宗麗娜，錢易，魯茂林，王文瓊，陳大衛(wèi)，顧瑞霞

（揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225127）

0 引言

食品發(fā)酵已成為提高生物利用度、改善理化和感官特性以及提供健康益處的有效方法[1]。但豆乳經(jīng)發(fā)酵后，會(huì)產(chǎn)生令人不快的豆腥味，降低了消費(fèi)者的接受度。目前，發(fā)酵豆乳相關(guān)研究?jī)H以單獨(dú)發(fā)酵豆乳或發(fā)酵豆乳和牛乳混合物為研究對(duì)象，大多以發(fā)酵豆乳抗氧化能力、異黃酮苷元、酶活性等為主要研究?jī)?nèi)容[2-3]，有研究介紹了發(fā)酵豆乳貯藏期間后酸化、穩(wěn)定性下降等問(wèn)題，并通過(guò)添加益生元、篩選后酸化弱、產(chǎn)黏好的菌株及多菌株組合的方法來(lái)提高發(fā)酵豆乳貯藏期的品質(zhì)[4]，MIN-LANG H 等[5]研究通過(guò)輔助添加橙皮纖維和銀耳發(fā)酵粉益生元改善發(fā)酵豆乳貯藏期的后酸化及穩(wěn)定性問(wèn)題。研究顯示通過(guò)不同微生物進(jìn)行組合來(lái)提高發(fā)酵豆乳品質(zhì)[6-7]，不同微生物種類直接影響發(fā)酵豆乳的代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸、肽和香氣成分等，進(jìn)而影響發(fā)酵豆乳的感官特性、理化特性和功能特性，多菌株組合可減少貯藏期pH 的下降、脫水收縮，提高發(fā)酵豆乳的抗氧化能力和產(chǎn)生更多的香氣成分[7-9]。但少有研究通過(guò)不同混合發(fā)酵方式來(lái)探究發(fā)酵豆乳產(chǎn)品貯藏期的品質(zhì)。

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳在貯藏中后期14～28 d 質(zhì)構(gòu)下降[10]、持水力降低[11]。持水力、質(zhì)構(gòu)與發(fā)酵乳的品質(zhì)密切相關(guān)[12]，理想的發(fā)酵乳在貯藏期內(nèi)應(yīng)具有良好質(zhì)地及感官品質(zhì)，不應(yīng)出現(xiàn)乳清析出的現(xiàn)象，改善發(fā)酵乳的流變特性，提高其儲(chǔ)存模量和損失模量的比值可減少發(fā)酵乳乳清析出及脫水收縮問(wèn)題[13]。本研究采用3種不同混合發(fā)酵方式制備發(fā)酵混合豆乳，通過(guò)對(duì)其貯藏期的酸度、pH、活菌數(shù)、黏度、持水力、質(zhì)構(gòu)、流變特性及感官評(píng)分衡量不同混合發(fā)酵方式對(duì)產(chǎn)品貯藏期品質(zhì)的影響。以確保發(fā)酵豆乳產(chǎn)品在貯藏期具有良好的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂乳，揚(yáng)州大學(xué)康源乳業(yè)有限公司；大豆、蔗糖、小蘇打，市售；商業(yè)發(fā)酵劑，江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；氫氧化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS 肉湯、M17 肉湯，海博生物。

1.2 儀器與設(shè)備

PL2002 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；pHB -3B 精密型pH 計(jì)，上海雷磁儀器廠；H-1650 離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SWCJ-1F 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；GYB60-08 超高壓均質(zhì)機(jī)，上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；JF-SX-500 高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY 公司；SPX-150FS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Malvern Kinexus Pro 旋轉(zhuǎn)流變儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.3 混合發(fā)酵豆乳的制備工藝流程

大豆經(jīng)清洗后，用0.3%NaHCO3水溶液浸泡16 h（干豆∶水=1∶3）、洗滌2～3 次，沸水滅酶8 min，按一定比例制備豆乳，20 MPa 均質(zhì)，經(jīng)95～100 ℃熱處理10 min，冷卻備用。

