潘彬雄 弓晟 張鵬 劉子葉 皮彭健 陳旺 黃文強(qiáng) 王保舉? 詹求強(qiáng)?

1)(華南師范大學(xué),華南先進(jìn)光電子研究院,廣州 510006)

2)(華南師范大學(xué)物理學(xué)院,廣州 510006)

激光點(diǎn)掃描熒光顯微鏡憑借高分辨率、高靈敏度、高特異性、可光學(xué)層切三維成像和動(dòng)態(tài)成像等優(yōu)勢(shì),已成為生命科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的重要工具.隨著研究者對(duì)生命科學(xué)研究的逐漸深入,由于受光學(xué)衍射極限影響和逐點(diǎn)掃描探測(cè)的限制,傳統(tǒng)點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡的時(shí)空分辨率已無(wú)法完全滿足相關(guān)研究需求,在實(shí)際應(yīng)用中面臨諸多挑戰(zhàn).近二十年來(lái),超分辨熒光顯微成像技術(shù)取得了重要進(jìn)展,研究人員發(fā)展了多種高空間分辨率、高時(shí)間分辨率的點(diǎn)掃描熒光顯微成像技術(shù),對(duì)于生物成像等具有重要意義.然而,有關(guān)該領(lǐng)域最新進(jìn)展的綜述論文較少,系統(tǒng)地討論、總結(jié)基于點(diǎn)掃描的高時(shí)空分辨熒光顯微成像技術(shù)的研究進(jìn)展,對(duì)于其未來(lái)研究發(fā)展極為重要.本文主要從時(shí)間分辨率與空間分辨率兩個(gè)維度分別介紹了各類點(diǎn)掃描熒光顯微成像技術(shù)的基本原理及相關(guān)進(jìn)展,并介紹了高時(shí)空分辨顯微成像技術(shù)及應(yīng)用,最后討論展望了高時(shí)空分辨點(diǎn)掃描熒光顯微鏡的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)和挑戰(zhàn).

1 引言

光學(xué)顯微鏡將人類視野從宏觀拓展到了微觀領(lǐng)域,為探究物質(zhì)構(gòu)成與生命起源發(fā)揮了重要作用.1873年,德國(guó)科學(xué)家Abbe 提出傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率由波長(zhǎng)和物鏡數(shù)值孔徑?jīng)Q定,其理論公式為橫向分辨率dminλ0/(2NAobj),軸向分辨率Zmin2λ0/(NAobj)2[1,2].其中,dmin是橫向分辨最小距離;Zmin是軸向分辨最小距離;λ0是光波長(zhǎng);NAobj是物鏡數(shù)值孔徑.因此,在可見光波段,傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡分辨率,橫向約200 nm,軸向約500 nm.

然而,為進(jìn)一步揭示蛋白分子相互作用,亞細(xì)胞器動(dòng)態(tài)變化等機(jī)理,光學(xué)顯微鏡分辨率需要由百納米量級(jí)跨越至幾十納米甚至幾納米量級(jí).為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo),研究者提出多種突破衍射極限的遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微超分辨成像技術(shù),其中代表性技術(shù)有:基于單分子定位顯微鏡(single-molecule localization microscopy,SMLM)的光激活定位顯微鏡(photoactivated localization microscopy,PALM)[3]和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)[4],基于頻域擴(kuò)展的結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(structured illumination microscopy,SIM)[5],以及基于點(diǎn)掃描成像的受激輻射損耗顯微鏡(stimulated emission depletion,STED)[6].這些代表性技術(shù)在空間分辨率與時(shí)間分辨率方面各具優(yōu)勢(shì).例如,單分子定位顯微鏡(SMLM)核心思想為“閃爍”、“定位”與“重構(gòu)”[7-9],通過(guò)每次激發(fā)少量探針以達(dá)到高定位精度,橫向分辨率最高可達(dá)10 nm,但需要大量原始圖像進(jìn)行重構(gòu)計(jì)算,因此時(shí)間分辨率通常在分鐘量級(jí),難以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞快速動(dòng)態(tài)成像.SIM 技術(shù)采用結(jié)構(gòu)光照明方式,提取目標(biāo)圖像的高頻信息,需5—9 張?jiān)紙D像重構(gòu)計(jì)算出高分辨圖像[10,11],其時(shí)間分辨率相對(duì)較高,但空間分辨率有限,僅比寬場(chǎng)顯微鏡提高2 倍.相較于上述兩類技術(shù),STED 技術(shù)的空間分辨率顯著高于SIM,一般為20—50 nm[6,12,13],時(shí)間分辨率也明顯高于SMLM,因此在兼具高時(shí)空分辨率方面具有優(yōu)勢(shì)(表1).

表1 SMLM,SIM,STED 超分辨技術(shù)的關(guān)鍵性能指標(biāo)對(duì)比Table 1.Technical comparison of SMLM,SIM,STED super-resolution microscopy.

為應(yīng)對(duì)當(dāng)前科學(xué)研究需求,研究者對(duì)現(xiàn)代顯微技術(shù)的時(shí)空分辨率均提出了更高要求,實(shí)現(xiàn)高時(shí)空分辨率顯微成像技術(shù)已成為顯微成像領(lǐng)域的重要研究方向.本文主要介紹了多種基于點(diǎn)掃描成像的技術(shù)原理及相關(guān)進(jìn)展,從時(shí)間分辨率與空間分辨率兩個(gè)維度分別討論了各類技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用,總結(jié)了基于點(diǎn)掃描的高時(shí)空分辨顯微成像技術(shù)進(jìn)展及應(yīng)用,最后分析討論了高時(shí)空分辨點(diǎn)掃描熒光顯微鏡的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)和挑戰(zhàn).

2 傳統(tǒng)點(diǎn)掃描共聚焦顯微成像

早期,傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像系統(tǒng)以寬場(chǎng)顯微鏡為主,即整個(gè)樣品被同時(shí)激發(fā),所產(chǎn)生的熒光信號(hào)被相機(jī)收集的同時(shí),也包括了未聚焦的背景信號(hào)(圖1(a)和圖1(b)).因此,寬場(chǎng)顯微鏡的軸向分辨率很差,無(wú)法實(shí)現(xiàn)清晰的三維成像(圖1(e)和圖1(f)).共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)通過(guò)空間針孔阻擋了離焦光,進(jìn)而提高了分辨率和對(duì)比度,使其具備光學(xué)切片的能力,能夠?qū)崿F(xiàn)清晰的三維成像(圖1(c)—(f))[14,15].因此,共聚焦激光掃描顯微鏡憑借具有非接觸、非侵入性、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì),得到了廣泛應(yīng)用,且已實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化[16,17].

