tǒng)以及整體外殼.偏振光學(xué)系統(tǒng)為一系列光學(xué)鏡片組成,作為改變激光偏振態(tài)的半波片通過帶有刻度可調(diào)整角度的波片架固定,實(shí)現(xiàn)手動(dòng)調(diào)整激光偏振態(tài).偏振光聲信號采集系統(tǒng)為128 個(gè)線陣排列的超聲換能器,實(shí)現(xiàn)偏振光聲信號的采集.整體外殼由3D 打印技術(shù)打印完成,偏振光學(xué)系統(tǒng)與偏振光聲信號采集系統(tǒng)呈45°角組裝到一起,從而達(dá)到較好的光激發(fā)和聲探測效率.

圖12 手持式偏振光聲計(jì)算機(jī)斷層掃描系統(tǒng)與結(jié)果[47](a)手持式偏振光聲探頭裝置示意,UT 為超聲換能器,HWP 為半波片;(b) 校準(zhǔn)裝置的照片;(c) 不同偏振方向的PVA 和PVC 的光聲成像;(d) PVA 和PVC 的偏振光聲信號受激發(fā)光電矢量方向的調(diào)制曲線;(e) 小鼠腿(上)和 牛肌腱(下)的照片;(f) 小鼠 腿(上)和牛肌腱(下)的HP-PACT 圖像,激發(fā)光電 矢量方 向?yàn)?°(水平)和90°(垂直);(g) 小鼠腿(上)和牛肌腱(下)線二向色性結(jié)果圖Fig.12.Handheld polarized photoacoustic computed tomography system and results[47]:(a) Handheld polarized photoacoustic probe,UT is ultrasound transducer,HWP is half wave plate;(b) photograph of the calibration setup;(c) PAI of the PVA and PVC with different polarizations;(d) modulation curve of polarized photoacoustic signals in PVA and PVC excited by photoelectric vector direction;(e) photograph of the mouse leg(upper) and bovine tendon(lower);(f) HP-PACT images of mouse leg(upper) and bovine tendon(lower) with the polarization of the excitation light being 0°(horizontal) and 90°(vertical);(g) dichroic imaging of mouse leg(upper) and bovine tendon(lower) lines.

為進(jìn)一步對該裝置的準(zhǔn)確性進(jìn)行探究,該團(tuán)隊(duì)首先對該探頭的偏振光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行了校驗(yàn),將激光通過偏振光學(xué)系統(tǒng)垂直入射于偏振測量儀上進(jìn)行校驗(yàn),隨后為驗(yàn)證偏振光聲信號采集準(zhǔn)確性,選擇具有強(qiáng)各向異性的聚乙烯醇式偏光片(PVA)和各向同性的深色塑料片(PVC)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),該探頭在兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中擁有出色的表現(xiàn),展現(xiàn)良好的準(zhǔn)確性.隨后團(tuán)隊(duì)進(jìn)行仿體實(shí)驗(yàn),將PVC 和光軸方向?yàn)?°,45°,90°,135°的PVA 浸入散射介質(zhì)中檢測以及對層疊的不同深度且光軸不同的PVA 進(jìn)行深度測試,最后團(tuán)隊(duì)對離體牛腱進(jìn)行生物組織測試.實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了該裝置具有良好的成像質(zhì)量以及準(zhǔn)確性.

偏振光聲計(jì)算層析成像相比于偏振光聲顯微成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)更快的采集速度,同時(shí)避免了復(fù)雜的多束激光耦合的問題,或由于掃描機(jī)械抖動(dòng)帶來系統(tǒng)誤差,使偏振光聲成像技術(shù)推上臨床成為可能,但同時(shí)應(yīng)該認(rèn)識到由于偏振光聲計(jì)算層析成像采用大光斑激發(fā),其激發(fā)區(qū)域較大,導(dǎo)致產(chǎn)生的偏振光聲信號是多個(gè)分子的共同貢獻(xiàn),所以該成像模式下各向異性度的準(zhǔn)確性會(huì)下降,較適用于簡單規(guī)則的各向異性樣品的檢測.

