侯保秋，董怡文，劉方

（1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，鄭州 450052；2.西藏民族大學(xué)，陜西咸陽(yáng) 712000）

0 引言

炎癥性腸?。↖BD）是一種以非特異性為特征的慢性自身免疫性疾病[1]，主要包括克羅恩病（CD）和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)[2-3]，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床癥狀表現(xiàn)為持續(xù)性的腹瀉，腹部疼痛，發(fā)熱，嘔吐等[4-5]。IBD的發(fā)病率和流行范圍日益增加，我國(guó)是亞洲發(fā)病率最高的國(guó)家之一，已有超過(guò)150 萬(wàn)的人群患有此病[6-7]。目前，有多種方法可應(yīng)用于腸道炎癥的治療，其中常規(guī)藥物治療被廣泛應(yīng)用，但長(zhǎng)期服藥會(huì)給機(jī)體帶來(lái)不可避免的副作用[8]。因此，需尋求安全可靠且無(wú)副作用的治療方式來(lái)緩解腸道炎癥[9]。益生菌制劑輔助治療是一種安全可靠的方式，可以通過(guò)改善腸道屏障、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等方面緩解炎癥性腸病[10-12]，最常見(jiàn)的益生菌制劑有乳酸桿菌和雙歧桿菌[13-15]。Liu 等[16]使用植物乳桿菌23-1 對(duì)肥胖小鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明干預(yù)后可有效緩解肥胖引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。Kaur 等[17]評(píng)估了含有鼠李糖乳桿菌MTCC-5897 的乳清對(duì)DSS 誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的潛在保護(hù)作用，結(jié)果表明經(jīng)乳清干預(yù)后，腸道中促炎因子水平顯著降低，抗炎因子水平顯著提高，推測(cè)其可以有效預(yù)防結(jié)腸炎誘導(dǎo)的炎癥。因此，本研究以副干酪乳桿菌L.paracasei ZZ102 為研究對(duì)象，通過(guò)灌胃不同劑量來(lái)探究對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥的緩解作用。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞及試驗(yàn)小鼠

11 株菌株均為實(shí)驗(yàn)室保藏的分離自牦牛乳中的乳酸桿菌，具體信息如表1 所示。所用細(xì)胞為Caco-2細(xì)胞（人克隆結(jié)腸癌細(xì)胞），購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。試驗(yàn)動(dòng)物為48 只雄性C57BL/6 小鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

表1 試驗(yàn)菌株相關(guān)信息

1.2 試劑

MRS 瓊脂培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；PBS 緩沖液，北京索來(lái)寶生物科技有限公司；胰酶，Hyclone 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)液，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；葡聚糖硫酸鈉，美國(guó)MP Biomedical 公司；美沙拉嗪，杭州巴洛特生物科技有限公司；MPO 檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；各細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設(shè)備

電子天平，瑞士Mettler Toledo 有限公司；超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma 有限公司；恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；Quick Drop 測(cè)定儀，美國(guó)Bio-rad 公司。

1.4 菌株的活化與保藏

取凍存管中的菌液，以5%的接種量于MRS 肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，獲得一代菌液。取一代菌液進(jìn)行三區(qū)劃線，37 ℃培養(yǎng)48～72 h 后挑取單菌落至MRS 肉湯中繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h。將最終菌液與80%（V/V）滅菌后的甘油以3∶1 的比例混勻，-80 ℃保藏備用。

1.5 乳酸菌的篩選

1.5.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

將Caco-2 細(xì)胞從液氮中取出，迅速放置于37 ℃水浴鍋解凍，之后接種于DMEM 高糖培養(yǎng)液中，于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)日，次日更換細(xì)胞培養(yǎng)液，當(dāng)有80%左右的細(xì)胞貼壁且鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部時(shí)即可進(jìn)行傳代，傳至3 代平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶的單層細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.5.2 乳酸菌與細(xì)胞共培養(yǎng)

將菌液離心后收集菌體，然后重懸于DMEM 高糖培養(yǎng)液中。將細(xì)胞（每孔106個(gè)）接種于六孔板中，待細(xì)胞培養(yǎng)至極化狀態(tài)后，將重懸于DMEM 高糖培養(yǎng)液的乳酸菌與細(xì)胞共同培養(yǎng)2 h 后進(jìn)行后續(xù)研究（細(xì)胞培養(yǎng)液需在乳酸菌加入前的24 h 更換為不含抗生素的培養(yǎng)基）。

1.5.3 黏附率測(cè)定

乳酸菌與細(xì)胞共培養(yǎng)后，用滅菌后的PBS 進(jìn)行洗滌，并用胰酶消化收集的細(xì)胞，然后使用無(wú)菌生理鹽水稀釋到合適濃度后進(jìn)行涂布，于37 ℃培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。黏附率公式如下：