圖1 寬場(chǎng)和共聚焦顯微成像技術(shù)對(duì)比(a) 寬場(chǎng)顯微鏡系統(tǒng)簡(jiǎn)化圖;(b) 寬場(chǎng)顯微鏡熒光信號(hào)采集方式[18];(c) 共聚焦顯微鏡系統(tǒng)簡(jiǎn)化圖;(d) 共聚焦顯微鏡熒光信號(hào)采集方式[18];(e) 二維切面圖對(duì)比[18];(f) 三維重構(gòu)圖對(duì)比[18]Fig.1.Comparison of wide-field and confocal microscopy:(a) Simplified system schematic of wide-field microscopy;(b) fluorescent signal acquisition of wide-field microscopy[18];(c) simplified system schematic of confocal microscopy;(d) fluorescent signal acquisition of confocal microscopy[18];(e) comparison of two-dimensional section images[18];(f) comparison of three-dimensional reconstruction images[18].

為提高共聚焦顯微鏡分辨率,1988 年Sheppard[19]提出了在不犧牲信噪比的情況下,獲得兩倍分辨率提高的點(diǎn)掃描共聚焦成像方式,其原理為使用陣列探測(cè)器替代單像素探測(cè)器,每個(gè)像素都充當(dāng)一個(gè)針孔,用于記錄分辨率增強(qiáng)但信號(hào)低和偏移的共焦圖像,如圖2(a)所示.通過(guò)將檢測(cè)到的熒光向照明軸重新分配來(lái)校正偏移并恢復(fù)信號(hào),如圖2(b)所示,從而減少信號(hào)損失的情況下提高了分辨率.與反卷積算法結(jié)合,橫向分辨率可以達(dá)到120 nm,該成像系統(tǒng)已有商業(yè)化產(chǎn)品,即蔡司的Airyscan 顯微鏡[20].然而,逐點(diǎn)串行掃描方式會(huì)導(dǎo)致時(shí)間分辨率相對(duì)較差.例如,同樣成像視野(512×512 像素),寬場(chǎng)成像單幀時(shí)間為20 ms,共聚焦點(diǎn)掃描單像素駐留時(shí)間為10 μs,整個(gè)成像視野則需2.6 s.

3 高時(shí)間分辨率點(diǎn)掃描成像技術(shù)

3.1 基于多焦點(diǎn)陣列提高成像速度

為提高共聚焦顯微鏡成像速度,2010 年Müller 和Enderlein [21]提出了基于面陣探測(cè)器(CCD)的單焦點(diǎn)激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù),并將其命名為圖像掃描顯微技術(shù)(image scanning microscopy,ISM).其將傳統(tǒng)的共焦激光掃描顯微鏡與快速寬場(chǎng)CCD 檢測(cè)相結(jié)合,同時(shí)通過(guò)上述像素重定位方法和反卷積算法實(shí)現(xiàn)分辨率提升.在對(duì)熒光珠成像中,傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡實(shí)現(xiàn)了244 nm 分辨率,而ISM 的分辨率可至150 nm,相比于CLSM 分辨率提高了約1.63 倍(圖2(a)—(c)).為解決ISM技術(shù)單點(diǎn)掃描成像速度有限的問題,York 等[22]在2012 年提出了多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(multifocal structured illumination microscopy,MSIM).該技術(shù)原理如圖2(d)所示,采用高速數(shù)字微反射鏡器件(digital micromirror device,DMD)同時(shí)實(shí)現(xiàn)多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光的產(chǎn)生和掃描,通過(guò)數(shù)字像素重定位和反卷積技術(shù)進(jìn)行圖像重構(gòu),在45.6 μm×45.6 μm的超大視野成像中獲得了1 Hz 時(shí)間分辨率,并以此實(shí)現(xiàn)三維層切成像,其中成像深度可達(dá)48 μm,同時(shí)具有橫向約145 nm、軸向約400 nm 的空間分辨率,如圖2(e)和圖2(f) 所示.該技術(shù)相比單點(diǎn)掃描ISM 技術(shù)不僅具有高時(shí)間分辨率,還同時(shí)具有深層三維成像能力,為活體厚樣品的三維成像提供了強(qiáng)有力的工具.為進(jìn)一步提高M(jìn)SIM 成像深度,2014年,Ingaramo 等[23]引入近紅外脈沖光實(shí)現(xiàn)了多光子激發(fā)的MSIM 技術(shù),將成像深度提高至100 μm,同時(shí)兼顧了高時(shí)間分辨率與高空間分辨率的優(yōu)勢(shì).

3.2 基于微透鏡陣列提高成像速度

由于多焦點(diǎn)光場(chǎng)的光強(qiáng)嚴(yán)重受限于數(shù)字微鏡陣列和空間光調(diào)制器的反射效率.為生成高效率多焦點(diǎn)光場(chǎng),有研究者提出利用微透鏡陣列產(chǎn)生并行多焦點(diǎn)聚焦光斑.轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡(spinning disk confocal microscopy,SDCM)正是利用此概念,如圖3(a)所示,該系統(tǒng)核心器件由兩個(gè)分別帶有微透鏡陣列和針孔陣列的轉(zhuǎn)盤組成.當(dāng)用準(zhǔn)直光照射時(shí),每個(gè)微透鏡都會(huì)產(chǎn)生一個(gè)聚焦光點(diǎn),微透鏡陣列產(chǎn)生約1000 個(gè)焦點(diǎn)對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)掃描成像[26,27].在相同信噪比下,轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的成像速度是傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡的10—100 倍[28].此外,轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡還具有降低光漂白,細(xì)胞光毒性低,可長(zhǎng)時(shí)程活細(xì)胞成像的優(yōu)勢(shì)[29-31].轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡雖然借助微透鏡陣列提高了成像速度,但其分辨率相較于傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡并未改善.

圖3 基于微透鏡陣列的快速成像技術(shù)示意圖(a) 轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)簡(jiǎn)化圖;(b) 實(shí)現(xiàn)Instant-SIM 的關(guān)鍵步驟[32];(c) Instant-SIM和轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的活細(xì)胞雙色成像對(duì)比[32]Fig.3.Schematic diagram of fast imaging technology based on microlens array:(a) Simplified schematic of the spinning disk confocal system;(b) key steps in implementing Instant-SIM[32];(c) dual-color imaging comparison of Instant-SIM and spinning disk confocal microscope on live-cell[32].