11.5%全脂乳中添加蔗糖，混合均勻，20 MPa 均質(zhì)，經(jīng)過(guò)95 ℃，5 min 熱處理，冷卻至42 ℃，接種2%乳酸菌發(fā)酵劑，42 ℃培養(yǎng)。

樣品1：牛乳與豆乳按1.5∶1 比例混合后再發(fā)酵；樣品2：?jiǎn)为?dú)發(fā)酵牛乳，再與豆乳按1.5∶1 比例混合（將豆乳緩慢添加至發(fā)酵牛乳中，3 kg 物料500 r/min 攪拌1 min）；樣品3：?jiǎn)为?dú)發(fā)酵牛乳，4 ℃后酸化24 h后，再與豆乳按1.5∶1 比例混合（將豆乳緩慢添加至發(fā)酵牛乳中，3 kg 物料500 r/min 攪拌1 min）。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 酸度和pH 值測(cè)定

酸度測(cè)定參照GB5009.239—2016 中酸度的測(cè)定方法酚酞指示劑方法測(cè)定。pH 的測(cè)定采用精密型pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 活菌數(shù)測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品中微生物的數(shù)量，其中，嗜熱鏈球菌采用M17 培養(yǎng)基培養(yǎng)，保加利亞乳桿菌采用MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)?；罹鷶?shù)參照GB4789.2—2016 的方法測(cè)定。

1.4.3 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定發(fā)酵混合豆乳質(zhì)構(gòu)。測(cè)定參考文獻(xiàn)[14]的方法，對(duì)發(fā)酵混合豆乳的內(nèi)聚性和咀嚼性指數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.4.4 持水力測(cè)定

持水力測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]的方法，稍作修改。稱取空離心管質(zhì)量m0，取8 mL 發(fā)酵乳樣品于10 mL 離心管中，記錄質(zhì)量為m1，4 000 r/min 條件下離心10 min，棄去上清液，記錄質(zhì)量m2。

式中：W 為部分發(fā)酵混合豆乳持水力（%）；m0為空離心管質(zhì)量（g）；m1為部分發(fā)酵混合豆乳和離心管總重量（g）；m2為離心去上清后樣品和離心管的重量（g）。

1.4.5 黏度測(cè)定

黏度測(cè)定參考文獻(xiàn)[4]的方法，稍作修改。選用4號(hào)轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速為30 r/min。

1.4.6 流變特性流變特性參考文獻(xiàn)[15]的方法，對(duì)發(fā)酵混合豆乳的表觀黏度和剪切應(yīng)力進(jìn)行測(cè)定。

1.4.7 感官評(píng)分

感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照參考文獻(xiàn)[16]，稍作修改。感官評(píng)定小組由乳品實(shí)驗(yàn)室10 名研究生組成，該小組研究生均經(jīng)過(guò)發(fā)酵乳和發(fā)酵豆乳的感官培訓(xùn)，評(píng)定小組成員從產(chǎn)品色澤、滋味、氣味和組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 發(fā)酵混合豆乳感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用Origin 2021 軟件進(jìn)行繪圖，使用Statistix 8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同混合發(fā)酵方式的發(fā)酵豆乳貯藏期酸度和pH 變化