3.2 偏振光聲技術(shù)-納米材料構(gòu)象特征檢測

基于偏振光聲技術(shù)對不同各向異性介質(zhì)有特異性反映的性質(zhì),偏振光聲技術(shù)也被嘗試應(yīng)用于材料的性能測試.其中手性是物體在鏡像情況下不相同的一種對稱性,一個(gè)手性物體的兩個(gè)鏡像僅在空間排列上有所不同,這導(dǎo)致它們與相反手性的圓偏振光的相互作用不同,折射率和吸收差異分別反映了材料的光學(xué)活性和圓二色性.2017年,Benedetti 團(tuán)隊(duì)[54]成功利用光聲檢測技術(shù)精確測量了納米螺旋中的圓二色性.由于散射和衍射干擾,通過傳統(tǒng)光學(xué)途徑測量樣本的二向色特性存在細(xì)節(jié)不足的缺點(diǎn).因此該團(tuán)隊(duì)嘗試通過偏振光聲顯微鏡對納米螺旋簇的圓二向色性進(jìn)行表征.通過比較光學(xué)和光聲技術(shù),全光測量受到高衍射效應(yīng)的影響,此外,在樣品面積減小的情況下,空區(qū)傳輸阻礙了場的純度.光聲成像技術(shù)則通過測量與螺旋結(jié)構(gòu)完全相關(guān)的獨(dú)立于散射的吸收來獲得了樣品的純凈和精確的圓二向色性特征,其系統(tǒng)與結(jié)果如圖13所示.

2019年,Petronijevi?團(tuán)隊(duì)[55]就金屬-聚苯乙烯(SNSA)超表面的手性特性進(jìn)行偏振光聲檢測.他們利用光聲光譜來表征右旋和左旋圓偏振的不同吸收,給出材料的圓二色性作為直接結(jié)果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)值計(jì)算結(jié)果吻合較好.為了判斷光聲信號能否反應(yīng)納米結(jié)構(gòu)構(gòu)象特征,團(tuán)隊(duì)對比測量了蒸發(fā)過程中沉積在聚苯乙烯二維陣列附近的同一基板上的平坦金屬膜的光譜以及SNSA 的光譜.結(jié)果顯示所有樣品在633 nm 處都有顯著的增強(qiáng)的光聲信號,團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步選擇該波長進(jìn)行圓二色性表征,實(shí)驗(yàn)裝置和結(jié)果如圖14 所示.作者展示了納米球光刻結(jié)合傾斜金屬沉積方法產(chǎn)生的超表面的手性檢測方法.應(yīng)用光聲技術(shù)表征了3 種不同金屬覆蓋的聚苯乙烯納米球在633 nm 處的圓二色性(CD),覆蓋Au 和Cr 的樣品顯示出手性行為,而覆蓋Ag 的樣品顯示出正入射的CD,具有本征手性特征.通過這種優(yōu)化的設(shè)計(jì),可以獲得高效的納米級圓偏振檢測.

圖14 偏振光聲檢測金屬-聚苯乙烯(SNSA)超表面的手性特性[55](a)—(c) 分別為Au-半納米殼陣列、Cr-半納米殼陣列、Ag-半納米殼陣列的場發(fā)射掃描電子顯微成像(FESEM);(d) 納米殼幾何參數(shù)和蒸發(fā)角度草圖;(e) 手性-PA 設(shè)置裝置示意,插圖為入射模式;(f) Au 沉積前后旋轉(zhuǎn)四分之一波片得到的光聲信號幅值變化趨勢;(g) 不同入射角下3 個(gè)樣本CD 值的變化;(h) Au-SNSA在最大CD 條件下吸收密度的分布,最大吸收密度在金納米的邊界上Fig.14.Chiral properties of metal polystyrene(SNSA) metasurfaces detected by polarized photoacoustic detection[55]:(a) Au-SNSA,(b) Cr-SNSA,and(c) Ag-SNSA and(d) sketch of the geometric parameters and the evaporation angle;(e) schematic diagram of chiral PA setting device,illustration:incidence mode;(f) the amplitude variation trend of photoacoustic signals obtained by rotating a quarter wave plate before and after Au deposition;(g) changes in CD values of three samples under different incident angles;(h) the distribution of absorption density of Au SNSA under maximum CD conditions is shown,with the maximum absorption density at the boundary of gold nanoparticles.