為了提高轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡分辨率,同時(shí)兼顧其高速成像的優(yōu)勢(shì),York 等[32]在2013 年提出了一種基于微透鏡陣列的實(shí)時(shí)多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光超分辨技術(shù)(instantaneous structured illumination microscope,Instant-SIM),其原理為:首先利用微透鏡陣列生成多焦點(diǎn)激發(fā)模式,與之相匹配的針孔陣列在共焦面抑制離焦熒光信號(hào),再利用一個(gè)共軛且匹配的微透鏡陣列局部縮小每個(gè)透過(guò)針孔的熒光焦點(diǎn)至原來(lái)尺寸的1/2,通過(guò)硬件實(shí)現(xiàn)像素重定位效果,最后再由振鏡控制激發(fā)點(diǎn)陣掃描整個(gè)視場(chǎng),并將縮小后的熒光點(diǎn)陣反射到CCD 對(duì)應(yīng)的位置,疊加形成實(shí)時(shí)超分辨圖像(圖3(b)).Instant-SIM 將MSIM 需要后處理的步驟完全在硬件中實(shí)現(xiàn),使其具備了對(duì)活體樣品進(jìn)行高分辨率實(shí)時(shí)觀測(cè)的能力.同時(shí),Instant-SIM 的橫向和軸向的分辨率分別為145 nm 和350 nm,采集速度高達(dá)100 Hz,并在活體肺成纖維細(xì)胞中以更高的三維分辨率且10 倍于轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的成像速度獲取雙色超分辨圖像(圖3(c)).Qin 等[25,33]還通過(guò)將傳統(tǒng)轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡與ISM 的超分辨方法相結(jié)合,提出了分辨率更高的CSD-ISM 技術(shù),其顯著優(yōu)勢(shì)在于可簡(jiǎn)單實(shí)現(xiàn),如對(duì)現(xiàn)有共聚焦旋轉(zhuǎn)盤裝置進(jìn)行光源調(diào)制,使旋轉(zhuǎn)盤與照明和成像相機(jī)同步,從而很容易地升級(jí)到ISM.

4 超高空間分辨率點(diǎn)掃描成像技術(shù)

4.1 點(diǎn)掃描超分辨成像技術(shù)

研究者提出的上述多種方案提高了成像速度,但依然面臨空間分辨率有限的問題.為實(shí)現(xiàn)共聚焦超分辨成像(＜100 nm),Hell 和Wichmann[6]在1994 年提出了受激輻射損耗顯微術(shù)(STED).該技術(shù)通過(guò)縮小有效激發(fā)光斑的尺寸來(lái)實(shí)現(xiàn)衍射極限的突破,其基本原理如圖4(a)所示,STED 超分辨成像系統(tǒng)通常由兩束激光構(gòu)成,一束為高斯光,也稱作激發(fā)光,另一束為“甜甜圈”狀的空心光,也稱作損耗光,將兩束光在空間上精準(zhǔn)耦合對(duì)齊,僅中間空心位置可發(fā)出熒光,實(shí)現(xiàn)減小激發(fā)光斑的效果,進(jìn)而獲得超分辨成像能力[34,35].STED 分辨率由公式所決定,其中d為橫向分辨最小距離,ISTED為損耗光光強(qiáng);Isat為損耗光的飽和光強(qiáng),其含義為使熒光強(qiáng)度降低為初始大小1/2 時(shí)的損耗光強(qiáng)度.由上述公式可知STED 光強(qiáng)越高,則分辨率越高(圖4(a)).因此,理論上STED 分辨率可達(dá)無(wú)限小[36].例如,有研究者利用NV 色心證實(shí)在3.7 GW/cm2的損耗光強(qiáng)下實(shí)現(xiàn)了2.4 nm 的分辨率(圖4(b))[37].傳統(tǒng)染料和熒光蛋白飽和光強(qiáng)較高,其所需損耗光光強(qiáng)通常在MW/cm2—GW/cm2量級(jí),僅能實(shí)現(xiàn)40—60 nm 的分辨率.同時(shí),傳統(tǒng)商業(yè)染料和熒光蛋白無(wú)法承受高光強(qiáng)損耗光,極易出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象,同時(shí)高光強(qiáng)損耗光也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重光毒性,影響細(xì)胞活性[38].因此,在實(shí)際應(yīng)用中STED的損耗光強(qiáng)難以無(wú)限提高.

圖4 點(diǎn)掃描超分辨成像技術(shù)示意圖(a) STED 原理圖;(b) STED 在NV 色心上實(shí)現(xiàn)2.4 nm 分辨率[37];(c) FED 原理圖[43];(d) 單顆粒FED 成像[44];(e) RESOLFT 原理圖[45];(f)共聚焦顯微鏡和RESOLFT 的細(xì)胞成像對(duì)比[46]Fig.4.Schematic diagram of point scanning super-resolution imaging technology:(a) STED schematic;(b) STED achieves 2.4 nm resolution on NV point[37];(c) FED schematic[43];(d) UCNPs-FED single particle imaging[44];(e) RESOLFT schematic[45];(f) cell imaging comparison of confocal microscope and RESOLFT[46].

為了降低損耗光光強(qiáng),進(jìn)而減少光漂白和光毒性,研究者提出了基態(tài)損耗(ground state depletion,GSD)技術(shù)[39],該技術(shù)相較STED 大大降低了光功率,可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)光激發(fā)與損耗.GSD 技術(shù)的損耗光強(qiáng)相比傳統(tǒng)STED 功率降低了3 個(gè)數(shù)量級(jí)[40],更適合生物組織細(xì)胞成像.同時(shí),為了減少掃描成像過(guò)程中的無(wú)效照明,研究者探究了許多方法,如MINFIELD 成像技術(shù)[41],通過(guò)僅對(duì)提前確定的亞衍射區(qū)域照射來(lái)盡可能地減少光損傷;又如Dy-MIN 成像技術(shù)[42],使用像素停留時(shí)間的一小部分來(lái)驅(qū)動(dòng)位于STED 光束的環(huán)形波峰上的熒光團(tuán)進(jìn)入暗狀態(tài).相比傳統(tǒng)STED 技術(shù),該成像技術(shù)將損耗光強(qiáng)降低了1/20.盡管已提出多種成像技術(shù)降低損耗光光強(qiáng),但是STED 技術(shù)仍然面臨著損耗光強(qiáng)高、光路難以校準(zhǔn)、成像方法復(fù)雜等問題.

為解決上述難題,Kuang 等[43]提出熒光差分技術(shù)(fluorescence emission difference microscopy,FED) 來(lái)降低空心光光強(qiáng)并降低光路復(fù)雜性.該技術(shù)分別利用實(shí)心光斑和空心光斑掃描樣品獲得兩張圖像,并將兩張圖像相減,最終得到差分超分辨圖像(圖4(c),(d)),其原理公式可表示為PSFFEDPSFsolid-rPSFdoughnut,PSFFED,PSFsolid,PSFdoughnut分別為FED、實(shí)心光斑和空心光斑的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(point spread function,PSF),r為相減系數(shù)[47,48].與STED類似,當(dāng)產(chǎn)生熒光非線性飽和時(shí),FED 技術(shù)的分辨率可進(jìn)一步提高[49].相比STED 技術(shù),FED 方法具有無(wú)熒光染料限制、成像系統(tǒng)簡(jiǎn)單、后期處理方便的優(yōu)勢(shì).