發(fā)酵混合豆乳貯藏期間酸度和pH 的變化如圖1所示，在0～30 d 貯藏期間，產(chǎn)品的酸度逐漸增加，pH逐漸降低，這是由于產(chǎn)品后酸化所致，菌株能夠利用發(fā)酵混合豆乳中殘留的糖類，使其繼續(xù)產(chǎn)酸[17]。在4 ℃貯藏期間，牛乳與豆乳按1.5∶1 比例混合后再發(fā)酵方法制備的樣品1 酸度顯著增加（P＜0.5），從72.15 °T增加到90.60 °T；pH 顯著降低（P＜0.5），從4.38 降低至4.01，在該條件下制備的樣品1 后酸化程度較大。單獨(dú)發(fā)酵牛乳，再與豆乳按1.5∶1 比例混合方法制備的樣品2 和單獨(dú)發(fā)酵牛乳，4 ℃后酸化24 h 后，再與豆乳按1.5∶1 比例混合方法制備的樣品3 后酸化程度顯著低于樣品1（P＜0.5），此2 種條件下樣品的酸度在貯藏期內(nèi)后酸化程度較弱，貯藏30 d 時(shí)，樣品2 和樣品3 的酸度增加量小于4.50 °T，是由于單獨(dú)發(fā)酵牛乳，發(fā)酵牛乳需要達(dá)到110 °T 才能滿足混合后終產(chǎn)品酸度，乳酸菌在發(fā)酵乳中已經(jīng)處于穩(wěn)定期，混合豆乳后，乳酸菌生長(zhǎng)變化程度較小，因此對(duì)終產(chǎn)品后酸化程度影響較小。

圖1 發(fā)酵混合豆乳在貯藏期酸度和pH 的變化

2.2 不同混合發(fā)酵方式的發(fā)酵豆乳貯藏期活菌數(shù)變化

微生物菌株對(duì)酸性環(huán)境和可用底物的耐受性是乳制品中益生菌微生物存活的重要參數(shù)[18]，發(fā)酵混合豆乳樣品的細(xì)菌計(jì)數(shù)以每毫升樣品中菌落形成單位（log cfu/mL）的十進(jìn)制對(duì)數(shù)表示，不同混合發(fā)酵方式對(duì)嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種在貯藏期內(nèi)變化情況如圖2 所示。

圖2 發(fā)酵混合豆乳在貯藏期活菌數(shù)的變化

嗜熱鏈球菌在貯藏期間的變化如圖2（a）所示。貯藏期間，3 種混合方式制備的樣品中嗜熱鏈球菌數(shù)量呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，在同一貯藏時(shí)間，牛乳與豆乳按1.5∶1 比例混合后再發(fā)酵條件下的樣品1 的嗜熱鏈球菌數(shù)量顯著高于單獨(dú)發(fā)酵牛乳，再與豆乳按1.5∶1 比例混合條件下的樣品2 和單獨(dú)發(fā)酵牛乳與豆乳按1.5∶1 比例混合后再發(fā)酵條件下的樣品3（P＜0.5）。說(shuō)明牛乳與豆乳混合后作為發(fā)酵基質(zhì)，更有利于嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)。貯藏30 d 時(shí)，嗜熱鏈球菌數(shù)量≥7.55 log cfu/mL。

德氏乳桿菌保加利亞亞種在貯藏期間的變化如圖2(b)所示。貯藏期間，牛乳與豆乳按1.5∶1 比例混合后再發(fā)酵條件下的樣品1 的保加利亞乳桿菌數(shù)量呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，單獨(dú)發(fā)酵牛乳，再與豆乳按1.5∶1 比例混合條件下的樣品2 和單獨(dú)發(fā)酵牛乳，4 ℃后酸化24 h 后，再與豆乳按1.5∶1 比例混合條件下的樣品3 的保加利亞乳桿菌一直呈下降趨勢(shì)。貯藏后期，3 個(gè)樣品的活菌數(shù)量均減少，是由于混合發(fā)酵豆乳中可利用的碳水化合物逐漸減少，乳酸菌因缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而衰亡[19-20]。在0～7 d 期間，樣品2 和樣品3 的保加利亞乳桿菌數(shù)量高于樣品1。貯藏30 d 時(shí)，保加利亞乳桿菌數(shù)量≥7.08 log cfu/mL。