黏附率=黏附后的菌落數(shù)/黏附前的菌落數(shù)×100

1.6 試驗(yàn)動(dòng)物分組

試驗(yàn)動(dòng)物選用6～8 周、雄性C57BL/6 小鼠，體重為（20±2）g，動(dòng)物倫理審核編號(hào)KY2021004。48 只小鼠基礎(chǔ)飼料、飲用水喂養(yǎng)一周后被隨機(jī)分為6 組（n=8只/組）：Control（對(duì)照組）、DSS（DSS 組）、DSS+106L.paracasei ZZ102（低劑量組）、DSS+107L.paracasei ZZ102（中劑量組）、DSS+108L.paracasei ZZ102（高劑量組）以及DSS+美沙拉嗪（藥物組）。從第8 d 起直至結(jié)束，每天上午同一時(shí)間，低、中、高劑量組分別灌胃106、107和108CFU/mL 的L.paracasei ZZ102 菌懸液200 μL，藥物組小鼠灌胃10 mg/mL 的美沙拉嗪200 μL，其余兩組灌胃相同量的生理鹽水。從第15 天開(kāi)始，除對(duì)照組飲用正常純凈水外，其他組小鼠的飲用水均加入3%（W/V）的DSS 溶液，構(gòu)建結(jié)腸炎小鼠的模型。動(dòng)物試驗(yàn)的具體分組情況如表2 所示。

表2 動(dòng)物試驗(yàn)的基本情況

1.7 結(jié)腸炎的評(píng)估

1.7.1 體重

建模期間，每天稱量小鼠體質(zhì)量并計(jì)算體質(zhì)量下降率。具體計(jì)算方法如下：

體質(zhì)量下降率=（W1-W2）/W1×100

W1：第14 d 的小鼠體質(zhì)量（g），W2：15～21 d 的小鼠體質(zhì)量（g）。

1.7.2 脾臟指數(shù)

脾臟指數(shù)的計(jì)算方法如下：

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/最終體質(zhì)量×10

1.7.3 髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性

小鼠處死后，收集全血，離心收集血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ⌒∈笱逶? ℃、3 000 r/min 離心20 min得到上清液。按照MPO 檢測(cè)試劑盒對(duì)各組血清MPO的活性進(jìn)行測(cè)定。

1.7.4 結(jié)腸細(xì)胞因子

取小鼠結(jié)腸組織（30 mg 左右），剪碎后置于研缽中，以1∶9 的比例加入9 倍預(yù)冷的無(wú)菌PBS 溶液研磨成漿液后以3 000 r/min 離心20 min，收集上清于-20 ℃保存。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 含量的測(cè)定。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 8.02 軟件作圖并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。所有試驗(yàn)重復(fù)3 次

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌株黏附能力的差異

乳酸菌與腸上皮細(xì)胞的特異性黏附能力的強(qiáng)弱是其發(fā)揮益生作用的關(guān)鍵[13]。各乳酸菌菌株與Caco-2細(xì)胞的黏附結(jié)果如圖1 所示。從圖1 可以看出，L.casei ZZ085、L.paracasei ZZ102 和L.plantarum ZZ112具有較高的黏附率，其中L.paracasei ZZ102 的黏附率最高，達(dá)到了78.39%。剩余菌株的黏附率在19.78%到68.49%之間不等，與L.paracasei ZZ102 相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。因此，本研究選取L.paracasei ZZ102進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 不同菌株的黏附率

2.2 L.paracasei ZZ102 對(duì)小鼠常規(guī)指標(biāo)的影響

2.2.1 體重

小鼠的體質(zhì)量變化情況如圖2 所示。由圖可以看出，造模期間Control 組小鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)輕微上升趨勢(shì)，而其他組小鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)。在整個(gè)造模期間，DSS 組小鼠體質(zhì)量與初始體重相比下降了17%，下降趨勢(shì)最大；其次為灌胃低、中劑量L.paracasei ZZ102 的小鼠，體質(zhì)量分別下降了16.67%和15%。與DSS 組相比，灌胃高劑量L.paracasei ZZ102 和美沙拉嗪組的小鼠體質(zhì)量下降明顯減少，分別下降了13.67%和10%，表明灌胃L.paracasei ZZ102 和美沙拉嗪可以緩解小鼠的體質(zhì)量下降趨勢(shì)。

圖2 小鼠體質(zhì)量變化

2.2.2 脾臟質(zhì)量與脾臟指數(shù)

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，是免疫細(xì)胞居住和產(chǎn)生應(yīng)答的重要產(chǎn)所[18-19]。從圖3 中可以看出，與Control組相比，其余5 組小鼠的脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)均有所增加，其中DSS 組增加最為明顯。灌胃低、中、高劑量的L.paracasei ZZ102 小鼠的脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)均有所下降，其中灌胃高劑量L.paracasei ZZ102 小鼠的脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)下降最為明顯，表明灌胃L.paracasei ZZ102 可以有效改善結(jié)腸炎小鼠的脾腫大，進(jìn)一步調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。