各向異性二維材料(如黑磷、二硫化錸等)因其低對稱的晶格結(jié)構(gòu),不僅表現(xiàn)出高遷移率和高開關(guān)比,在光學(xué)、熱學(xué)和電學(xué)等方面還具有獨(dú)特的各向異性.這些各向異性特征為新型光電器件的研發(fā)提供了額外的自由度,可以用來開發(fā)偏振敏感光探測器、薄膜偏振器等.而其各向異性特征及應(yīng)用與晶軸取向高度相關(guān),目前晶軸取向的光學(xué)檢測技術(shù)主要有角分辨拉曼光譜、偏振反射技術(shù)和偏振透射技術(shù)等,其中激發(fā)波長、樣品厚度以及襯底性質(zhì)等均會(huì)對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響.基于偏振光聲原理以及各向異性二維材料的光吸收特性,2023 年華南師范大學(xué)石玉嬌/張振輝團(tuán)隊(duì)[52]進(jìn)一步發(fā)展了角分辨偏振光聲顯微鏡,通過分析偏振光聲信號幅值與入射光偏振方向和晶軸取向之間的夾角的函數(shù)關(guān)系,實(shí)現(xiàn)了對黑磷晶軸取向的通用性精準(zhǔn)檢測.檢測結(jié)果不受厚度、激發(fā)波長以及封裝層影響,其系統(tǒng)和不同厚度黑磷樣品的晶軸取向檢測結(jié)果如圖15所示.

圖15 角分辨偏振光聲技術(shù)檢測二維材料的晶軸取向[52](a) 角分辨偏振光聲顯微鏡系統(tǒng)示意圖,插圖為黑磷樣品的光學(xué)照片;(b) a1,a2,a3 和a4 為4 個(gè)采樣點(diǎn)的晶軸(扶手椅型)取向檢測結(jié)果Fig.15.Angle resolved polarized photoacoustic technology for detecting the crystal axis orientation of two-dimensional materials[52]:(a) The diagram of the angle-resolved polarized photoacoustic microscopy(AnR-PPAM) system and the illustration is the optical photo of black phosphorus;(b) a1,a2,a3,and a4 are the crystal axis(armchair type) orientation detection results of the four sampling points.

在生物分子影像領(lǐng)域,蘇州大學(xué)劉莊團(tuán)隊(duì)[51]提出了一種基于磁響應(yīng)的 Fe3O4@Au 磁性納米棒磁控?zé)o背景偏振光聲成像技術(shù).該技術(shù)通過對光場方向的調(diào)控能夠使這種納米棒的表面激發(fā)出等離激元,以及對光聲信號產(chǎn)生進(jìn)行可逆性的調(diào)控.入射光電矢量方向與納米棒長軸平行時(shí)可以獲得更大的吸收概率,激發(fā)更強(qiáng)的等離激元,垂直則相反,所以可以通過施加磁場使本來無序排列的納米棒呈現(xiàn)有序排列,進(jìn)而調(diào)節(jié)激發(fā)光電矢量的方向可以實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)納米探針光聲信號的有效調(diào)制.該工作提出了在交變磁場下同時(shí)進(jìn)行PA 成像的FFT 加權(quán)成像技術(shù),其通過采集一段時(shí)間內(nèi)的PA 圖像并提取出每個(gè)像素的PA 強(qiáng)度.利用快速傅里葉變換將時(shí)域信號轉(zhuǎn)換為頻域信號,在頻譜空間內(nèi),周期性信號容易被識別為尖峰,并與靜態(tài)和隨機(jī)噪聲區(qū)分開來.最后,通過對頻域峰值強(qiáng)度進(jìn)行逆傅里葉變換恢復(fù)信號,可以生成無背景的PA 圖像,從而完全去除噪聲,大大提高了的靈敏度和特異性,其原理和結(jié)果如圖16 所示.