2.3 不同混合發(fā)酵方式的發(fā)酵豆乳貯藏期黏度和持水力變化

黏度影響發(fā)酵乳的組織狀態(tài)和口感，持水力的高低體現(xiàn)了發(fā)酵乳體系對(duì)水的截留能力，對(duì)發(fā)酵乳的品質(zhì)有較大影響，提高發(fā)酵乳的持水力，會(huì)降低乳清析出率，使產(chǎn)品體系更穩(wěn)定[21-22]。發(fā)酵混合豆乳在貯藏期間的黏度和持水力變化如圖3 所示，牛乳與豆乳按1.5∶1 比例混合后再發(fā)酵方法制備的樣品1 的黏度和持水力顯著高于單獨(dú)發(fā)酵牛乳，再與豆乳按1.5∶1 比例混合方法制備的樣品2 和單獨(dú)發(fā)酵牛乳，4 ℃后酸化24 h 后，再與豆乳按1.5∶1 比例混合方法制備的樣品3（P＜0.5），說(shuō)明牛乳與豆乳混合后作為發(fā)酵基質(zhì)，產(chǎn)品的穩(wěn)定性更好。貯藏期內(nèi)，樣品1 的黏度和持水力呈下降趨勢(shì)，可能是由于該樣品的后酸化程度較大，使產(chǎn)品組織狀態(tài)下降，有少量乳清析出；樣品2 和樣品3 的黏度和持水力呈先上升后下降的趨勢(shì)，貯藏1 d 至7 d 期間，樣品2 和樣品3 的黏度和持水力增加，可能是在這期間，發(fā)酵乳與豆乳混合后動(dòng)植物蛋白之間形成穩(wěn)定體系，提高了樣品的黏度和持水力；15 d 后呈顯著下降趨勢(shì)，可能與交替磷酸鈣的溶解速度和程度有關(guān)[11]。

圖3 發(fā)酵混合豆乳在貯藏期黏度和持水力的變化

2.4 不同混合發(fā)酵方式的發(fā)酵豆乳貯藏期質(zhì)構(gòu)特性

質(zhì)構(gòu)特性是衡量發(fā)酵乳品質(zhì)的重要指標(biāo)，主要包括硬度、咀嚼性、膠黏性和內(nèi)聚性等評(píng)價(jià)指標(biāo)[15]。不同混合發(fā)酵方式的豆乳在貯藏期質(zhì)構(gòu)特性如圖4 所示。在貯藏期間，不同混合發(fā)酵方式的豆乳樣品咀嚼性的變化如圖4（a）所示，3 個(gè)樣品的咀嚼性呈先上升后下降趨勢(shì)，由于樣品1 呈固態(tài)，樣品2 和3 呈半固態(tài)，因此，樣品1 的咀嚼性顯著高于樣品2 和樣品3（P＜0.5）。不同混合發(fā)酵方式的豆乳樣品硬度的變化如圖4（b）所示，3 種混合發(fā)酵方式下的樣品硬度變化趨勢(shì)與咀嚼性相同，與李寧寧[23]研究結(jié)果一致。不同混合發(fā)酵方式的豆乳樣品內(nèi)聚性的變化如圖4（c）所示，貯藏期間，樣品2 和樣品3 的的內(nèi)聚性無(wú)顯著性變化（P＜0.5），樣品1 的內(nèi)聚性在0～15 d 呈下降趨勢(shì)，可能是由于樣品的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中的離子變化[11]。不同混合發(fā)酵方式的豆乳樣品膠黏性的變化如圖4（d）所示，3 種混合發(fā)酵方式的樣品膠黏性呈先下降后平緩的趨勢(shì)，在整個(gè)貯藏期內(nèi)，樣品1 的膠黏性顯著高于樣品2 和樣品3（P＜0.5）。