FED 技術(shù)雖具有光強(qiáng)低的優(yōu)勢(shì),但存在分辨率相對(duì)較低的問題,一般而言,FED 技術(shù)分辨率難以突破100 nm.為追求超高分辨率,進(jìn)一步降低損耗光強(qiáng),研究者提出了基于光開關(guān)屬性的可逆飽和光轉(zhuǎn)移熒光超分辨顯微技術(shù)(reversible saturable optical fluorescence transitions,RESOLFT)[50,51],RESOLFT 首先使用405 nm 激發(fā)光激活衍射受限光斑區(qū)域內(nèi)的蛋白分子,使其發(fā)光,再使用一束488 nm 環(huán)形光使偏離中心的蛋白分子轉(zhuǎn)化為非發(fā)射狀態(tài),最后收集熒光信號(hào)(圖4(e)).與STED 相比,在獲得相同分辨率的情況下,該技術(shù)所需要的光強(qiáng)可降低8 個(gè)數(shù)量級(jí).然而,該技術(shù)的成像速度取決光開關(guān)轉(zhuǎn)換速率.例如,基于綠色熒光蛋白rsEGFP 實(shí)現(xiàn)RESOLFT 技術(shù),其成像的激發(fā)功率密度僅為1 kW/cm2,實(shí)現(xiàn)了約36 nm 的成像分辨率,但該技術(shù)的單像素駐留時(shí)間卻需10—20 ms.為提高RESOLFT 技術(shù)成像速度,研究者發(fā)展了綠色熒光蛋白rsEGFP2,該蛋白的光轉(zhuǎn)換速率較快,掃描速度提升25—250 倍[52].但是,RESOLFT熒光探針依然存在著成像時(shí)間長(zhǎng)、光漂白等缺點(diǎn).為進(jìn)一步提高成像分辨率與降低光毒性及光漂白等問題,有研究者提出基于最少光子數(shù)的納米尺度定位技術(shù)(minimal photon fluxes,MINFLUX)作為一種新興納米級(jí)超高分辨顯微技術(shù)[53,54],使用空心光束作為泵浦光,調(diào)節(jié)光束中心的位置,當(dāng)熒光強(qiáng)度最小時(shí),熒光分子就被認(rèn)為在空心光束中心位置.其成像方式實(shí)現(xiàn)了1—3 nm 的超高空間分辨率.隨后研究者在MINFLUX 的基礎(chǔ)上又發(fā)展了MINSTED 技術(shù),更是讓分辨率突破納米量級(jí),獲得0.23 nm 的定位精度[55].MINFLUX 和MINSTED技術(shù)在空間分辨率上有著巨大優(yōu)勢(shì),但耗時(shí)很長(zhǎng).

為徹底解決光漂白問題,降低光毒性,實(shí)現(xiàn)超長(zhǎng)時(shí)程的超分辨成像,本課題組提出了上轉(zhuǎn)換超分辨顯微技術(shù).上轉(zhuǎn)換熒光納米探針(upconverting nanoparticles,UCNPs)具有近紅外激發(fā)、非線性強(qiáng)、光譜豐富可調(diào)、無(wú)熒光漂白等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),在解決傳統(tǒng)STED 面臨的激光光強(qiáng)過(guò)高、熒光漂白快、無(wú)法長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)、光毒性大、超快激光系統(tǒng)復(fù)雜等方面問題具有很大的潛力.2015年,Wu 等[56]首次實(shí)現(xiàn)了近紅外光束調(diào)控上轉(zhuǎn)換熒光損耗現(xiàn)象,獲得了30%的熒光損耗效率,為實(shí)現(xiàn)超低功率、無(wú)光漂白的上轉(zhuǎn)換超分辨開辟了新思路,提供了重要理論基礎(chǔ).2017年,為實(shí)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換超分辨顯微技術(shù),Zhan 等[57]利用“同種離子間交叉弛豫”構(gòu)建了高效的熒光損耗機(jī)理(圖5(a)),實(shí)現(xiàn)了96%的極高損耗效率和分辨率為66 nm 的超分辨顯微成像(圖5(b)),其所需損耗光強(qiáng)相比傳統(tǒng)STED 降低了至少2 個(gè)數(shù)量級(jí),克服了光漂白現(xiàn)象,并首次實(shí)現(xiàn)了上轉(zhuǎn)換探針標(biāo)記的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)成像.同年,Liu 等[58]報(bào)道了類似的相關(guān)現(xiàn)象和上轉(zhuǎn)換超分辨顯微技術(shù).為追求更極致的超分辨成像性能,2022年,Guo 等[59]結(jié)合上轉(zhuǎn)換發(fā)光的多光子非線性泵浦依賴特性,提出了受激輻射誘導(dǎo)激發(fā)損耗技術(shù)(stimulatedemission induced excitation depletion,STExD),可實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)STED 所不具有的熒光損耗非線性放大的獨(dú)特效應(yīng),逐級(jí)降低高能級(jí)熒光損耗所需要的飽和光強(qiáng),將損耗飽和光強(qiáng)陡降至42 kW/cm2量級(jí),較傳統(tǒng)STED 技術(shù)下降3 個(gè)數(shù)量級(jí),并獲得了～34 nm 的超分辨成像結(jié)果.同年,Pu 等[60]基于上轉(zhuǎn)換“光-物質(zhì)-能量吸收體”的熒光損耗理論,提出了表面遷移熒光損耗技術(shù)(surface-migration emission depletion,SMED),將傳統(tǒng)的損耗光引起受激輻射與激發(fā)光進(jìn)行低效率競(jìng)爭(zhēng),轉(zhuǎn)變?yōu)橐龑?dǎo)熒光能量向高容量能量吸收體轉(zhuǎn)移(圖5(c)),實(shí)現(xiàn)了極高效的熒光損耗,損耗效率可達(dá)95%,且飽和光強(qiáng)僅為18.3 kW/cm2量級(jí),較傳統(tǒng)STED 技術(shù)下降3—4 個(gè)數(shù)量級(jí).同時(shí),僅利用毫瓦級(jí)、近紅外、連續(xù)激光實(shí)現(xiàn)了分辨率高達(dá)17 nm 的超分辨顯微成像(圖5(d)).