圖16 基于磁響應(yīng)納米探針的偏振光聲無背景成像[51](a) 磁控偏振光聲無背景成像的原理示意圖;(b) 光激發(fā)下不同共振波長納米棒的電場分布,比例尺為20 nm;(c) 靜脈腫瘤無背景偏振成像示意圖,注入Fe3O4@Au NRs;(d) 傳統(tǒng)光聲成像和偏振光聲無背景成像結(jié)果Fig.16.Polarized photoacoustic background free imaging based on magnetic responsive nanoprobes[51]:(a) Schematic diagram of the principle of magnetic controlled polarized light acoustic background free imaging;(b) electric field distribution of orientated nanorods under light excitation at resonant wavelength.Scale bars:20 nm;(c) background free polarization imaging schematic of venous tumors,injection Fe3O4@Au NRs;(d) control photoacoustic imaging and polarized photoacoustic imaging have no background imaging results.

偏振光聲成像技術(shù)由于避免了光散射的影響,只依賴于光吸收,所以在納米材料構(gòu)象特征的檢測上具有獨(dú)特優(yōu)勢.生物外源造影劑相比于生物內(nèi)源分子具有更強(qiáng)的矢量吸收特點(diǎn),可以得到更好的對比度成像,但其缺失了生物功能參數(shù).

4 結(jié)論

光與生物組織的相互作用是人們所感興趣的一方面,主要的一個(gè)動(dòng)機(jī)是對渾濁生物物體進(jìn)行成像的潛力.光在生物組織中的偏振特性取決于多種因素,包括入射偏振態(tài)、散射體的大小和形狀、散射體的濃度.鑒于許多生物細(xì)胞、細(xì)胞器和生物大分子的形狀接近于球體與橢球體,生物組織通常被建模為均勻球形顆粒的集合,瑞利和米氏理論或其組合是計(jì)算組織散射特性的基礎(chǔ)[56].對于線偏振光來說,去偏振很大程度上取決于散射體的大小和密度[57,58],而在具有不同尺寸的散射混合體中進(jìn)行傳播時(shí),去偏振行為由較小的散射體主導(dǎo)[59,60].另一方面生物組織中也存在各向異性的結(jié)構(gòu),比如心肌和肌腱,都含有豐富的膠原蛋白,由于分子各向異性而具有固有的線性雙折射,此類樣品中入射偏振態(tài)的變化是由于組織雙折射以及散射去偏振造成的.而本文介紹的偏振光聲成像,其模式為偏振光激發(fā)和聲檢測,相比于偏振光學(xué)成像減小一半的光程,使得其成像深度更深,特別針對活體淺表的偏振檢測尤為適合.

總之,本文首先從單分子矢量吸收的理論模型闡明了偏振光聲成像的物理機(jī)制,總結(jié)了提取樣品各向異性度,取向和手性的技術(shù)方法的發(fā)展歷程.從生物組織成像和納米材料檢測兩個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域展開介紹了偏振光聲顯微成像、偏振光聲計(jì)算層析成像和偏振光聲納米材料分子成像的相關(guān)研究進(jìn)展.偏振光聲成像技術(shù)是近十年才出現(xiàn)的新型技術(shù),相比于傳統(tǒng)的偏振光成像技術(shù),其具備兩個(gè)特別優(yōu)勢.一是物理機(jī)制簡單明了,只源于目標(biāo)物的吸收系數(shù),二是具備傳遞目標(biāo)物深層結(jié)構(gòu)的構(gòu)象信息能力,因而近幾年得到更廣泛的關(guān)注.偏振光聲成像技術(shù)的物理方法已經(jīng)得到明確,將來的突破方向應(yīng)著眼于二維材料或生物體發(fā)育、病變的應(yīng)用研究,例如二維材料的分子取向和其光電特性的關(guān)聯(lián),生物分子排列取向信息和復(fù)雜疾病病理之間的關(guān)聯(lián).更快、更穩(wěn)定的成像系統(tǒng)有待進(jìn)一步完善,提取特征參量的算法有待進(jìn)一步發(fā)展.偏振光聲成像技術(shù)集合了偏振光學(xué)成像的極化信息提取和光聲成像的特異性深層成像的能力,為材料和生物基礎(chǔ)研究提供多功能參數(shù).