圖3 小鼠脾臟質(zhì)量與脾臟指數(shù)變化

2.2.3 血清MPO 活性

MPO 活性是衡量結(jié)腸炎炎癥程度的重要指標(biāo)之一，與腸道炎癥呈正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)還可進(jìn)入到細(xì)胞外液參與循環(huán)[20]。通過(guò)灌胃不同劑量L.paracasei ZZ102 來(lái)探究小鼠血清MPO 活性的變化，結(jié)果如圖4 所示。由圖可以看出，與Control 組相比，DSS 組的MPO 活性顯著提高（P＜0.0001）。與DSS 組相比，低、中、高劑量組和藥物組MPO 活性均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P＜0.0001）。其中灌胃106、107、108L.paracasei ZZ102 組的MPO 活性分別為0.224 U/mL、0.208 U/mL、0.194 U/mL，隨著L.paracasei ZZ102 劑量的增加，MPO 的活性逐漸降低，因此MPO 活性變化對(duì)L.paracasei ZZ102 呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，表明灌胃L.paracasei ZZ102 可以在一定程度上顯著降低小鼠的炎癥水平。

圖4 MPO 活性變化

2.3 L.paracasei ZZ102 對(duì)小鼠炎癥因子質(zhì)量濃度的影響

2.3.1 促炎因子

在正常情況下，腸道內(nèi)的促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但當(dāng)腸道炎癥發(fā)生時(shí)，腸道內(nèi)促炎因子數(shù)量表達(dá)過(guò)多，抗炎因子表達(dá)過(guò)少，腸道內(nèi)的平衡狀態(tài)會(huì)被破壞[21-24]。乳酸菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫細(xì)胞因子的分泌來(lái)發(fā)揮其免疫作用[25]。其中促炎因子TNF-α、IL-6 和IL-1β是反應(yīng)炎癥程度的常規(guī)指標(biāo)[26-27]。促炎因子的結(jié)果如圖5(a)～5(c)所示，與Control 組相比，DSS 組小鼠的促炎因子TNFα、IL-1β和IL-6 均顯著升高，表明由DSS 誘導(dǎo)炎癥程度增加，進(jìn)而誘導(dǎo)了多種促炎因子的分泌。與DSS組相比，灌胃低、中、高劑量L.paracasei ZZ102 以及美沙拉嗪干預(yù)的小鼠的TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量均有不同程度的降低，表明灌胃L.paracasei ZZ102 以及藥物干預(yù)均可以對(duì)結(jié)腸炎有一定的緩解作用。對(duì)于低、中、高劑量組而言，其中灌胃高劑量L.paracasei ZZ102 的效果最好，因此，促炎因子的分泌量表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

2.3.2 抗炎因子

抗炎因子IL-10 的含量變化如圖5(d)所示，與Control 組比，DSS 組小鼠的IL-10 表達(dá)量輕微上升，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與Control 以及DSS 組相比，灌胃106、107和108L.paracasei ZZ102 的小鼠IL-10 的分泌量均顯著上調(diào)，且呈現(xiàn)劑量依賴性，同時(shí)美沙拉嗪組IL-10 的分泌量也呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（P＜0.01）。因此結(jié)果表明本研究中灌胃L.paracasei ZZ102 后可以增加抗炎細(xì)胞因子IL-10 的分泌，達(dá)到緩解小鼠的腸道炎癥的作用。

3 結(jié)論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種非特異性、反復(fù)發(fā)作的慢性疾病，近幾年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[28]，其發(fā)病機(jī)制受遺傳、免疫、飲食、環(huán)境等多種因素影響。目前對(duì)于結(jié)腸炎的治療主要集中在免疫抑制劑、氨基水楊酸制劑等領(lǐng)域[29]，但這些藥物價(jià)格昂貴且治療效果不佳，需尋求天然無(wú)明顯副作用的藥物來(lái)治療潰瘍性結(jié)腸炎。陳巖勤等[30]研究表明微生態(tài)制劑可以降低TNF-α、IL-6、IL-17A 分泌水平,提高IL-10 含量,并有助于維持腸黏膜上皮細(xì)胞的完整，保持腸黏膜屏障功能。

本研究將篩選出的黏附能力最強(qiáng)的菌株L.paracasei ZZ102 應(yīng)用于由DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型，通過(guò)研究表明L.paracasei ZZ102 可以有效改善小鼠的體質(zhì)量減小、脾臟指數(shù)升高、MPO 活性升高等情況。通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸組織細(xì)胞因子表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同劑量的L.paracasei ZZ102 灌胃后，促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量顯著降低，抗炎因子IL-10 的含量顯著升高，且與L.paracasei ZZ102 劑量呈現(xiàn)相關(guān)性。綜上所述，益生菌制劑可有效緩解小鼠的腸道炎癥，可為基于微生物法的靶向治療IBD 提供理論參考，同時(shí)也為臨床治療腸道炎癥提供依據(jù)。