圖5 上轉(zhuǎn)換超分辨成像技術(shù)示意圖(a) 交叉弛豫傳能熒光損耗機(jī)制[57];(b) 上轉(zhuǎn)換STED 超分辨成像結(jié)果[57];(c) 表面遷移熒光損耗機(jī)制[60];(d) SMED 超分辨成像結(jié)果[60];(e) Yb3+/Pr3+共摻雜納米顆粒的光子雪崩機(jī)制[61];(f) 光子雪崩超分辨成像結(jié)果[61]Fig.5.Schematic diagram of up-conversion super-resolution imaging technology:(a) Cross-relaxation energy transfer fluorescence loss mechanism[57];(b) up-conversion STED super-resolution imaging results[57];(c) surface migration fluorescence loss mechanism[60];(d) SMED super-resolution imaging results[60];(e) photon avalanche mechanism of Yb3+/Pr3+ co-doped nanoparticles[61];(f) photon avalanche super-resolution Resolution imaging results[61].

上轉(zhuǎn)換熒光除了可以被低光強(qiáng)激光實(shí)現(xiàn)高效熒光損耗外,還有具有超飽和非線性(n＜ 1)效應(yīng)與超高階多光子非線性(n＞ 1)效應(yīng).基于上轉(zhuǎn)換非線性效應(yīng)也可有效調(diào)制激發(fā)光斑,進(jìn)而改變成像點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)實(shí)現(xiàn)超分辨顯微成像.Wu 等[62]提出了利用單個(gè)低功率、波長(zhǎng)為808 nm 激光引發(fā)摻鉺上轉(zhuǎn)換探針產(chǎn)生超飽和非線性激發(fā)效應(yīng)(n=0.59),實(shí)現(xiàn)了無(wú)光漂白的熒光差分顯微技術(shù)的超飽和激發(fā)上轉(zhuǎn)換超分辨成像,分辨率達(dá)到了80 nm.同年,Chen 等[63]將該成像技術(shù)應(yīng)用深層成像,在93 μm厚的組織成像中,實(shí)現(xiàn)了50 nm 的分辨率.Huang等[44]構(gòu)建了激發(fā)正交的上轉(zhuǎn)換探針,在低光強(qiáng)、超飽和非線性激發(fā)下,實(shí)現(xiàn)了銩-藍(lán)光和鉺-綠光雙通道、無(wú)串?dāng)_的檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了單次掃描的熒光差分超分辨成像,分辨率高達(dá)54 nm 的超分辨成像,同時(shí)其成像時(shí)間縮短了1/2.為降低飽和熒光差分超分辨成像技術(shù)中對(duì)空心光束的依賴,僅用簡(jiǎn)易的高斯光來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨成像,有研究者提出基于非線性多光子效應(yīng)提高成像分辨率,其理論為dλ0/(2NAobj),其中dmin是橫向分辨最小距離;λ0是光在真空中的波長(zhǎng);NAobj是物鏡數(shù)值孔徑,N為非線性多光子數(shù).然而,傳統(tǒng)高階非線性多光子(N＞1)成像技術(shù)受限于激發(fā)波長(zhǎng)與非線性階數(shù)N彼此依賴的倍數(shù)關(guān)系,在發(fā)射波長(zhǎng)不變的情況下,多光子激發(fā)過(guò)程階數(shù)N越高,則需要波長(zhǎng)為N倍的高功率脈沖光激發(fā)實(shí)現(xiàn),這對(duì)于實(shí)現(xiàn)超分辨率成像存在理論上的困境.為克服這個(gè)難題,本課題組提出基于上轉(zhuǎn)換釹、鐿和銩三種摻雜的上轉(zhuǎn)換體系,實(shí)現(xiàn)了短波長(zhǎng)激發(fā)的高階非線性多光子發(fā)光.具體地,利用30 μW,730 nm 連續(xù)光激發(fā)實(shí)現(xiàn)了超衍射極限的高階非線性四光子(n=4)熒光成像,分辨率達(dá)到了161 nm.如同非線性效應(yīng)可在二維上壓縮點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù),同樣也可將該思路擴(kuò)展至三維成像.Denkova 等[64]利用980 nm 激發(fā)實(shí)現(xiàn)了非線性四光子熒光,獲得了三維高分辨成像.基于多光子激發(fā)的非線性可直接提高分辨率,是一個(gè)重要的、簡(jiǎn)單的超分辨成像方法,但是長(zhǎng)久以來(lái)傳統(tǒng)上轉(zhuǎn)換非線性階數(shù)并不高,一般多光子n=4—5,進(jìn)而無(wú)法實(shí)現(xiàn)100 nm 以內(nèi)的超分辨成像.近期,Lee 等[65]在銩離子上轉(zhuǎn)換體系中利用近紅外1064 nm 激發(fā)實(shí)現(xiàn)了基于納米光子雪崩效應(yīng),并據(jù)此實(shí)現(xiàn)了橫向～70 nm 的超分辨成像.但該探針熒光輻射波長(zhǎng)為800 nm,絕大部分探測(cè)器在此波段探測(cè)效率較低,不利于成像,此外,該體系雪崩熒光響應(yīng)時(shí)間慢(608 ms),難以應(yīng)用于生物成像.同一時(shí)期,本課題組基于鐿和鐠兩種摻雜離子實(shí)現(xiàn)了非線性階數(shù)為26 階的光子雪崩非線性效應(yīng),實(shí)現(xiàn)了約62 nm 的超分辨成像(圖5(e),(f)),同時(shí)基于鐿、鐠和銩三種離子摻雜上轉(zhuǎn)換體系提出了遷移光子雪崩概念,并結(jié)合能量傳遞及級(jí)聯(lián)激發(fā)實(shí)現(xiàn)了光子雪崩效應(yīng)放大,獲得了超高46 階非線性成像,實(shí)現(xiàn)了多細(xì)胞視野的實(shí)用超分辨成像技術(shù).非線性階數(shù)的大幅度提升使多光子成像成為突破衍射極限且分辨率可達(dá)60 nm 的超分辨成像技術(shù),同時(shí)成像系統(tǒng)具有極為簡(jiǎn)便、激光光強(qiáng)要求極低的優(yōu)勢(shì)[61].

4.2 點(diǎn)掃描三維超分辨成像技術(shù)

細(xì)胞結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化并不僅僅局限于二維層面,而是往往發(fā)生在三維層面.2000年,Klar 等[66]提出了利用加載了0/π 環(huán)形相位的損耗光對(duì)熒光進(jìn)行受激輻射損耗,獲得6 倍的軸向分辨率提高,實(shí)現(xiàn)了軸向分辨率為110 nm.Harke 等[67]報(bào)道的3D-STED 技術(shù)可實(shí)現(xiàn)xyz三個(gè)維度上的超分辨.通過(guò)同時(shí)引入0—2π 渦旋相位(橫向調(diào)制)以及0/π環(huán)形相位(軸向調(diào)制)兩束損耗光,對(duì)熒光PSF 進(jìn)行三維受激輻射損耗,如圖6(a),(b)所示.3D-STED實(shí)現(xiàn)了橫向43 nm 和軸向125 nm 的分辨率,如圖6(d)所示.為矯正成像像差,實(shí)現(xiàn)光束調(diào)制的靈活性,耶魯大學(xué)科研團(tuán)隊(duì)提出利用兩個(gè)空間光調(diào)制器分別替代0—2π 渦旋相位以及0/π 環(huán)形相位板,實(shí)現(xiàn)了具有自適應(yīng)光學(xué)(adaptive optics,AO)優(yōu)化像差能力的AO-3DSTED,獲得了更高的成像質(zhì)量,提高了3DSTED 深度成像的能力[68].為減少空間光調(diào)制器的使用,Lenz 等[69]更是通過(guò)巧妙的光路設(shè)計(jì),僅利用一個(gè)SLM 實(shí)現(xiàn)了AO-3DSTED,如圖6(c)所示.