圖4 發(fā)酵混合豆乳貯藏期的質(zhì)構(gòu)特性

2.5 不同混合發(fā)酵方式的發(fā)酵豆乳貯藏期流變特性

不同混合發(fā)酵方式豆乳的表觀黏度和剪切應(yīng)力在剪切速率為0.1～100 S-1范圍內(nèi)變化的結(jié)果如圖5所示，發(fā)酵混合豆乳樣品隨剪切速率的增加呈現(xiàn)出剪切稀釋的現(xiàn)象，剪切稀釋是指發(fā)酵乳隨剪切速率的增加，表觀黏度降低[15]，豆乳樣品的剪切應(yīng)力隨剪切速率的增加逐漸增大。不同混合發(fā)酵方式對(duì)產(chǎn)品流變特性影響不同。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品1 和樣品3 的表觀黏度逐漸降低，剪切應(yīng)力逐漸減弱；樣品2 的表觀黏度和剪切應(yīng)力呈先增加后下降的趨勢(shì)。

2.6 不同混合發(fā)酵方式的發(fā)酵豆乳貯藏期感官評(píng)分

不同混合發(fā)酵方式的豆乳貯藏期感官評(píng)分如圖6所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)發(fā)酵混合豆乳的感官評(píng)分有較大影響。在0～15 d 期間，樣品2 和樣品3 的感官評(píng)分無(wú)顯著性變化（P＜0.5），30 d 時(shí)，兩樣品的感官評(píng)分下降幅度較大，從圖6（b）和（c）可明顯觀察到，30 d 時(shí)樣品2 和樣品3 的組織狀態(tài)、滋味和氣味大幅下降，30 d 的貯藏時(shí)間，使產(chǎn)品的黏度、持水力和質(zhì)構(gòu)特性不同程度的降低，對(duì)產(chǎn)品感官影響較大。在整個(gè)貯藏期間，樣品1 的感官評(píng)分呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.5），牛乳與豆乳混合后再發(fā)酵方式下的樣品3 具有較強(qiáng)的后酸化能力，由于該發(fā)酵方式所制備的產(chǎn)品達(dá)到所需酸度70 °T 時(shí)，乳酸菌仍活力旺盛，貯藏過(guò)程中，乳酸菌繼續(xù)消耗糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝產(chǎn)酸，使產(chǎn)品酸度提高，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，酸度不斷增加，并伴有乳清析出，產(chǎn)品質(zhì)地變差，使其黏度和持水力下降，感官評(píng)分也隨之降低。

圖6 發(fā)酵混合豆乳貯藏期感官評(píng)分

3 結(jié)論

采用3 種不同混合發(fā)酵方式制備發(fā)酵混合豆乳，分析其對(duì)發(fā)酵混合豆乳貯藏期品質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)發(fā)酵牛乳，4 ℃后酸化24 h 后，再與豆乳按1.5∶1 比例混合方式較牛乳與豆乳按1.5∶1 比例混合后再發(fā)酵方式，可以顯著降低發(fā)酵豆乳的后酸化能力，減少后酸化對(duì)產(chǎn)品組織狀態(tài)及感官評(píng)分產(chǎn)生的影響。在貯藏期間產(chǎn)品的持水力增加了5.57%，無(wú)乳清析出，顏色微黃，色澤明亮，口感爽滑，無(wú)顆粒感，無(wú)豆腥味，具有大豆發(fā)酵制品特有的香氣，具有良好的感官特性。3 種樣品流變特性差異顯著，單獨(dú)發(fā)酵牛乳，4 ℃后酸化24 h 后，再與豆乳按1.5∶1 比例混合樣品，隨著剪切速率的增加，黏彈性顯著高于其他樣品；另外，質(zhì)構(gòu)結(jié)果顯示，硬度和膠黏特性顯著增加，賦予了產(chǎn)品較好的咀嚼性；牛乳和豆乳混合后發(fā)酵和牛乳發(fā)酵后再與豆乳混合方式不能顯著提高樣品的持水能力，有乳清析出。因此，牛乳發(fā)酵結(jié)束4 ℃后酸化24 h 再與豆乳混合后的產(chǎn)品的穩(wěn)定性好，即單獨(dú)發(fā)酵牛乳，4 ℃后酸化24 h 后，再與豆乳按1.5∶1 比例混合方式是保持發(fā)酵豆乳在貯藏期間具有較好穩(wěn)定性和感官品質(zhì)的良好制備方法。