盡管3D-STED 能實(shí)現(xiàn)三維超分辨,但橫向和軸向的分辨率通常相差2—3 倍.為解決此難題,2008年,Schmidt 等[70]結(jié)合3D-STED 以及4π 顯微鏡的技術(shù)優(yōu)勢(shì),提出了isoSTED,可獲得40—45 nm的各項(xiàng)同性分辨率.隨后,Chmyrov 等[71]將自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)加入isoSTED中,實(shí)現(xiàn)了AO-isoSTED技術(shù).如圖6(e)所示,損耗光的調(diào)制采用了單SLM方法,SLM 上分別加載了調(diào)制STEDxy的0—2π渦旋相位以及STEDz的離焦相位,圖6(e)右上方插圖分別展示了STEDxy,STEDz以及STEDtotal雙物鏡干涉的PSF.由于自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)的引入,使得AO-isoSTED 技術(shù)在實(shí)驗(yàn)中從整個(gè)30—35 μm厚生物樣品內(nèi)穩(wěn)定獲取了三維各向同性亞50 nm分辨率,并藉此對(duì)一系列亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了精細(xì)的三維超分辨成像,如圖6(f)所示.此外,B?hm 等[72]基于更低損耗光強(qiáng)的RESOLFT 提出了4Pi-RESOLFT 技術(shù),實(shí)現(xiàn)了30—50 nm 的三維超分辨成像.然而,由于RESOLFT 可逆光開關(guān)熒光蛋白的轉(zhuǎn)換速率較慢,如對(duì)400 μm3體積進(jìn)行三維成像需要160 min 之久,這極大地限制了RESOLFT 技術(shù)在三維動(dòng)態(tài)成像中的應(yīng)用.

5 超高時(shí)空分辨率點(diǎn)掃描成像技術(shù)

5.1 智能掃描超分辨成像技術(shù)

上述點(diǎn)掃描成像技術(shù)在空間分辨率方面展示了優(yōu)越的性能,可實(shí)現(xiàn)20—40 nm 分辨率,可清晰觀測(cè)亞細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu).但是,由于點(diǎn)掃描超分辨技術(shù)探測(cè)體積的縮小,所能探測(cè)的熒光光子數(shù)相應(yīng)減少,為保證相同的成像信噪比,一般會(huì)增加單像素掃描時(shí)間.同時(shí)為滿足奈奎斯特采樣定理,同一視野下超分辨所需像素?cái)?shù)更多,最終導(dǎo)致點(diǎn)掃描超分辨技術(shù)時(shí)間分辨率較差.為進(jìn)一步提高時(shí)間分辨率,有研究者提出了可總結(jié)為目標(biāo)引導(dǎo)的智能掃描超分辨成像技術(shù),其原理為控制掃描振鏡跳過(guò)視野內(nèi)沒有樣品的區(qū)域.基于目標(biāo)引導(dǎo)的智能掃描方式已有多項(xiàng)代表性技術(shù)被報(bào)道,如Staudt 等[74]在2011 年提出減少熒光“開關(guān)”狀態(tài)切換周期的智能點(diǎn)掃描技術(shù).如圖7(a)所示,在決策時(shí)間dT內(nèi),接收的光子數(shù)達(dá)到第1 閾值時(shí)激光器才會(huì)被接通,如果達(dá)到第2 閾值且讀出時(shí)間小于駐留時(shí)間,在剩余駐留時(shí)間中激光器會(huì)被關(guān)閉.該方法減少了激發(fā)光強(qiáng),且在保留空間分辨率的同時(shí),提高了成像速度,并且減低了高達(dá)8 倍的光漂白現(xiàn)象.另外,Dreier 等[75]于2019 年將智能掃描的概念應(yīng)用于RESOLFT 顯微術(shù).這種智能掃描點(diǎn)掃描的方法將RESOLFT 成像速度提高了6倍,并將體內(nèi)成像的光劑量降低70%—90%.

圖7 智能掃描超分辨成像技術(shù)示意圖(a) 智能RESOLFT 掃描機(jī)制[75];(b) etSTED 實(shí)驗(yàn)方案[76]Fig.7.Schematic diagram of intelligent scanning super-resolution imaging technology:(a) Smart RESOLFT scanning mechanism[75];(b) etSTED experimental scheme[76].

通過(guò)目標(biāo)引導(dǎo)的智能掃描超分辨成像技術(shù),可提供高時(shí)間分辨率.同時(shí),由于減少了無(wú)效照明,也有效降低了STED/RESOFLT 技術(shù)的光漂白問題,使其可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間超時(shí)空分辨成像.然而,有些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)所發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化是快速的,可能僅在毫秒至幾秒內(nèi)變化,成像過(guò)程中難以捕捉目標(biāo)區(qū)域.為此,有研究者提出了事件觸發(fā)的智能點(diǎn)掃描超分辨成像技術(shù)(event-triggered STED,etSTED)[76],其基本原理如圖7(b)所示,先用寬場(chǎng)快速成像對(duì)事件進(jìn)行檢測(cè)和定位,當(dāng)檢測(cè)到事件發(fā)生則切換為STED 模式,在事件坐標(biāo)周圍小塊區(qū)域按照預(yù)先設(shè)定的參數(shù)進(jìn)行采集.之后繼續(xù)寬場(chǎng)成像,不斷重復(fù)這個(gè)過(guò)程.該技術(shù)不僅使細(xì)胞整體應(yīng)力和光損傷最小化,還能夠顯著提高時(shí)間分辨率.與手動(dòng)采集整個(gè)研究樣本區(qū)域的STED 時(shí)間間隔相比,所選感興趣區(qū)域的成像速度快了100—5000 倍.

5.2 并行掃描超分辨成像技術(shù)

智能掃描超分辨技術(shù)方案依然依賴單點(diǎn)掃描和單點(diǎn)探測(cè)的成像方式,時(shí)間分辨率提升始終有限.為追求超高時(shí)間分辨率,2011年,Bingen 等[77]率先提出了四光束多點(diǎn)并行掃描的STED 技術(shù),該技術(shù)將成像速度提升至原來(lái)的4倍,同時(shí)增大了掃描視場(chǎng).但該技術(shù)方案需要每束激發(fā)光與空心光嚴(yán)格耦合實(shí)現(xiàn)同步掃描,并依賴多個(gè)點(diǎn)探測(cè)器,系統(tǒng)搭建較為復(fù)雜.為此,Bingen 等[77]提出了一種能更為簡(jiǎn)單、高效的產(chǎn)生并行空心光的方法,利用兩個(gè)正交且不相干的交叉駐波相疊加,產(chǎn)生超過(guò)10000 個(gè)空心光并行掃描的pRESOLFT 技術(shù),其原理如圖8(a)所示.與傳統(tǒng)RESOLFT 技術(shù)一樣,“ON”狀態(tài)聚焦光斑尺寸隨激發(fā)光強(qiáng)I 與飽和光強(qiáng)Is的比值增大而減小,如圖8(b)所示.由于大部分用于RESOLFT 技術(shù)的可逆蛋白R(shí)SFPs 的“開關(guān)”速率相對(duì)較慢,在～10 μm 成像視野下,傳統(tǒng)點(diǎn)掃描RESOLFT 技術(shù)成像時(shí)間所需為20—30 min[78,79].相比傳統(tǒng)點(diǎn)掃描RESOLFT 技術(shù),利用上萬(wàn)個(gè)空心光并行掃描的成像方式,可在 120 μm × 100 μm的超大視野下,以＜1 s 的時(shí)間分辨率實(shí)現(xiàn)～77 nm超分辨活細(xì)胞成像,如圖8(c)所示.同樣地,Bergermann 等[80]也利用上述基本原理,將其擴(kuò)展至多色并行掃描STED 成像.

圖8 并行掃描超分辨成像技術(shù)示意圖(a) pRESOLFT 系統(tǒng)簡(jiǎn)化圖[71];(b) pRESOLFT “ON” 狀態(tài)下不同 I/Is 的二維強(qiáng)度分布圖[71];(c) pRESOLFT 納米顯微鏡的活細(xì)胞成像[71];(d) 3D-pRESOLFT 三種模式的駐波疊加產(chǎn)生蜂窩狀照明陣列[81];(e) 3DpRESOLFT 納米顯微鏡的活細(xì)胞成像[81]Fig.8.Schematic diagram of parallel scanning super-resolution imaging technology:(a) Simplified schematic of pRESOLFT system[71];(b) 2D profiles of the on-state probability distribution for different I/Is [71];(c) live-cell imaging with pRESOLFT nanoscopy[71];(d) three patterns of standing waves are superimposed to create a honeycomb lighting array in 3D-pRESOLFT[81];(e) live-cell imaging with 3D-pRESOLFT nanoscopy[81].

上述并行掃描成像技術(shù),使其在二維上具備了超高時(shí)空分辨的性能,為實(shí)現(xiàn)各向同性的三維超高時(shí)空分辨率成像,Boden 等[81]使用3 種不同的駐波圖案的相干疊加來(lái)創(chuàng)建一個(gè)蜂窩狀的三維照明陣列,即3D-pRESOLET 技術(shù),如圖8(d)所示.在40 μm×40 μm 成像視野下,3D-pRESOLET 技術(shù)可實(shí)現(xiàn)1—2 Hz 的時(shí)間分辨率,并具有亞80 nm的三維各向同性分辨率.3D-pRESOLET 與單束點(diǎn)掃描成像方案相比,掃描步驟大大減少,將一個(gè)體積(40 μm×40 μm×1.6 μm)的記錄時(shí)間從4.4 h縮短到78 s,如圖8(e)所示.

為了直觀對(duì)比上述相關(guān)技術(shù),表2 從空間分辨率、時(shí)間分辨率、激光類型及波長(zhǎng)、激發(fā)光強(qiáng)、光漂白程度、成像深度以及是否需要重構(gòu)算法等多個(gè)方面進(jìn)行了詳細(xì)闡述.例如,STED 技術(shù)雖提高了空間分辨率,但激發(fā)光強(qiáng)都需要數(shù)倍的提升,進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的光漂白,難以在活細(xì)胞成像中應(yīng)用.RESOFLT 技術(shù)基于超低激發(fā)光強(qiáng),極大程度地降低了光毒性和光漂白,但時(shí)間分辨率相對(duì)較差,難以實(shí)現(xiàn)快速動(dòng)態(tài)成像.為提高成像速度,以并行掃描成像方式為主的MSIM,pRESOFLT 等技術(shù)相繼發(fā)展,但該類技術(shù)的空間分辨率提升有限.isoSTED 帶來(lái)了各向同性的超高三維空間分辨率,但也同樣面臨著高激發(fā)光強(qiáng)、光漂白嚴(yán)重的問題,同時(shí)復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)對(duì)系統(tǒng)穩(wěn)定性是極大的挑戰(zhàn).基于上轉(zhuǎn)換納米探針的UCNP-STED 技術(shù)相比傳統(tǒng)STED 技術(shù)降低激發(fā)光強(qiáng)3—4 個(gè)數(shù)量級(jí),極大程度地降低了光毒性,同時(shí)利用近紅外光激發(fā),降低了光在樣品傳播中的散射效應(yīng),可提高成像深度,并且連續(xù)光的使用,極大地簡(jiǎn)化了系統(tǒng)復(fù)雜性,此外完全無(wú)光漂白的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),可使其在超分辨領(lǐng)域有著很大的潛力.MINFLUX 和MINSTED 雖在嚴(yán)格意義上不屬于點(diǎn)掃描成像技術(shù),但其創(chuàng)新性地將STED 技術(shù)以及單分子定位技術(shù)相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了超高的空間分辨率,使光學(xué)顯微鏡分辨率實(shí)現(xiàn)了單納米尺度的突破,但時(shí)間分辨率相當(dāng)較慢,通常為分鐘量級(jí),難以實(shí)現(xiàn)快速動(dòng)態(tài)成像.

表2 不同點(diǎn)掃描超分辨成像技術(shù)的關(guān)鍵性能指標(biāo)對(duì)比Table 2.Overview of point-scanning super-resolution fluorescence microscopy techniques.

5.3 深度學(xué)習(xí)助力超高時(shí)空分辨率成像

深度學(xué)習(xí)在圖像識(shí)別和圖像重建等方面具有優(yōu)越性能,已被應(yīng)用于點(diǎn)掃描熒光顯微成像技術(shù)中.深度學(xué)習(xí)與STED 結(jié)合,可以有效克服STED技術(shù)中光漂白嚴(yán)重,光毒性高及系統(tǒng)復(fù)雜等問題,并獲得超高時(shí)空分辨率(圖9(a)),使STED 技術(shù)更有利于應(yīng)用于活細(xì)胞成像.2019年,Wang 等[82]基于生成對(duì)抗網(wǎng)絡(luò)(generative adversarial network,GAN)實(shí)現(xiàn)了跨模態(tài)超分辨成像技術(shù).如利用20 nm熒光珠的共聚焦圖像作為輸入數(shù)據(jù),通過(guò)GAN 網(wǎng)絡(luò)輸出了與STED 圖像極為接近的結(jié)果,成功分辨間距為130 nm 的兩個(gè)小球,如圖9(b)所示.2020年,Li 等[83]基于GAN 架構(gòu),提出了SRGAN方法,使用STED 點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的先驗(yàn)知識(shí)和單元格的結(jié)構(gòu)信息來(lái)生成用于網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練的模擬標(biāo)記數(shù)據(jù)對(duì),該方法可以將60 nm 分辨率的STED 圖像提高到30 nm 分辨率.同年,Chen 等[84]改良的殘差通道注意力網(wǎng)絡(luò)(residual channel attention networks,RCAN)模型用來(lái)對(duì)3D 時(shí)延圖像進(jìn)行超分辨率的重構(gòu)或者去噪,使用RCAN 在共聚焦顯微鏡中實(shí)現(xiàn)去噪和分辨率的提高,在STED 顯微成像中實(shí)現(xiàn)約2.5 倍的橫向分辨率增強(qiáng),如圖9(c)所示.2023年,Ebrahimi 等[85]用深度學(xué)習(xí)對(duì)STED圖像進(jìn)行去噪,通過(guò)減少像素停留時(shí)間來(lái)減輕光漂白和光損傷.使用20 個(gè)圖像數(shù)據(jù)集,將短像素停留時(shí)間的低信噪比STED 圖像和長(zhǎng)像素停留時(shí)間的高信噪比STED 圖像作為輸入圖像對(duì)來(lái)訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò).將STED 顯微鏡的像素停留時(shí)間縮短1/40 以上,同時(shí)提高了預(yù)測(cè)精度,保持了去相關(guān)分析評(píng)估的STED 圖像的橫向分辨率,如圖9(d)所示.深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型的建立可以助力于點(diǎn)掃描成像技術(shù)中空間分辨率和時(shí)間分辨率的提高,使得傳統(tǒng)點(diǎn)掃描超分辨成像技術(shù)具有超高時(shí)空分辨成像性能,更有利于實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的快速動(dòng)態(tài)成像.

圖9 深度學(xué)習(xí)助力超高時(shí)空分辨率成像示意圖(a) 深度學(xué)習(xí)提高圖像分辨率;(b) GAN 網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練結(jié)果[82];(c) RCAN 網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練結(jié)果[84];(d) Unet-RCAN 網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練結(jié)果[85]Fig.9.Schematic diagram of deep learning-assisted ultra-high spatial-temporal resolution imaging:(a) Deep learning improves image resolution;(b) GAN network training results[82];(c) RCAN network training results[84];(d) Unet-RCAN network training results[85]

6 總結(jié)與展望

本文主要介紹了多種激光點(diǎn)掃描顯微成像技術(shù)的基本原理和最新研究進(jìn)展.傳統(tǒng)點(diǎn)掃描顯微鏡具有分辨率高、信噪比高、可光學(xué)層切和動(dòng)態(tài)成像等優(yōu)勢(shì),已成為科學(xué)研究中的重要工具.但基于點(diǎn)掃描成像技術(shù)還有諸多方面需要進(jìn)一步探究.1) 在空間分辨率方面,傳統(tǒng)點(diǎn)掃描顯微鏡仍未突破衍射極限,無(wú)法觀察到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及蛋白分子的相互作用.同時(shí)傳統(tǒng)點(diǎn)掃描顯微鏡由于采用高能量密度的聚焦光斑進(jìn)行掃描成像,通常會(huì)導(dǎo)致的光漂白和光毒性問題,在長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞觀測(cè)的應(yīng)用中面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn).2) 在時(shí)間分辨率方面,傳統(tǒng)點(diǎn)掃描顯微鏡基于串行光柵掃描成像模式極大地限制了成像速度.尤其針對(duì)樣品進(jìn)行大視野(高像素)成像時(shí),點(diǎn)掃描顯微鏡需要重復(fù)數(shù)百萬(wàn)次掃描才能遍歷整個(gè)樣品區(qū)域,這無(wú)疑限制了其在快速獲取大量數(shù)據(jù)或觀察快速動(dòng)態(tài)過(guò)程的應(yīng)用.

為解決上述問題,在提高空間分辨率方面,研究人員做出諸多努力,發(fā)展了諸如受激輻射損耗顯微鏡等突破衍射極限的超分辨率點(diǎn)掃描成像技術(shù).在提高時(shí)間分辨率方面,研究人員陸續(xù)開發(fā)出并行掃描的高時(shí)間分辨率顯微成像技術(shù).目前,所報(bào)道的多種點(diǎn)掃描成像技術(shù)分別在時(shí)間分辨率或者空間分辨率方面各有優(yōu)勢(shì),但如何將二者有機(jī)的融合在一起,發(fā)展新一代具備超高時(shí)空分辨率的點(diǎn)掃描成像技術(shù)是未來(lái)研究的重要趨勢(shì).例如,諸多研究者也在開發(fā)并探索新型超分辨技術(shù),如在超高空間分辨率上,利用MINFLUX 技術(shù)和MINSTED 技術(shù)可實(shí)現(xiàn)納米級(jí)分辨率,以及毫秒級(jí)蛋白追蹤.在超時(shí)間分辨率上,泵浦-探測(cè)(pump-probe)顯微鏡結(jié)合了超快激光領(lǐng)域的泵浦-探測(cè)技術(shù)以及顯微成像技術(shù),其時(shí)間分辨率達(dá)到皮秒甚至飛秒量級(jí),在生物和化學(xué)領(lǐng)域具有重要意義[86-88],該技術(shù)與現(xiàn)有超分辨技術(shù)相結(jié)合有望發(fā)展為兼顧高時(shí)空分辨率的成像技術(shù)[89].

總之,激光點(diǎn)掃描顯微鏡在空間分辨率、時(shí)間分辨率以及技術(shù)融合等方面仍面臨著很多挑戰(zhàn),同時(shí)也蘊(yùn)藏著巨大的發(fā)展?jié)摿?隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新發(fā)展,兼具超高時(shí)空分辨率的點(diǎn)掃描熒光顯微鏡將持續(xù)為生命科學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和技術(shù)進(jìn)步提供重要的工具,為人類對(duì)生物體的理解和認(rèn)識(shí)帶來(lái)新的突破.